专题18 基因工程 （10大题型）-【题型冲关】备战2025年高考生物一轮复习题型全覆盖（浙江专用）

专题18 基因工程 考点一 基因工程 【题型1】基因工程的概念及原理 【题型2】DNA重组技术 【题型3】目的基因的筛选和获取 【题型4】基因载体的构建 【题型5】目的基因导入受体细胞 【题型6】目的基因的检测和鉴定 【题型7】PCR和凝胶电泳技术 【题型8】蛋白质工程 【题型9】生物技术的伦理和安全 【题型10】基因工程综合应用 考点一 基因工程 01 基因工程的概念及原理 【例1】利用农杆菌转化法将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花细胞获得抗虫棉，可有效减少农药使用，提高棉花产量。下列相关叙述错误的是（　　） A．农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同 B．苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段 C．农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体 D．由该种方法获得的转基因抗虫棉无法将抗虫基因遗传给子代 【变式1-1】培育耐盐碱作物对保障粮食安全具有重要意义。研究人员将野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS转入水稻中，增强了水稻对盐碱的耐受性。下列叙述正确的是（　　） A．GsSAMS基因的转入增加了水稻染色体的数量 B．GsSAMS基因转入水稻后最终定位于核糖体中 C．GsSAMS基因在水稻中使用与大豆不同的遗传密码 D．GsSAMS基因在水稻中成功表达了其编码的蛋白质 【变式1-2】酵母菌中约48%的精氨酸是由密码子AGA编码的，而其余五种编码精氨酸的密码子则以大致相等的较低频率被使用（每种10%左右）。现通过基因改造，采用酵母菌偏好的精氨酸密码子，提高了酵母菌相关蛋白质的表达量。此过程发生的变化是（　　） A．酵母菌的染色体组数量增加 B．相关蛋白质的氨基酸序列和空间结构发生改变 C．转录出的相关mRNA的含量减少 D．相关基因的碱基对序列发生改变 02 DNA重组技术 【例2】基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接。研究人员将相同的基因载体分组并进行相应酶切处理（如表所示），其中限制酶H1和H2识别序列不同。各组基因载体经充分酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的是（    ） 分组 相应酶切处理 甲 限制酶H1 乙 限制酶H2 丙 限制酶H1+H2 A．该基因载体为0．8kb的环状DNA分子 B．限制酶H1与H2在该载体上都有识别和切割位点 C．限制酶H1与H2在该载体上的酶切位点最短相距0．2kb D．0．2kb的核酸片段迁移速率大主要与其分子质量小有关 【变式2-1】某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                    下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【变式2-2】含氨苄青霉素抗性基因（AmpR）的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRI和MfeI分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是（　　） A．可以避免质粒或者目的基因自身环化 B．可以避免目的基因与质粒反向连接 C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因 D．可以避免受体菌的EcoRI和MfeI将重组质粒中的目的基因切割下来 03 目的基因的筛选和获取 【例3】通过PCR扩增可得到含有部分未知序列的DNA片段的扩增产物，具体操作步骤如下图所示，图中白色为未知片段，黑色为已知片段，M、N为限制酶的识别序列，下列相关叙述错误的是（    ） A．已知片段中没有除了M之外的其他限制酶的识别序列 B．将最终的PCR产物进行测序即可知道未知片段的DNA序列 C．该PCR过程中所使用的引物应依据a、b的序列进行设计 D．第一步酶切时可更换限制酶，只要所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在即可 【变式3-1】阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【变式3-2】科研人员制作了某哺乳动物三个组织或细胞的基因组文库和cDNA文库，标号如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．若库A中不含甲状腺激素基因，则库B中含血红蛋白基因 B．若库C中含促甲状腺激素基因，则库D中不含胰岛素基因 C．若库E中不含任何基因，则库F中可能含有很少量的基因 D．库A和库B含有相同的基因，但这些基因的长度一般有差别 04 基因载体的构建 【例4】阅读下列材料，完成下面小题。 癌症是人类健康第一大杀手。癌症患者体内T淋巴细胞产生的抗癌因子IFN-γ会减少，科学家尝试用“细菌疗法”以提高患者体内IFN-γ的含量来治疗癌症。已知Clts基因表达Clts蛋白能抑制启动子P和启动子R，在大于42℃时Clts蛋白失活。用超声诱导可产生短暂热效应，提高温度。具体过程如图所示。    1．关于癌细胞和细菌疗法治疗癌症的特点，下列叙述正确的是（    ） A．细胞发生癌变后，细胞形态结构改变和细胞周期变长 B．癌细胞膜上的糖蛋白减少，导致其在体内分散和转移 C．通过细菌疗法治疗癌症，不可以实现肿瘤的靶向治疗 D．工程细菌通过注射方式进入机体内，可持久发挥效应 2．关于细菌疗法治疗癌症的具体过程，下列叙述错误的是（    ） A．双启动子P和R的作用可能是保证IFN-γ基因的高效转录 B．将受体菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中可提高转化效率 C．能在卡那霉素培养基中生长的是含重组温控质粒的工程细菌 D．机体在37℃条件下产生的Clts蛋白可以阻碍IFN-γ基因的表达 【变式4-1】大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因和lacZ 基因，lacZ 基因编码的产物β半乳糖苷酶能催化无色的Xgal生成蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，目的基因插入 lacZ基因中则菌落呈现白色，该过程称为蓝白斑筛选。下列叙述正确的是（    ） A．蓝白斑筛选属于个体水平上的操作 B．CaCl₂溶液处理的大肠杆菌能吸收周围DNA从而完成转化 C．平板中加入青霉素可以筛选出成功导入重组质粒的大肠杆菌 D．将完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生蓝色斑菌落 【变式4-2】某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B．仅用F2和R1一对引物，即可确定ACTA1基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子 05 目的基因导入受体细胞 【例5】电穿孔法通过将高浓度动物细胞悬液短暂暴露于高压脉冲电流中，外源DNA可经高电压在细胞膜上形成的可复性闭合小孔进入细胞并整合到染色体上，以实现细胞转染。下列叙述正确的是（    ） A．培养动物细胞悬液需要定期添加KCl以维持pH稳定 B．小孔形成后，适当降温可以延长外源DNA分子可进入时间 C．贴壁生长细胞比悬浮生长细胞更适合用电穿孔法进行转染 D．采用高电压和高浓度细胞悬液可提高细胞成活率和转染成功率 【变式5-1】用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体，外植体选择的主要依据是受体细胞的转化能力。下列关于外植体选择和处理的叙述错误的是（    ） A．可优先考虑幼嫩的叶片、子叶、胚轴等分裂旺盛的组织 B．处于M期的细胞比S期的细胞更易被外源基因转化 C．所选的外植体应易于组织培养且有较强的再生能力 D．对外植体的周围切割处理有利于吸引农杆菌并接纳T-DNA片段 【变式5-2】经过十年不懈努力，我国科学家首次从野生玉米中克隆出高蛋白基因Thp9-T，将其导入到我国推广面积最大的玉米生产栽培品种中，可以显著提高蛋白含量，表明该基因在培育高蛋白玉米中具有重要的应用潜能。下列叙述错误的是（    ） A．可通过构建基因文库从野生玉米中获得 Thp9-T基因 B．可对质粒和 Thp9-T基因均用两种限制酶切割以提高重组DNA 分子成功率 C．可通过杂交的方法将 Thp9-T基因导入到栽培玉米中 D．可用核酸分子杂交技术检测转入的目的基因，作为判断转基因成功的直接证据 06 目的基因的检测和鉴定 【例6】双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【变式6-1】基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术，芯片制作和使用过程如图所示： 下列叙述错误的是（    ） A．探针和样品都必须是单链 B．基因芯片上具有多种不同序列的探针 C．探针和样品上都需携带相同的荧光标记 D．洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品 【变式6-2】将某转基因植株（导入了抗除草剂基因G）连续自交后获得后代群体。为检测该群体中含G植株的比例，用4种方法分别进行检测，预测所得结果最低的是（　　） 方法 检测方法 检测对象 检出的含G基因植株的比例 1 PCR扩增 G基因 x1 2 分子杂交 G基因转录产物 x2 3 抗原-抗体杂交 G基因编码的蛋白质 x3 4 喷洒除草剂 幼苗对除草剂的抗性 x4 A．方法1 B．方法2 C．方法3 D．方法4 07 PCR和凝胶电泳技术 【例7】镰刀型细胞贫血症是一种常染色体隐性遗传病，是由正常血红蛋白基因突变为镰刀型细胞贫血症基因引起的，相关片段如下图。对胎儿基因检测的主要原理是：MstII限制酶处理扩增后的DNA；加热使被酶切的DNA片段解旋，用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交；凝胶电泳分离。下列叙述正确的是（    ）    A．PCR扩增时预变性时间较长是为了使模板DNA充分变性 B．需要设计能与血红蛋白基因结合的双链DNA作为PCR引物 C．电泳中需要加入亚甲基蓝作为电泳指示剂 D．若出现3条电泳条带，可判断该个体为杂合子 【变式7-1】某家系甲、乙两种单基因遗传病系谱图如图1所示。控制两病的基因均不在Y染色体上，已死亡个体无法得知性状。图2是对甲病相关基因PCR后用某限制酶处理并电泳的结果。图3所示a、b、c是关于与甲病相关的正常基因的酶切位点，下列相关叙述错误的是（    ） A．仅考虑乙病，图1中II7与II8再生一个正常孩子的概率是1/2 B．结合图1和图2可知，甲病是常染色体显性遗传病 C．结合图2和图3可知，甲病是基因突变后某一酶切位点发生了左移所致 D．对此家族相关患者基因治疗时，可选择修饰后的逆转录病毒作为载体 【变式7-2】东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对 Cd的富集能力，从而有 效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（    ） A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得 B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带 C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列 D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞 08 蛋白质工程 【例8】胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是小肠分泌的激素，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌的功能。内源性 GLP-1 在体内会很快被分解。通过蛋白质工程开发的 GLP-1类似物可作为降血糖药使用。下列叙述正确的是（　　） A．GLP-1的改造方向是易被 GLP-1受体识别 B．先设计多肽的氨基酸序列，再设计基因的碱基序列 C．用限制性内切核酸酶从基因数据库中获取目的基因 D．将含目的基因的克隆载体导入生物反应器生产GLP-1类似物 【变式8-1】科学家利用蛋白质工程研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，赖脯胰岛素经皮下注射后易吸收、起效快。以下相关叙述错误的是（    ） A．代表蛋白质工程操作思路获取赖脯胰岛素的过程是④⑤⑥①②③ B．该技术需在DNA分子水平上进行设计和改造 C．物质a和物质b分别代表多肽链和mRNA D．在基因表达过程中，物质a改变时物质b可能不变 【变式8-2】利用AI（人工智能）破解蛋白质结构和功能之谜，建立蛋白质数据库，并在此基础上进行蛋白质结构设计和优化，会给未来蛋白质工程的发展带来翻天覆地的变化。关于该技术的实施下列说法错误的是（    ） A．用AI预测新型蛋白质的基因结构应依据中心法则原理 B．可以通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质 C．根据设计的某种蛋白质的氨基酸序列推理的基因序列中包含启动子和终止子 D．用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，原因是密码子具有简并性 09 生物技术的伦理和安全 【例9】生物技术是一把双刃剑，在造福人类的同时，也可能为人类和自然带来灾难。下列叙述正确的是（    ） A．转基因技术是安全的，无需进行风险评价 B．我国政府的立场是允许设计试管婴儿 C．我们要合理利用和开发生物武器 D．蛋白质工程是直接改造蛋白质结构来制造新的蛋白质 【变式9-1】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存新个体，下列有关叙述正确的是（　　） A．过程涉及体细胞核移植技术 B．结果可增加相关生物基因多样性 C．最终目的是为了获得新的器官 D．我国法律禁止一切生殖性克隆 【变式9-2】人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟，产生巨大生产力的同时，也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述，合理的是（    ） A．如果有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造 C．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，原因是人体不会对它们产生免疫反应 D．转基因马铃薯培育中，除目的基因外还导入了能使花粉失去活性的基因，从而减少基因污染的发生 10 基因工程综合应用 【例10】植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 【变式10-1】低温是限制农作物生产力的主要非生物胁迫之一，当植物遭遇低温胁迫时，会通过一系列生理响应提高自身的耐低温能力。科学家研究表明，拟南芥的CBFs蛋白含量随冷胁迫时间的延长而增加。科学家猜测CBFs蛋白可能会提高拟南芥的耐低温能力，探究CBFs蛋白能否增加拟南芥的耐低温能力，科学家展开了下列实验。 (1)为保证实验的准确性，实验所用的拟南芥需要选取突变体α，该突变体与野生型拟南芥的显著区别为 。 (2)该突变体α较难获得，可通过射线处理野生型拟南芥，因 仅能获得少量突变体α，再通过植物组织培养技术快速获得大量拟南芥突变体α，在植物组织培养过程中使用的两种关键性植物激素是 ，该技术的理论基础是 。 (3)实验步骤： ①使用 将CBFs蛋白编码序列连接在不同强度的 后，再将其与表达载体进行连接，构建形成不同CBFs表达强度的重组DNA分子。 ② 。 ③ 经过上一步实验操作后获得了低中高三种CBFs蛋白表达量的转基因拟南芥突变体α，随后将拟南芥进行低温耐受实验（4℃），测量一段时间后拟南芥的细胞活力（具体检测方法不作要求）。 ④记录实验结果，请设计一张实验结果记录表。 【变式10-2】研究显示，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞会表达hCGβ蛋白，这与肿瘤的发生及转移可能有一定关系，通过各种生物反应器研发抗hCGβ蛋白已成为近年来肿瘤治疗领域热点问题。某制备抗hCGβ疫苗的流程如图1所示，其中启动子有物种特异性。 注：序列甲（320bp）指导合成的信号肽，能指引翻译后的多肽进入内质网腔；AXO1为甲醇诱导型的真核启动子，有甲醇存在的环境下才会启动表达。 回答下列问题： (1)构建重组载体。图1中获取抗β基因的方法属于 ，将抗β基因与甲序列一起构建形成融合基因，并与线性质粒连接。 (2)大肠杆菌转化。过程Ⅱ将环化质粒导入受体细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的平板，在恒温培养箱中 培养，以利于获得单菌落，筛选分离出含抗β基因的大肠杆菌。 (3)鉴定融合基因。为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成功，提取大肠杆菌的 作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳。在PCR过程中，每一个循环均包括变性、 三个阶段。为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5′端添加 ，电泳时将样品与 混合后加入加样孔。凝胶中加样孔的一端朝向电泳槽的 （正极/负极）。电泳后得到图2所示结果，根据 ，可推测PCR产物的长度，因此可判断 号泳道的样品符合要求。 (4)导入酵母菌。过程Ⅳ—Ⅴ中，将处理后的酵母菌接种于培养基中，该培养基不需要添加的成分有 （A．组氨酸  B．甲醇  C．无机盐  D．琼脂），此培养基上形成的母菌菌落即为目的菌株，此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株的原因是 （答出两点）。 (5)基因表达检测。将酵母菌接种后于 上振荡培养，将培养物离心后分成细胞和培养液两部分，将细胞用缓冲液重新悬浮，并 处理后，再次离心取上清液。用hCGβ蛋白对上清液和之前获得的培养液通过 技术进行检测，若两组均呈阳性，则说明基因在酵母菌中 。 (6)发酵罐生产。为了解发酵罐中酵母菌数量，取5g皮渣加入45mL无菌水中，按照此法，梯度稀释至104倍。取0.1mL稀释液涂布计数，三个平板中菌落数分别为56、62和56，则此时每克皮渣酵母菌数量是 个。 (7)蛋白活性检测。已知DNS在90℃以上可与还原糖发生显色反应，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，β-酶复合体蛋白与抗β蛋白结合后会遮盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能。向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，立刻沸水浴处理2min，此时沸水浴的目的是 。随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性。颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越 。β-酶复合体需要在低温下保存，原因是 。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题18 基因工程 考点一 基因工程 【题型1】基因工程的概念及原理 【题型2】DNA重组技术 【题型3】目的基因的筛选和获取 【题型4】基因载体的构建 【题型5】目的基因导入受体细胞 【题型6】目的基因的检测和鉴定 【题型7】PCR和凝胶电泳技术 【题型8】蛋白质工程 【题型9】生物技术的伦理和安全 【题型10】基因工程综合应用 考点一 基因工程 01 基因工程的概念及原理 【例1】利用农杆菌转化法将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花细胞获得抗虫棉，可有效减少农药使用，提高棉花产量。下列相关叙述错误的是（　　） A．农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同 B．苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段 C．农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体 D．由该种方法获得的转基因抗虫棉无法将抗虫基因遗传给子代 【答案】D 【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】A、农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同，均是基因重组，A正确； B、苏云金杆菌和棉花的遗传物质均是DNA，故苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段，B正确； C、农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体，Ti质粒上的T-DNA可以将目的基因转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，C正确； D、农杆菌转化法将Bt基因插入到转基因抗虫棉的染色体DNA中，所以转基因抗虫棉体内的Bt抗虫基因可以通过有性生殖遗传给子代，D错误。 故选D。 【变式1-1】培育耐盐碱作物对保障粮食安全具有重要意义。研究人员将野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS转入水稻中，增强了水稻对盐碱的耐受性。下列叙述正确的是（　　） A．GsSAMS基因的转入增加了水稻染色体的数量 B．GsSAMS基因转入水稻后最终定位于核糖体中 C．GsSAMS基因在水稻中使用与大豆不同的遗传密码 D．GsSAMS基因在水稻中成功表达了其编码的蛋白质 【答案】D 【分析】1．遗传的控制中心是细胞核。 2．转基因技术是把一种生物的某个基因，用生物技术的方法转入到另一种生物的基因组中，培育出转基因生物，就可能表现出转基因所控制的性状。 【详解】A、基因位于染色体上，在染色体上呈线性排列，GsSAMS基因的转入不会增加水稻染色体的数量，A错误； B、核糖体是由蛋白质和RNA组成，GsSAMS基因的本质是DNA片段，GsSAMS基因转入水稻后最终不会定位于核糖体中，B错误； C、所有生物共用一套遗传密码，GsSAMS基因在水稻中使用与大豆相同的遗传密码，C错误； D、由“将野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS转入水稻中，增强了水稻对盐碱的耐受性”可知，性状的直接体现者是蛋白质，所以GsSAMS基因在水稻中成功表达了其编码的蛋白质，D正确。 故选D。 【变式1-2】酵母菌中约48%的精氨酸是由密码子AGA编码的，而其余五种编码精氨酸的密码子则以大致相等的较低频率被使用（每种10%左右）。现通过基因改造，采用酵母菌偏好的精氨酸密码子，提高了酵母菌相关蛋白质的表达量。此过程发生的变化是（　　） A．酵母菌的染色体组数量增加 B．相关蛋白质的氨基酸序列和空间结构发生改变 C．转录出的相关mRNA的含量减少 D．相关基因的碱基对序列发生改变 【答案】D 【分析】基因突变不一定会引起性状改变：多数基因突变并不引起生物性状的改变：①由于密码子具有简并性，可有多种密码子决定同一种氨基酸，因此某些基因突变也不会引起生物性状的改变。例如，UUU和UUG都是苯丙氨酸的密码子。当第三位的U和G相互置换时，不会改变密码子的功能。②突变发生在非编码区（内含子中）。③突变为隐性突变。④突变发生在体细胞中，生殖细胞中不一定出现该基因。⑤性状表现是遗传和环境因素共同作用的结果，在某些环境条件下，改变了的基因可能并不会在性状上表现出来等。 【详解】A、依题意，通过基因改造，采用酵母菌偏好的精氨酸密码子，以提高了酵母菌相关蛋白质的表达量。该过程改造的是个别基因，不改变酵母菌的染色体数目 ，A不符合题意； B、题中6种密码子都编码精氨酸，通过基因改造，采用酵母菌偏好的精氨酸密码子，不改变相关蛋白质的氨基酸序列 。因此，相关蛋白质的氨基酸序列和空间结构都未发生改变，B不符合题意； C、提高了酵母菌相关蛋白质的表达量，转录出的相关 mRNA 的含量会增加，C不符合题意； D、通过基因改造，采用酵母菌偏好的精氨酸密码子，即改变了mRNA中的密码子种类，则相关基因的碱基对序列对应发生改变 ，D符合题意。 故选D。 02 DNA重组技术 【例2】基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接。研究人员将相同的基因载体分组并进行相应酶切处理（如表所示），其中限制酶H1和H2识别序列不同。各组基因载体经充分酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的是（    ） 分组 相应酶切处理 甲 限制酶H1 乙 限制酶H2 丙 限制酶H1+H2 A．该基因载体为0．8kb的环状DNA分子 B．限制酶H1与H2在该载体上都有识别和切割位点 C．限制酶H1与H2在该载体上的酶切位点最短相距0．2kb D．0．2kb的核酸片段迁移速率大主要与其分子质量小有关 【答案】A 【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。 【详解】A、由图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，且长度为0.8kb，因此该载体最有可能为0.8kb或0.8kb倍数的环状DNA分子，A错误； B、当用一种限制酶切割载体时，产生的DNA片段等长，而用两种限制酶同时切割时，产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在该载体上都有酶切位点，B正确； C、用两种限制酶同时切割载体时，产生0.6kb和0.2kb两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距0.2kb，C正确； D、凝胶电泳迁移率与所带的电荷多少以及分子大小都有关，电荷越多跑得越快，分子越小跑得越快，D正确。 故选A。 【变式2-1】某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。                    下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 【答案】C 【分析】DNA连接酶： （1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。 （2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误； B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误； C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确； D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 故选C。 【变式2-2】含氨苄青霉素抗性基因（AmpR）的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRI和MfeI分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是（　　） A．可以避免质粒或者目的基因自身环化 B．可以避免目的基因与质粒反向连接 C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因 D．可以避免受体菌的EcoRI和MfeI将重组质粒中的目的基因切割下来 【答案】D 【分析】从酶切位点示意图可以看出，两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，这两种酶为“同尾酶”。故不能避免质粒或者目的基因自身环化，不能避免目的基因与质粒反向连接，也不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因。 【详解】AB、两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免质粒或者目的基因自身环化，也不能避免目的基因与质粒反向连接，AB错误； C、两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因，C错误； D、若质粒EcoRI酶切位点处与目的基因MfeI酶切处连接，质粒MfeI酶切位点处与目的基因EcoRI酶切处连接，则正好将目的基因正向连接，这样的重组质粒，既无EcoRI识别位点，又无MfeI识别位点，相当于将基因“焊死”在质粒上，故可以避免受体菌的EcoRI和MfeI将重组质粒中的目的基因切割下来，D正确。 故选D。 03 目的基因的筛选和获取 【例3】通过PCR扩增可得到含有部分未知序列的DNA片段的扩增产物，具体操作步骤如下图所示，图中白色为未知片段，黑色为已知片段，M、N为限制酶的识别序列，下列相关叙述错误的是（    ） A．已知片段中没有除了M之外的其他限制酶的识别序列 B．将最终的PCR产物进行测序即可知道未知片段的DNA序列 C．该PCR过程中所使用的引物应依据a、b的序列进行设计 D．第一步酶切时可更换限制酶，只要所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在即可 【答案】D 【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。酶切时用限制酶，环化时用DNA连接酶，再用引物和DNA聚合酶扩增。在环化后，通过一对方向相反的引物实现已知序列两侧基因序列的扩增。 【详解】A、在酶切阶段，已知片段中不能含有酶切时所选限制酶之外的识别序列，不然会将已知片段中切断，造成序列识别混乱，A正确； B、PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，因此将最终的PCR产物进行测序即可知道未知片段的DNA序列，B正确； C、PCR过程需要两种引物，为保证延伸的是序列N两侧的未知序列，应依据a、b的序列进行设计，C正确； D、第一步酶切时可更换限制酶，所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在，还要能够产生相同的黏性末端，D错误。 故选D。 【变式3-1】阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【答案】1．D 2．B 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 1．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 2．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 故选B。 【变式3-2】科研人员制作了某哺乳动物三个组织或细胞的基因组文库和cDNA文库，标号如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．若库A中不含甲状腺激素基因，则库B中含血红蛋白基因 B．若库C中含促甲状腺激素基因，则库D中不含胰岛素基因 C．若库E中不含任何基因，则库F中可能含有很少量的基因 D．库A和库B含有相同的基因，但这些基因的长度一般有差别 【答案】B 【分析】基因组文库含有生物的全部基因，而cDNA文库含有生物的部分基因。 【详解】A、该腺体为胰岛，若库A中不含甲状腺激素基因，说明库A表示cDNA文库，则库B为基因组文库，则库B中含血红蛋白基因，A正确； B、垂体可以分泌促甲状腺激素，所以若库C中含促甲状腺激素基因，则库C可能是cDNA文库，也可能是基因组文库，库D中含不含胰岛素基因无法确定，B错误； C、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，由于基因组文库的范围一般比cDNA大，所以若库E中不含任何基因，则库E为cDNA文库，库F为基因组文库，可能含有很少量的基因，C正确； D、根据cDNA文库的建立过程，其基因中不含有内含子，而基因组文库中虽然有与cDNA文库相同的基因，但是其基因中含有内含子，所以，这些基因的长度一般有差别，D正确。 故选B。 04 基因载体的构建 【例4】阅读下列材料，完成下面小题。 癌症是人类健康第一大杀手。癌症患者体内T淋巴细胞产生的抗癌因子IFN-γ会减少，科学家尝试用“细菌疗法”以提高患者体内IFN-γ的含量来治疗癌症。已知Clts基因表达Clts蛋白能抑制启动子P和启动子R，在大于42℃时Clts蛋白失活。用超声诱导可产生短暂热效应，提高温度。具体过程如图所示。    1．关于癌细胞和细菌疗法治疗癌症的特点，下列叙述正确的是（    ） A．细胞发生癌变后，细胞形态结构改变和细胞周期变长 B．癌细胞膜上的糖蛋白减少，导致其在体内分散和转移 C．通过细菌疗法治疗癌症，不可以实现肿瘤的靶向治疗 D．工程细菌通过注射方式进入机体内，可持久发挥效应 2．关于细菌疗法治疗癌症的具体过程，下列叙述错误的是（    ） A．双启动子P和R的作用可能是保证IFN-γ基因的高效转录 B．将受体菌放于低温、低浓度的CaCl2溶液中可提高转化效率 C．能在卡那霉素培养基中生长的是含重组温控质粒的工程细菌 D．机体在37℃条件下产生的Clts蛋白可以阻碍IFN-γ基因的表达 【答案】1．B 2．C 【分析】启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一 段有特殊序列结构的DNA片段。 1．A、细胞发生癌变后，能无限增殖，细胞形态结构改变和细胞周期变短，A错误； B、糖蛋白能增加细胞之间的黏附性，癌细胞膜上的糖蛋白减少，导致其在体内分散和转移，B正确； C、细菌在侵染宿主细胞具有专一性，因此采用“细菌疗法”治疗癌症能实现肿瘤的靶向治疗，对正常细胞伤害小，C错误； D、工程菌发挥作用后会被机体免疫系统清除，不能持久发挥效应，D错误。 故选B。 2．A、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是转录的起始位点，双启动子P和R的作用可能是保证IFN-γ基因的高效转录，A正确； B、低温、低浓度的CaCl2溶液中处理受体菌，可使受体菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，可提高转化效率，B正确； C、据题意可知，插入目的基因不会破坏标记基因（氨苄青霉素抗性基因），因此重组质粒和非重组质粒都能在氨苄青霉素培养基中生长，C错误； D、Clts基因表达Clts蛋白能抑制启动子P、R，在大于42℃时 Clts蛋白失活，因此37℃条件下产生 Clts蛋白可以阻碍IFN-γ基因的表达，D正确。 故选C。 【变式4-1】大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因和lacZ 基因，lacZ 基因编码的产物β半乳糖苷酶能催化无色的Xgal生成蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，目的基因插入 lacZ基因中则菌落呈现白色，该过程称为蓝白斑筛选。下列叙述正确的是（    ） A．蓝白斑筛选属于个体水平上的操作 B．CaCl₂溶液处理的大肠杆菌能吸收周围DNA从而完成转化 C．平板中加入青霉素可以筛选出成功导入重组质粒的大肠杆菌 D．将完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生蓝色斑菌落 【答案】B 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 【详解】A、根据题意可知，蓝白斑筛选是通过菌落呈现的颜色进行筛选，因此不属于个体水平的筛选，而属于种群水平的筛选，A错误； B、转化过程中，大肠杆菌通常用CaCl2溶液处理，使其处于能吸收周围DNA的状态，从而完成转化，B正确； C、依题意，大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因，平板中加入青霉素筛选出来的菌可能是含有带目的基因的重组质粒的菌，也可能是只含大肠杆菌质粒的菌，C错误； D、完成转化的菌是带有目的基因的菌，目的基因的插入破坏了lacZ 基因，因此，完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生白色斑菌落，D错误。 故选B。 【变式4-2】某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B．仅用F2和R1一对引物，即可确定ACTA1基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子 【答案】C 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】A、据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确； B、据图可知，引物F2与R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列，因此推测为了确定ACTA1基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1，B正确； C、ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，二者部分序列相同，C错误； D、若用引物F2和R2进行PCR，可根据电泳条带数目能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子，D正确。 故选C。 05 目的基因导入受体细胞 【例5】电穿孔法通过将高浓度动物细胞悬液短暂暴露于高压脉冲电流中，外源DNA可经高电压在细胞膜上形成的可复性闭合小孔进入细胞并整合到染色体上，以实现细胞转染。下列叙述正确的是（    ） A．培养动物细胞悬液需要定期添加KCl以维持pH稳定 B．小孔形成后，适当降温可以延长外源DNA分子可进入时间 C．贴壁生长细胞比悬浮生长细胞更适合用电穿孔法进行转染 D．采用高电压和高浓度细胞悬液可提高细胞成活率和转染成功率 【答案】B 【分析】动物细胞培养条件 (1)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 (2)营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常还需加入血清、血浆等天然成分。 (3)温度：哺乳动物最适温度多是36.5℃±0.5℃；最适pH是7.2～7.4。 (4)气体环境：95%空气＋5%CO2，其中O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 【详解】A、培养动物细胞悬液需要定期提供CO2以维持pH稳定，KCl也没有涉及到氢离子，A错误； B、小孔形成后，适当降温可以降低细胞膜的流动性，延长外源DNA分子可进入时间，B正确； C、电穿孔法通过将高浓度动物细胞悬液短暂暴露于高压脉冲电流中，所以悬浮生长细胞比贴壁生长细胞更适合用电穿孔法进行转染，C错误； D、高电压会导致大部分细胞坏死，采用高浓度细胞悬液可提高转染成功率，D错误。 故选B。 【变式5-1】用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体，外植体选择的主要依据是受体细胞的转化能力。下列关于外植体选择和处理的叙述错误的是（    ） A．可优先考虑幼嫩的叶片、子叶、胚轴等分裂旺盛的组织 B．处于M期的细胞比S期的细胞更易被外源基因转化 C．所选的外植体应易于组织培养且有较强的再生能力 D．对外植体的周围切割处理有利于吸引农杆菌并接纳T-DNA片段 【答案】B 【分析】农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞，农杆菌在自然条件下，不容易感染单子叶植物，农杆菌侵染植物，能够将将目的基因插入植物细胞的染色体上。 【详解】A、幼嫩的叶片、子叶、胚轴等分裂旺盛的组织作为外植体更容易再生成转基因植株，A正确； B、M期细胞基因位于高度螺旋化的染色体上，相比S期的细胞外源基因难以插入完成转化，B错误； C、为了获得转基因植株，所选择的外植体应易于组织培养且有较强的再生能力，C正确； D、经切割处理的外植体分泌大量的酚类化合物，从而有利于吸引农杆菌并接纳T-DNA片段，D正确。 故选B。 【变式5-2】经过十年不懈努力，我国科学家首次从野生玉米中克隆出高蛋白基因Thp9-T，将其导入到我国推广面积最大的玉米生产栽培品种中，可以显著提高蛋白含量，表明该基因在培育高蛋白玉米中具有重要的应用潜能。下列叙述错误的是（    ） A．可通过构建基因文库从野生玉米中获得 Thp9-T基因 B．可对质粒和 Thp9-T基因均用两种限制酶切割以提高重组DNA 分子成功率 C．可通过杂交的方法将 Thp9-T基因导入到栽培玉米中 D．可用核酸分子杂交技术检测转入的目的基因，作为判断转基因成功的直接证据 【答案】D 【分析】1、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等； 2、核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一． 基因诊断技术它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交．这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行．因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。 【详解】A、高蛋白基因Thp9-T是目的基因，可以通过构建基因文库从野生玉米中获得Thp9-T基因，A正确； B、质粒和Thp9-T基因均用两种限制酶来切割，可防止目的基因和质粒自身环化及目的基因与质粒反向连接，提高重组DNA分子成功率，B正确； C、可通过杂交的方法将Thp9-T基因导入到栽培玉米中并与栽培玉米的染色体上的DNA整合到一起，C正确； D、利用核酸分子杂交技术可检测目的基因的存在和转录，但转基因成功的直接证据是观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传，D错误。 故选D。 06 目的基因的检测和鉴定 【例6】双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（　　） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选B。 【变式6-1】基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术，芯片制作和使用过程如图所示： 下列叙述错误的是（    ） A．探针和样品都必须是单链 B．基因芯片上具有多种不同序列的探针 C．探针和样品上都需携带相同的荧光标记 D．洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品 【答案】C 【分析】基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。 【详解】AC、基因芯片是利用核酸分子杂交原理进行基因检测的，因此探针和样品都必须是单链，同时应该在样品上放置荧光标记的探针，从而才能通过是否出现荧光来判定是否有特定序列，A正确，C错误； B、基因芯片的测序原理是杂交测序方法，基因芯片可以放置多种探针，检测多种不同序列，B正确； D、样品和探针的杂交后，需要将未结合的样品去除，避免影响信号检测，D正确。 故选C。 【变式6-2】将某转基因植株（导入了抗除草剂基因G）连续自交后获得后代群体。为检测该群体中含G植株的比例，用4种方法分别进行检测，预测所得结果最低的是（　　） 方法 检测方法 检测对象 检出的含G基因植株的比例 1 PCR扩增 G基因 x1 2 分子杂交 G基因转录产物 x2 3 抗原-抗体杂交 G基因编码的蛋白质 x3 4 喷洒除草剂 幼苗对除草剂的抗性 x4 A．方法1 B．方法2 C．方法3 D．方法4 【答案】D 【分析】检测目的基因是否导入和转录用PCR技术，检测目的基因是否翻译用抗原-抗体杂交技术。 【详解】PCR扩增技术可以在体外大量增殖目的基因，含量较多；导入到受体细胞中的目的基因不一定完成转录，则利用分子杂交检测目的基因转录产物，含量不一定多；导入到受体细胞中的目的基因不一定完成表达，则利用抗原-抗体杂交检测目的基因翻译产物，含量不一定多；将目的基因（抗除草剂基因）导入受体细胞的概率较小，则喷洒除草剂检测幼苗，其中抗除草剂幼苗出现的概率较低，故D项检出的含目的基因植株的比例最小。 故选D。 07 PCR和凝胶电泳技术 【例7】镰刀型细胞贫血症是一种常染色体隐性遗传病，是由正常血红蛋白基因突变为镰刀型细胞贫血症基因引起的，相关片段如下图。对胎儿基因检测的主要原理是：MstII限制酶处理扩增后的DNA；加热使被酶切的DNA片段解旋，用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交；凝胶电泳分离。下列叙述正确的是（    ）    A．PCR扩增时预变性时间较长是为了使模板DNA充分变性 B．需要设计能与血红蛋白基因结合的双链DNA作为PCR引物 C．电泳中需要加入亚甲基蓝作为电泳指示剂 D．若出现3条电泳条带，可判断该个体为杂合子 【答案】A 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的； 2、图为正常人和患者血红蛋白基因的部分片段，可见镰刀形细胞贫血症是碱基对发生替换导致的，碱基发生改变后，中间位置的MstII限制酶切割位点消失，即致病基因中MstII限制酶切割位点减少了一个。 【详解】A、预变性是破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，A正确； B、 PCR技术要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物，并且引物为单链，B错误； C、 在蛋白质电泳中，亚甲基蓝被用作染色剂，可以将蛋白质染成蓝色，而不是作为电泳指示剂，C错误； D、由图可知，HbA片段有MstII限制酶三个酶切位点，Hbs片段有MstII限制酶2个酶切位点，因此MstII限制酶切割后出现3条电泳条带不一定是杂合子，也可能是HbAHbA，D错误。 故选A。 【变式7-1】某家系甲、乙两种单基因遗传病系谱图如图1所示。控制两病的基因均不在Y染色体上，已死亡个体无法得知性状。图2是对甲病相关基因PCR后用某限制酶处理并电泳的结果。图3所示a、b、c是关于与甲病相关的正常基因的酶切位点，下列相关叙述错误的是（    ） A．仅考虑乙病，图1中II7与II8再生一个正常孩子的概率是1/2 B．结合图1和图2可知，甲病是常染色体显性遗传病 C．结合图2和图3可知，甲病是基因突变后某一酶切位点发生了左移所致 D．对此家族相关患者基因治疗时，可选择修饰后的逆转录病毒作为载体 【答案】B 【分析】由图1可知，Ⅱ3和Ⅱ4不患乙病，Ⅲ10患乙病，根据“无中生有”为隐性，隐性遗传看女患，父子无病可知，乙病为常染色体隐性遗传病。由图2可知，正常健康男女电泳结果是第1、4条带谱，第2、3条带谱是致病基因带谱，若控制该病的基因是显性基因（用A表示），假设位于常染色体上，Ⅱ6的基因型是AA，其父亲Ⅱ2基因型是aa，不合题意；假设位于X染色体上，Ⅱ6的基因型是XAY，其父亲Ⅱ2基因型是XaY，符合题意。若控制该病的基因是隐性基因，Ⅱ4的基因型是aa或XaXa，不符合图2带谱分布，故甲病是位于X染色体上的显性遗传病。 【详解】A、由图1可知，Ⅱ3和Ⅱ4不患乙病，Ⅲ10患乙病，根据“无中生有”为隐性，隐性遗传看女患，父子无病可知，乙病为常染色体隐性遗传病；假设乙病用B/b表示，则Ⅰ2、II8和Ⅲ10基因型为bb，Ⅱ4基因型为Bb，Ⅰ2（bb）和Ⅰ1可知II7基因型为Bb，仅考虑乙病，图1中II7与II8再生一个正常孩子的概率是1/2，A正确； B、由图2可知，正常健康男女电泳结果是第1、4条带谱，第2、3条带谱是致病基因带谱，若控制该病的基因是显性基因（用A表示），假设位于常染色体上，Ⅱ6的基因型是AA，其父亲Ⅱ2基因型是aa，不合题意；假设位于X染色体上，Ⅱ6的基因型是XAY，其父亲Ⅱ2基因型是XaY，符合题意。若控制该病的基因是隐性基因，Ⅱ4的基因型是aa或XaXa，不符合图2带谱分布，故甲病是位于X染色体上的显性遗传病，B错误； C、不管电泳放样点在上端还是下端，正常基因被酶切成一长一短，分子量相差较大，而病变基因经酶切后电泳条带位于正常电泳条带之间，分子量相差较小，说明致病基因的限制酶的切割位点移往原基因切割长的片段，结合图2和图3可知，甲病是基因突变后某一酶切位点发生了左移所致，C正确； D、逆转录病毒是最早应用于基因治疗的一类载体，逆转录病毒可以把目的基因随机整合到宿主基因组，对此家族相关患者基因治疗时，可选择修饰后的逆转录病毒作为载体，D正确。 故选B。 【变式7-2】东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对 Cd的富集能力，从而有 效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（    ） A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得 B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带 C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列 D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误； B、 用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误； C、构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确； D、用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或不含重组质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误 。 故选C。 08 蛋白质工程 【例8】胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是小肠分泌的激素，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌的功能。内源性 GLP-1 在体内会很快被分解。通过蛋白质工程开发的 GLP-1类似物可作为降血糖药使用。下列叙述正确的是（　　） A．GLP-1的改造方向是易被 GLP-1受体识别 B．先设计多肽的氨基酸序列，再设计基因的碱基序列 C．用限制性内切核酸酶从基因数据库中获取目的基因 D．将含目的基因的克隆载体导入生物反应器生产GLP-1类似物 【答案】B 【分析】激素通过体液运输，具有微量、高效、作用于靶细胞或靶器官的特点。由题意可知， GLP-1可抑制胰高血糖素分泌，有降低血糖、减肥等作用，而胰高血糖素作用为升血糖，二者为拮抗作用。 【详解】A、内源性 GLP-1 在体内会很快被分解，因此GLP-1的改造方向是不易被分解，A错误； B、蛋白质工程基本思路是:从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因，获得所需要的蛋白质，B正确； C、可通过检索列数据库获取其编码序列，最后再用化学合成法制备，C错误； D、用生物反应器生产药物蛋白，需将目的基因与所用生物反应器（如乳腺）的蛋白基因相关调控组件重组在一起，将目的基因导入到受精卵中，D错误。 故选B。 【变式8-1】科学家利用蛋白质工程研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，赖脯胰岛素经皮下注射后易吸收、起效快。以下相关叙述错误的是（    ） A．代表蛋白质工程操作思路获取赖脯胰岛素的过程是④⑤⑥①②③ B．该技术需在DNA分子水平上进行设计和改造 C．物质a和物质b分别代表多肽链和mRNA D．在基因表达过程中，物质a改变时物质b可能不变 【答案】C 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。 【详解】A、蛋白质工程的思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，即图中④⑤⑥①②③过程，A正确； B、该技术是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，该技术需在DNA分子水平上进行设计和改造，B正确； C、物质a和物质b分别代表mRNA和多肽链，C错误； D、a（mRNA）序列改变，由于密码子的简并性，最终编码的氨基酸序列可能不变，D正确。 故选C。 【变式8-2】利用AI（人工智能）破解蛋白质结构和功能之谜，建立蛋白质数据库，并在此基础上进行蛋白质结构设计和优化，会给未来蛋白质工程的发展带来翻天覆地的变化。关于该技术的实施下列说法错误的是（    ） A．用AI预测新型蛋白质的基因结构应依据中心法则原理 B．可以通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质 C．根据设计的某种蛋白质的氨基酸序列推理的基因序列中包含启动子和终止子 D．用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，原因是密码子具有简并性 【答案】C 【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，蛋白质工程能对现有的蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质；而基因工程原则上能生产自然界已有的蛋白质。 2、蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【详解】A、用AI预测新型蛋白质的基因结构依据的原理是中心法则，从蛋白质结构反推出氨基酸序列，再反推出相应基因序列，A正确； B、对蛋白质的改造是通过改造或合成基因来完成的，B正确； C、启动子和终止子为非编码区，故由氨基酸序列推理的基因序列中不包含启动子和终止子，C错误； D、因为一种氨基酸可能对应多种密码子（简并性），故用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，D正确。 故选C。 09 生物技术的伦理和安全 【例9】生物技术是一把双刃剑，在造福人类的同时，也可能为人类和自然带来灾难。下列叙述正确的是（    ） A．转基因技术是安全的，无需进行风险评价 B．我国政府的立场是允许设计试管婴儿 C．我们要合理利用和开发生物武器 D．蛋白质工程是直接改造蛋白质结构来制造新的蛋白质 【答案】B 【分析】1、1998年6月27日，中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合声明中，重申在任何情况下不发展、不生产、不 储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散 【详解】A、到现在为止还没有足够的科学手段去评估转基因生物及食品的风险，如含有抗虫害基因的食品是否会威胁人类健康，转基因产品对环境的影响，转基因产品是否会破坏生物多样性，转基因对生物个体的影响，转基因产品带来的伦理问题等等，A错误； B、设计试管婴儿技术必须获得政府部门的相关批准，以防该技术滥用，所以我国政府的立场是允许设计试管婴儿，B正确； C、1998年6月27日，中美两国元首在关于《禁止生物武器公约》议定书的联合声明中，重申在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，所以不允许利用和开发生物武器，C错误； D、蛋白质工程是改造基因来制造新的蛋白质，D错误。 故选B。 【变式9-1】生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存新个体，下列有关叙述正确的是（　　） A．过程涉及体细胞核移植技术 B．结果可增加相关生物基因多样性 C．最终目的是为了获得新的器官 D．我国法律禁止一切生殖性克隆 【答案】A 【分析】生殖性克隆就是以产生新个体为目的克隆，即用生殖技术制造完整的克隆人，目的是产生一个独立生存的个体。于此相对的是研究性克隆或医学性克隆，指的是产生研究所用的克隆细胞，不产生可独立生存的个体。 【详解】A、生殖性克隆就是以产生新个体为目的克隆，该过程都涉及体细胞核移植技术，A正确； B、生殖性克隆属于无性繁殖，不能增加相关生物基因多样性，B错误； C、生殖性克隆最终目的是为了获得新的个体，C错误； D、我国允许生殖性克隆动物，但禁止生殖性克隆人，D错误。 故选A。 【变式9-2】人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟，产生巨大生产力的同时，也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述，合理的是（    ） A．如果有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造 C．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，原因是人体不会对它们产生免疫反应 D．转基因马铃薯培育中，除目的基因外还导入了能使花粉失去活性的基因，从而减少基因污染的发生 【答案】D 【分析】转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评估，符合相应标准后才能上市。 【详解】A、转基因技术本身是中性的，如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止产品的使用，不应该禁止转基因技术的应用，A错误； B、试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断，不涉及基因改造，B错误； C、转基因技术制造的新型致病菌，致病能力和传染能力以及抗药能力等大幅度增加，因而导致具有极大的危害性，C错误； D、转基因马铃薯培育中，除目的基因外还导入了能使花粉失去活性的基因，例如α-淀粉酶基因，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而减少基因污染的发生，D正确。 故选D。 10 基因工程综合应用 【例10】植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下： 筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X 回答下列问题： (1)获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为 ，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行 获得分散的单细胞。 (2)对分离获得的单细胞进行 培养，并通过添加 或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了 的胁迫。 (3)在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图 （填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。 (4)多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过 培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的 和 的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用 工程生产植物的次生代谢产物。 【答案】(1) 外植体 过滤 (2) 克隆 DNA合成抑制剂 微生物侵害 (3) 丙 先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X (4) 器官 代谢途径 关键酶 发酵 【分析】1、植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。2、植物组织培养的条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如适宜温度、适时的光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】（1）植物体的器官和组织、细胞都可以作为外植体，经脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 （2）分离获得的单细胞进行克隆培养，并通过添加DNA合成抑制剂，处于S期的细胞立刻被抑制，洗去TdR后可恢复正常分裂，而处于其它时期的细胞不受过量TdR影响）或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，模拟了微生物侵害的迫害条件。 （3）由题可知X只在细胞生长停止后才能合成，所以丙图符合。所以要获得大量X的方法，是先培养大量细胞，改变条件使细胞停止生长，大量产生X。 （4）由题知，多种次生代谢产物在根部合成与积累，所以要对根进行培养，为了方便进行次生代谢物的收集，可以通过器官培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。要大量获得次生代谢物可以通过基因工程，将相关基因转入酵母菌体内，然后通过发酵工程获得，基因工程的前提是要了解生物体合成某次生代谢产物的代谢途径和关键酶。 【变式10-1】低温是限制农作物生产力的主要非生物胁迫之一，当植物遭遇低温胁迫时，会通过一系列生理响应提高自身的耐低温能力。科学家研究表明，拟南芥的CBFs蛋白含量随冷胁迫时间的延长而增加。科学家猜测CBFs蛋白可能会提高拟南芥的耐低温能力，探究CBFs蛋白能否增加拟南芥的耐低温能力，科学家展开了下列实验。 (1)为保证实验的准确性，实验所用的拟南芥需要选取突变体α，该突变体与野生型拟南芥的显著区别为 。 (2)该突变体α较难获得，可通过射线处理野生型拟南芥，因 仅能获得少量突变体α，再通过植物组织培养技术快速获得大量拟南芥突变体α，在植物组织培养过程中使用的两种关键性植物激素是 ，该技术的理论基础是 。 (3)实验步骤： ①使用 将CBFs蛋白编码序列连接在不同强度的 后，再将其与表达载体进行连接，构建形成不同CBFs表达强度的重组DNA分子。 ② 。 ③ 经过上一步实验操作后获得了低中高三种CBFs蛋白表达量的转基因拟南芥突变体α，随后将拟南芥进行低温耐受实验（4℃），测量一段时间后拟南芥的细胞活力（具体检测方法不作要求）。 ④记录实验结果，请设计一张实验结果记录表。 【答案】(1)二者的遗传信息不同 (2) 基因突变的频率低 生长素和细胞分裂素 植物细胞的全能性 (3) DNA连接酶 启动子 将构建好的基因表达载体导入受体细胞 处理方式 CBFs蛋白表达量 拟南芥的细胞活力 野生型拟南芥 低温处理4℃ 高表达拟南芥突变体 低温处理4℃ 中表达拟南芥突变体 低温处理4℃ 低表达拟南芥突变体 低温处理4℃ 【分析】基因表达载体的结构：启动子：是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动RNA转录；终止子：使转录停止的“信号灯”；标记基因：便于重组DNA分子的筛选；目的基因；复制原点。 【详解】（1）突变体是发生基因突变后获得的，基因突变之后遗传信息发生改变 （2）基因突变具有低频性，所以获得的突变体较少，在组织培养过程中依据的原理是植物细胞的全能性，在此过程中，起关键作用的是生长素和细胞分裂素，二者的含量和比例是细胞脱分化和再分化的关键。 （3）将CBFs蛋白编码序列连的是DNA连接酶，通过形成磷酸二酯键将二者进行连接，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，因此CBFs蛋白基因可以结合在启动子上，调控CBFs蛋白基因的转录过程从而影响基因的表达。构建好的基因表达载体需要导入受体细胞中去。实验的自变量是低中高三种CBFs蛋白表达量的转基因拟南芥突变体α，因变量是CBFs蛋白表达量和拟南芥的细胞活力，设计表格如下： 【变式10-2】研究显示，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞会表达hCGβ蛋白，这与肿瘤的发生及转移可能有一定关系，通过各种生物反应器研发抗hCGβ蛋白已成为近年来肿瘤治疗领域热点问题。某制备抗hCGβ疫苗的流程如图1所示，其中启动子有物种特异性。 注：序列甲（320bp）指导合成的信号肽，能指引翻译后的多肽进入内质网腔；AXO1为甲醇诱导型的真核启动子，有甲醇存在的环境下才会启动表达。 回答下列问题： (1)构建重组载体。图1中获取抗β基因的方法属于 ，将抗β基因与甲序列一起构建形成融合基因，并与线性质粒连接。 (2)大肠杆菌转化。过程Ⅱ将环化质粒导入受体细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的平板，在恒温培养箱中 培养，以利于获得单菌落，筛选分离出含抗β基因的大肠杆菌。 (3)鉴定融合基因。为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成功，提取大肠杆菌的 作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳。在PCR过程中，每一个循环均包括变性、 三个阶段。为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5′端添加 ，电泳时将样品与 混合后加入加样孔。凝胶中加样孔的一端朝向电泳槽的 （正极/负极）。电泳后得到图2所示结果，根据 ，可推测PCR产物的长度，因此可判断 号泳道的样品符合要求。 (4)导入酵母菌。过程Ⅳ—Ⅴ中，将处理后的酵母菌接种于培养基中，该培养基不需要添加的成分有 （A．组氨酸  B．甲醇  C．无机盐  D．琼脂），此培养基上形成的母菌菌落即为目的菌株，此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株的原因是 （答出两点）。 (5)基因表达检测。将酵母菌接种后于 上振荡培养，将培养物离心后分成细胞和培养液两部分，将细胞用缓冲液重新悬浮，并 处理后，再次离心取上清液。用hCGβ蛋白对上清液和之前获得的培养液通过 技术进行检测，若两组均呈阳性，则说明基因在酵母菌中 。 (6)发酵罐生产。为了解发酵罐中酵母菌数量，取5g皮渣加入45mL无菌水中，按照此法，梯度稀释至104倍。取0.1mL稀释液涂布计数，三个平板中菌落数分别为56、62和56，则此时每克皮渣酵母菌数量是 个。 (7)蛋白活性检测。已知DNS在90℃以上可与还原糖发生显色反应，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，β-酶复合体蛋白与抗β蛋白结合后会遮盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能。向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，立刻沸水浴处理2min，此时沸水浴的目的是 。随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性。颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越 。β-酶复合体需要在低温下保存，原因是 。 【答案】(1)人工合成法/化学合成法 (2)倒置 (3) DNA 复性/退火、延伸 相应的限制酶识别序列 上样缓冲液 负极 已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度 3 (4) A 氨苄青霉素抗性基因只在原核细胞中表达，其启动子在酵母菌中无效；氨苄青霉素抑制细菌细胞壁的合成，不能作用于酵母菌 (5) 摇床 破碎 抗原—抗体杂交 成功表达并分泌 (6)5.8×106 (7) 使淀粉酶变性失活，终止淀粉水解 低 低温条件下酶的活性降低且酶的空间结构稳定 【分析】分析图1可知：Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。 【详解】（1）根据题图可知，图示获取hCGβ基因是通过查询基因数据库中hCGβ的基因序列后通过人工合成的（化学合成的），即图中获取抗β基因的方法属于人工合成法/化学合成法。 （2）为了防止冷凝水冲散菌落，导致菌落无法形成，或防止杂菌污染，在恒温培养箱中需要倒置。 （3）为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成，可以采用PCR法进行检测：提取大肠杆菌的DNA作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳；在PCR过程中，每一个循环均包括变性、复性（退火）、延伸3个阶段；为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5’端添加相应的限制酶识别序列，电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔；由于核酸带负电，凝胶中加样孔的一侧放于电泳槽的负极；已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，且环化质粒的长度为630+320=940kb，因此电泳结果为图2中的第3号泳道，说明受体细胞含有环化质粒，符合要求。 （4）形成菌落需要固体培养，而题干信息可知，收入的酵母菌是组氨酸缺陷项，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入A组氨酸，但需要加入甲醇、无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体；题干信息启动子具有物种特异性，氨苄青霉素抗性基因只在原核细胞中表达，其启动子在酵母菌中无效 ，氨苄青霉素抑制细菌细胞壁的合成，不能作用于酵母菌，故此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株。 （5）振荡培养需要在摇床上进行，将酵母菌接种后于摇床上振荡培养；hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，抗原与抗体的结合具有特异性，故可用抗原-抗体杂交分别进行检测；若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。 （6）根据题意可知，每克皮渣酵母菌数量=（56+62+56）×104×10=5.8×106个。 （7）分析题意，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，则淀粉在淀粉酶的催化下可以水解，立刻沸水浴处理2min的目的是使淀粉酶变性失活，终止淀粉水解；抗β-酶复合体蛋白与β蛋白结合后会盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能；随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性，颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越低；由于低温条件下酶的活性降低且酶的空间结构稳定，故β-酶复合体需要在低温下保存。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$