1.2.2 微生物的选择培养技术 第2课时 课件 2023—2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1 如何分离非优势种群的特定微生物？ 如何筛选具有特定性状的纯培养物？ 2 1.2 微生物的培养技术及应用 第二节 微生物的选择培养和计数 微生物 的 选择培养和计数 1 选择培养基 2 微生物的选择培养 3 微生物的数量测定 3 3 【资料1】（P16）耐热DNA 聚合酶 (Taq DNA 聚合酶)：1969年人们从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离出一种嗜热的水生栖热菌yT1株分离提取出，能在70~ 75℃生长，从该菌分离纯化得到一种耐热的、依赖DNA 的DNA 聚合酶，简称Taq DNA 聚合酶。 一、选择培养基 筛选水生栖热菌的条件是什么？为什么这个条件能让水生栖热菌“脱颖而出”？ 水生栖热菌能适应高温环境，而绝大多数微生物在高温下不能生存。 4 【资料2】(P16 思考讨论)尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4＋等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。 CO(NH2) 2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 NO3-、NH4＋ 被植物吸收 尿素分子模型 一、选择培养基 5 1.如果让你配置一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 培养基的配方中也应含有微生物生长所需的营养要素: 碳源、氮源、水、无机盐等。 但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 一、选择培养基 6 以上资料对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？ 人为提供有利于目的菌生长的条件（营养、温度和pH等），可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“选择培养”的作用。 一、选择培养基 7 伊红美兰琼脂培养基 【资料3】当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。 而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。 在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金黄色葡萄球菌在此培养基上不生长。 8 一、选择培养基 【资料4】(P20 2.) 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。请回答下列问题。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 9 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 土壤取样 →富含纤维素的环境 →以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 →制备系列稀释液 →筛选产生透明圈的菌落 →将样品涂布到含刚果红的培养基上 梯度稀释 选择培养 涂布平板 挑选 （选择培养基） （鉴别培养基） 10 10 一、选择培养基 按培养基的用途分类 基础培养基 选择培养基 含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。（课本P16） 鉴别培养基 在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。 完全培养基 基础培养基+特殊物质（生长因子、氨基酸、维生素、碱基等） 11 【资料1】 通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的 数量最多，能分解尿素的细菌是其中一部分，如图1。 【资料2】土壤溶液直接接种到选择培养基上的培养，结果如图2。 图1完全培养基 图2选择培养基 可否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？ × 二、微生物的选择培养 12 【资料3】当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 稀释107倍 二、微生物的选择培养 13 【资料4】 平板划线法 用平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的吗？为什么？ × 二、微生物的选择培养 14 【稀释涂布平板法】 （1）概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 在稀释度足够大的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 二、微生物的选择培养 15 土壤取样 梯度稀释 取菌液滴加到培养基表面 涂布器消毒、灭菌 涂布平板 【稀释涂布平板法】 （2）梯度稀释操作 ①准备盛有90ml无菌水的锥形瓶一只，准备盛有9mL无菌水的6支试管按102~107的顺序编号； ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。 ④从102被稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入103倍稀释的试管中，重复第③步的混匀操作。以此类推，直至完成最后一支试管的操作。 16 ③用移液枪吸取1mL锥形瓶中稀释10倍的菌液，注入102倍稀释的试管中，充分混匀； (3)涂布的操作 【稀释涂布平板法】 17 【稀释涂布平板法】 （4）微生物培养的条件： 30~37℃的恒温培养箱中培养1~2天。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 18 【稀释涂布平板法】 ①各操作细节要保证“无菌”。如移液管要经过灭菌，梯度稀释时，试管口和移液枪在离火焰1~2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。 (5)注意事项 ②将涂布器浸在盛有质量分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。 ③操作中要注意防火。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 ④涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。 19 平板划线法 稀释涂布平板法 与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板发可以用于细菌的计数？如何计数？ 三、微生物的数量测定 三、微生物的数量测定 20 2. 原则： （1）选择菌落数为30~300的平板计数。 （2）在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 减少实验误差,保证实验结果更准确 三、微生物的数量测定 21 为什么统计的菌落数往往比活菌的实际数目小？ 因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 3. 结果分析 1. 原理: 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 （2021·河北高考真题）葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。回答下列问题：（2）为了解皮渣中微生物的数量，取10g皮渣加入90mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0．1mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为___________个。 8.8×106 三、微生物的数量测定 22 1x10 1x102 1x103 1x104 计算：（78+91+95）个÷3 0.1mL x10 ml x10 x10 x100 ÷10 g土样=8.8x106个/g 稀释倍数（M） 1x104 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数（C) 涂布平板时所用的稀释液的体积(V) 4. 计算公式 每克样品中的菌株数＝(C÷V )×M 23 （2016 年，四川卷，第 10 题节选）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程， （2）在 5 个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105 的土壤样品溶液 0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为 13、156、462、178 和 191。 该过程采取的接种方法是______________ ，每克土壤样品中的细菌数量为____________ 个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较___________ 。 稀释涂布平板法 1.75×108 少 三、微生物的数量测定 4. 计算公式 （1）原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 （2）结果分析：统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，因此计数的结果比实际值大。 5. 其他计数方法：显微镜直接计数法 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 三、微生物的数量测定 24 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【实验原理】 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方如下。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4∙7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 提供无机盐 调节pH 提供碳源 提供氮源 提供水 可判断为固体培养基 25 25 【实验设计流程】 土壤取样 ①要求：富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤 ②取样土层：距地表3~8cm的土壤层 制备培养基 以尿素为唯一氮源（选择培养基） 样品的稀释 在酒精灯火焰旁称取土壤10g，放入90mL无菌水的锥形瓶中，震荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吸取三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。以此类推，制成103、104、105、106、107倍的土壤稀释液。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 26 【实验设计流程】 涂布平板 培养与观察 实验组： 1、2、3平板是选择培养基， 4 平板为牛肉膏蛋白胨培养基， 以判断选择培养基是否具有筛选作用； 对照组： 5不涂布稀释液的选择培养基 6不涂布稀释液的牛肉膏蛋白胨培养基 以验证培养基中是否含有杂菌。 1 2 3 4 将平板倒置于30~37℃的恒温培养箱中培养1~2天。每隔24小时统计一次菌落数目 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 27 注意：①每个浓度至少设置4个平板 ②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。 菌落计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。 稀释度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 每个平板的菌落数 【实验设计流程】 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 28 稀释度 菌落形状 菌落大小 菌落颜色 平均值 104 105 106 29 【结果分析与评价】 内容 现象 结论 有无杂菌污染的判断 空白对照的培养基中无菌落生长 选择培养基 的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目 样品的稀释 操作 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板 重复组的结果 未被杂菌污染 选择培养基具有筛选作用 操作成功 若选取同一种土样，统计结果应相近 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 30 31 【实例】教材P19 3.若A同学与其他同学统计的数量差异很大，可能是什么原因引起的？ 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【结果分析与评价】 一是由于土样不同; 二是由于培养基污染或操作失误 如何设置对照实验来确定原因? 方案一: 其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误; 如果结果不同，则证明A同学存在培养基污染或操作失误。 方案二: 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照,以证明培养基是否受到污染。 小结:通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照实验的设置是必不可少的 32 【进一步探究】 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 鉴别培养基： 以尿素为唯一氮源的培养基+酚红指示剂 （1）原理： 脲酶将尿素分解成了氨→PH升高→酚红指示剂变红 （2）方法： 观察到红色菌落→脲酶阳性→是尿素分解菌 得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况。 固体培养基： 33 获取天然菌种 分离 (选择培养基） 扩大培养 鉴定 (选择培养基） 四、微生物的培养技术的应用 34 获取天然菌种 分离 (选择培养基） 扩大培养 （完全培养基） 富集目的菌 （选择培养基） 鉴定 (选择培养基） 四、微生物的培养技术的应用 35 获取天然菌种 分离与鉴定 (选择培养基）（鉴别培养基） 扩大培养 若目的菌的含量高 若目的菌的含量低 富集 （选择培养基） 稀释 四、微生物的培养技术的应用 36 四、微生物的培养技术综合应用 空气微生物检测：空气微生物检测一般只计在37℃繁殖的微生物总数，而不计微生物种类。常用的检验方法有两种：一是测菌落数，它代表了一定时间内从空中落到单位地面上的微生物个数；二是测浮游细菌数。即单位面积空气中浮游着的微生物个数。进行菌落数检测时，首先把一定数量的琼脂平板，均匀地铺设在室内的地板上。打开平板，暴露琼脂于空气中若干小时，然后在37℃恒温箱内培养48h，计数每个平板琼附表面的菌落数。对浮游细菌数的检测实际上是检测试样的总菌数，根据收集细菌的方法不同,可以分为撞击法、过滤法和静电沉降法等。 37 不同环境如何取样？ ①土壤 用无菌水充分稀释 ②空气 沉降平板法 ③水样 自来水：酒精擦拭水龙头，火焰灼烧灭菌，水流5min 沉降平板法: 将盛有琼脂培养基的平板置于待测地点，打开平板盖子暴露一定时间，然后进行培养，计数菌落数。实验结果表明，培养基在空气中暴露1 min后,每平方米培养基表面上生长的菌落数相当于0.3 m3空气所含有的细菌数。该方法比较原始，一些悬浮在空气中的带菌小颗粒在短时间也不易降落在培养皿内，因而无法确切进行定量测定，但检测方法简便，用于不同条件下空气中微生物数量的相互比较是适宜的。 38 39 40 不同环境如何取样？ ①土壤 用无菌水充分稀释 ②空气 沉降平板法 ③水样 自来水：酒精擦拭水龙头，火焰灼烧灭菌，水流5min后取样 ④牛奶 用无菌水充分稀释 ⑤固体表面取样 水源：一般距水面下10-15cm深层采样 用无菌水湿润无菌棉签，对固体表面相应面积采样 Lavf57.71.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$