专题18 基因工程-【好题汇编】5年（2020-2024）高考1年模拟生物真题分类汇编（北京专用）

专题18 基因工程 五年考情 考情分析 基因工程 2024年北京卷第20题 2023年北京卷第 21题 2022年北京卷第21 题 2021年北京卷第20 题 2021年北京卷第 21题 2020年北京卷第12 题 2020年北京卷第 17题 通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，PCR技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。 1、（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 （1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生___________的过程称为细胞分化，分化是基因___________的结果。 （2）对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A. 增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B. 增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C. 一个增强子只能作用于一个基本启动子 D. 很多增强子在不同组织中的活性不同 （3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测___________。 （4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称_____（略）。 【答案】（1） ①. 稳定性差异 ②. 选择性表达 （2）C （3）其他器官细胞中，G和H两个基因是否转录出相应的mRNA或是否翻译出相应的蛋白质 （4） 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 【小问2详解】 AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 【小问3详解】 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA或是否翻译出相应的蛋白质。 【小问4详解】 增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，需要将增强子插入到目的基因内部。图如下： 2、（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。    (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。 【答案】(1)A/腺嘌呤 (2) Q R (3) 将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T (4)大多数B细胞没有被BrdU标记 【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。 【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。 （2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。　 （3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。 （4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。 3、（2022·北京·高考真题）．生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子： 。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因： A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。 【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3) ② D (4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。 （2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。 （3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。 （4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。 （5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 4、（2021·北京·高考真题）玉米是我国重要的农作物，研究种子发育的机理对培育高产优质的玉米新品种具有重要作用。 (1)玉米果穗上的每一个籽粒都是受精后发育而来。我国科学家发现了甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4。籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的 定律。上述果穗上的正常籽粒均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株所占比例约为 。 (2)为阐明籽粒干瘪性状的遗传基础，研究者克隆出候选基因A/a。将A基因导入到甲品系中，获得了转入单个A基因的转基因玉米。假定转入的A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，请从下表中选择一种实验方案及对应的预期结果以证实“A基因突变是导致籽粒干瘪的原因” 。 实验方案 预期结果 I．转基因玉米×野生型玉米 II．转基因玉米×甲品系 III．转基因玉米自交 IV．野生型玉米×甲品系 ①正常籽粒：干瘪籽粒≈1：1 ②正常籽粒：干瘪籽粒≈3：1 ③正常籽粒：干瘪籽粒≈7：1 ④正常籽粒：干瘪籽粒≈15：1 (3)现已确认A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA（见图1），使A基因功能丧失。甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株的基因型为 。 (4)为确定A基因在玉米染色体上的位置，借助位置已知的M/m基因进行分析。用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P与基因型为MM的甲品系杂交得F1，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒（F2）胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，如图2所示。 统计干瘪籽粒（F2）的数量，发现类型1最多、类型2较少、类型3极少。请解释类型3数量极少的原因 。 【答案】(1) 分离 2/3 (2)III ④/II ③ (3)Aa (4)基因Aa与Mm在一对同源染色体上（且距离近），其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体/同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少。 【分析】1、基因分离定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子时，等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代；位于性染色体上的基因控制的性状的遗传总是和性别相关联，叫伴性遗传，伴性遗传也遵循分离定律。 2、基因突变：（1）DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。（2）基因突变的特点：普遍性、随机性、不定向性、多害少利性等。 【详解】（1）分析题干信息：“甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4”，即甲品系籽粒正常，其自交后代出现性状分离，且籽粒正常∶干瘪=3∶1，可知籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的分离定律。假设籽粒正常和干瘪这一对相对性状由基因A/a控制，则甲品系基因型为Aa。上述果穗上的正常籽粒基因型为1/3AA或2/3Aa，均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株基因型为Aa，所占比例约为2/3。 （2）分析题意可知，假定A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，由于转入的单个A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，则甲品系玉米基因型为Aa，野生型玉米的基因型为00AA（0表示没有相关基因），转基因甲品系玉米的基因型为A0Aa，且导入的A基因与细胞内原有的A/a基因之间遗传遵循自由组合定律，要证实该假设正确，应可选择方案III转基因玉米自交，依据自由组合定律可知，子代为④正常籽粒（9A-A-、3A-aa、300A-）：干瘪籽粒（100aa）≈15：1；或选择方案II转基因玉米A0Aa×甲品系00Aa杂交，子代为③正常籽粒（3A0A-、1A0aa、300A-）：干瘪籽粒（00aa）≈7：1。 （3）已知A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA，使A基因功能丧失，甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株中含有a基因，即其基因型为Aa。 （4）用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P（基因型为AAmm）与基因型为MM的甲品系（基因型为AaMM）杂交得F1，基因型为1/2AAMm、1/2AaMm，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒F2胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，基因型分别为aaMM、aaMm、aamm。若两对等位基因位于两对同源染色体上，则类型3的数量应该与类型1的数量同样多，而实际上类型3数量极少，原因可能是：由于基因Aa与Mm在一对同源染色体上（且距离近），其中a和M在同一条染色体上；在减数分裂过程中四分体/同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换，导致产生同时含有a和m的重组型配子数量很少；类型3干瘪籽粒是由雌雄配子均为am的重组型配子受精而成。因此，类型3干瘪籽粒数量极少。 【点睛】本题结合基因工程考查基因分离定律和基因自由组合定律的应用，以及基因位置的判断的相关知识，思维含量较大，要求学生能够理解遗传定律的实质，依据题干信息准确分析，得出结论。 5、（2021·北京·高考真题）近年来发现海藻糖-6-磷酸（T6P）是一种信号分子，在植物生长发育过程中起重要调节作用。研究者以豌豆为材料研究了T6P在种子发育过程中的作用。 (1)豌豆叶肉细胞通过光合作用在 中合成三碳糖，在细胞质基质中转化为蔗糖后运输到发育的种子中转化为淀粉贮存。 (2)细胞内T6P的合成与转化途径如下： 底物T6P海藻糖 将P酶基因与启动子U（启动与之连接的基因仅在种子中表达）连接，获得U-P基因，导入野生型豌豆中获得U-P纯合转基因植株，预期U-P植株种子中T6P含量比野生型植株 ，检测结果证实了预期，同时发现U-P植株种子中淀粉含量降低，表现为皱粒。用同样方法获得U-S纯合转基因植株，检测发现植株种子中淀粉含量增加。 (3)本实验使用的启动子U可以排除由于目的基因 对种子发育产生的间接影响。 (4)在进一步探讨T6P对种子发育的调控机制时，发现U-P植株种子中一种生长素合成酶基因R的转录降低，U-S植株种子中R基因转录升高。已知R基因功能缺失突变体r的种子皱缩，淀粉含量下降。据此提出假说：T6P通过促进R基因的表达促进种子中淀粉的积累。请从①~⑤选择合适的基因与豌豆植株，进行转基因实验，为上述假说提供两个新的证据。写出相应组合并预期实验结果 。 ①U-R基因    ②U-S基因    ③野生型植株④U-P植株    ⑤突变体r植株 【答案】(1)叶绿体基质 (2)低 (3)在其他器官（过量）表达 (4)②⑤   与突变体r植株相比，转基因植株种子的淀粉含量不变，仍皱缩 ①④   与U-P植株相比，转基因植株种子淀粉含量增加，为圆粒 ②④   与U-P植株相比，转基因植株种子R基因转录提高，淀粉含量增加，为圆粒 【分析】1、光合作用分为光反应和暗反应两个阶段，其中光合作用的光反应阶段，在叶绿体类囊体薄膜上进行；暗反应阶段，在叶绿体基质上进行。 2、启动子是位于基因的首端，是一段特殊的DNA序列，用于驱动基因的转录。 【详解】（1）豌豆叶肉细胞通过光合作用形成三碳糖是暗反应过程，该过程发生在叶绿体基质中。 （2）结合题意可知，P酶基因与启动子U结合后则可启动U基因表达，则P基因在种子中表达增高，P酶增多，T6P更多转化为海藻糖，故预期U-P植株种子中T6P含量比野生型植株低。 （3）结合题意可知，启动子U启动与之连接的基因仅在种子中表达，该过程可以排除由于目的基因在其他器官（过量）表达对种子发育产生的间接影响。 （4）分析题意可知，本实验的目的是验证T6P通过促进R基因的表达促进种子中淀粉的积累，且结合（2）可知，U-P植株种子中淀粉含量降低，表现为皱粒。用同样方法获得U-S纯合转基因植株，检测发现植株种子中淀粉含量增加，实验设计应遵循对照与单一变量原则，故可设计实验如下： ②（U-S基因，S酶可以较高表达）⑤ （R基因功能缺失突变体），与突变体r植株相比，转基因植株种子的淀粉含量不变，仍皱缩； ①（U-R基因，R基因表达较高）④ （U-P植株，P基因表达较高），与U-P植株相比，转基因植株种子淀粉含量增加，为圆粒； ②（U-S基因，S酶可以较高表达）④ （U-P植株，P基因表达较高），与U-P植株相比，转基因植株种子R基因转录提高，淀粉含量增加，为圆粒。 【点睛】本题主要考查光合作用和基因的表达等知识点，要求学生掌握光合作用的过程以及物质变化和发生的场所，理解基因表达的过程和意义，能够正确获取有效信息是突破该题的关键。 6、（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。 故选B。 7、（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是 。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。（举一例） 【答案】 多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染 【分析】基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质； （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端； （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 图2中对照组2也可以将纤维素进行分解，但其分解能力较弱。 【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。 （2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。 （3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。 （4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1酶）。 （5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。 【点睛】本题以基因工程为核心，考查表达载体的构建、工程菌的实验的知识，难点是分析基因表达时DNA的方向，mRNA与DNA的模板链互补；（4）中结合实验目的找到自变量。 一、单选题 1．（2024·北京·模拟预测）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是（    ）    A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒 B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因 C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒 D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功 【答案】C 【分析】分析题图，图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。 【详解】A、若用HindⅢ酶切，由于形成的黏性末端相同，因此目的基因可正向连接到质粒中，也可反向连接到质粒中，即通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒，A正确； B、氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaI和PvuI的酶切位点，若用PvuⅠ酶切，目的基因的插入会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因，B正确； C、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），而导入空质粒的含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，故若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得含有正确的重组质粒的菌体，而非获得正确的重组质粒，C错误； D、若用SalⅠ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，D正确。 故选C。 2．（2024·北京东城·二模）为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码了和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择SmaI进行酶切，再用DNA连接酶连接 C．构建表达载体时，应选择XhoI和PstI酶切载体E和含目的基因的载体P D．基因表达载体构建完成后，需利用农杆菌转化法导入受体细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、由图可知，不直接选择P构建表达载体是因为它不含启动子与终止子，A错误； BC、由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据图可知，中间载体P和载体E均含有XhoI和PstI酶识别序列，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRV识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，SmaI酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于XhoI和PstI酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误，C正确； D、由于将目的基因导入大肠杆菌，因此用钙离子处理法最有效，D错误。 故选C。 3．（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ）    A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 【答案】C 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。其过程如下: ①高温变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 ②低温复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③中温延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、由图可知：借助引物1、2进行PCR1，借助引物3、4进行PCR2，而引物1、3结合在同一模板链的不同部位，引物2、4也结合在同一模板链的不同部位，所以图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理，A正确； B、实现基因的定点诱变时，需要根据目的基因序列设计两种常规引物，以及根据拟突变位点处碱基序列的位置设计两种突变引物，图中属于突变引物的是引物2、3；与常规引物相比，图中的2、3两种引物必须要有一段互补的序列，可以进行碱基互补配对，而且应含有拟突变位点，否则无法实现进行PCR3筛选的突变产物的形成，B正确； C、进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，因此不需要另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物，C错误； D、利用重叠延伸PCR技术实现了基因的定点诱变。可见，此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组，D正确。 故选C。 4．（2024·北京西城·二模）为加速绿色荧光蛋白基因（GFP）进化，快速获得荧光强度更高的GFP蛋白，科研人员将DNA1（编码易错DNA聚合酶）和DNA2共同导入大肠杆菌（如图）。下列说法错误的是（    ）    A．用卡那霉素筛选含DNA1的大肠杆菌 B．易错DNA聚合酶催化GFP基因复制 C．GFP基因在此复制过程中突变率升高 D．连续传代并筛选强荧光菌落加速GFP进化 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、由图可知，卡那霉素抗性基因与GFP基因融合到DNA2上后导入大肠杆菌，因此用用卡那霉素筛选含DNA2的大肠杆菌，A错误； B、易错DNA聚合酶能催化DNA的复制，即能催化GFP基因复制，B正确； C、GFP基因在此复制时双螺旋被破坏，容易受内外因素的影响而发生突变，使其突变的频率升高，C正确； D、连续传代并筛选，逐代淘汰，就会筛选出荧光菌落，从而加速GFP进化，D正确。 故选A。 5．（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 【答案】B 【分析】结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，随后将基因表达载体导入同一细胞中。 【详解】AC、结合题意分析可知，该操作应该是将M5和B72基因分别连接在YEP蛋白对应的基因的5'端和3'端，AC错误； B、设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因，为构建基因表达载体作准备，B正确； D、将含有M5和B72的基因表达载体导入同一细胞中，D错误。 故选B。 6．（2024·北京丰台·二模）CAR-T细胞免疫疗法是将从患者体内提取的T细胞通过基因工程改造，使其表达肿瘤嵌合抗原受体（CAR），大量扩增后输回患者体内以清除癌细胞。下列有关说法错误的是（　　） A．CAR-T疗法的T细胞来源于细胞毒性T细胞 B．该疗法利用了细胞免疫和基因重组的基本原理 C．CAR-T细胞清除癌细胞的过程属于细胞坏死 D．CAR-T细胞上的CAR能够精准识别癌细胞 【答案】C 【分析】细胞免疫的过程：被病毒感染的靶细胞膜表面的某些分子发生变化，细胞毒性T细胞识别变化的信号，开始分裂并分化，形成新的细胞毒性T细胞和记忆T细胞。同时辅助性T细胞分泌细胞因子加速细胞毒性T细胞的分裂、分化。新形成的细胞毒性T细胞在体液中循环，识别并接触、裂解被同样病原体感染的靶细胞，靶细胞裂解、死亡后，病原体暴露出来，抗体可以与之结合，或被其他细胞吞噬掉。 【详解】A、细胞毒性T细胞能够识别并接触、裂解被同样病原体感染的靶细胞，CAR-T疗法的T细胞来源于细胞毒性T细胞，A正确； B、CAR-T细胞免疫疗法是将从患者体内提取的T细胞（细胞毒性T细胞）通过基因工程改造，利用了细胞免疫和基因重组的基本原理，B正确； C、CAR-T细胞清除癌细胞的过程属于细胞凋亡，C错误； D、CAR-T细胞表面有肿瘤嵌合抗原受体（CAR），故可以通过CAR能够精准识别癌细胞，D正确。 故选C。 7．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达， 研究人员构建了下图所示的表达载体， 以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（    ） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因， 需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加潮霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选B。 8．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。    下列相关分析不正确的是（　　） A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因 B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接 C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列 D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果 【答案】B 【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA连接酶连接目的基因和载体。 【详解】A、由题意可知，表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌，所以可将尿嘧啶合成基因作为表达载体上的标记基因，若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶，说明导入成功，A正确； B、该方法需利用DNA连接酶实现目的基因与载体的连接，不需要使用限制酶，B错误； C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列，以便引物与目的基因配对，C正确； D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则证明转基因成功，D正确。 故选B。 9．（2024·北京朝阳·一模）F基因突变可引发人类某种单基因遗传病。以下图1为该遗传病的家系图谱，图2为用限制酶M处理家系成员的F基因后，进行电泳的部分结果。 下列叙述不正确的是（　　） A．突变的F基因序列中存在一个限制酶M的酶切位点 B．该遗传病的致病基因是位于X染色体上的隐性基因 C．Ⅲ-1的F基因经M酶切后电泳检测结果与I-2一致 D．若Ⅱ-1与Ⅱ-2再生育，生出患病孩子的概率为1/4 【答案】C 【分析】分析题图可知：图1中，Ⅰ-1与Ⅰ-2正常，Ⅱ-3患病，说明该病为隐性遗传病。图2中，限制酶M处理家系成员的F基因后，Ⅱ-3有6.5kb和5.0kb片段，说明F基因突变产生隐性致病基因（f）经限制酶切割后产生了6.5kb和5.0kb片段，而6.5kb+5.0kb=11.5kb，致病基因可能由正常基因发生碱基对的替换形成 ，替换前的正常基因（F基因）序列不能被限制酶M识别，图中11.5kb片段即为F基因。 【详解】A、图1中，Ⅰ-1与Ⅰ-2正常，Ⅱ-3患病，说明该病为隐性遗传病。图2中，限制酶M处理家系成员的F基因后，Ⅱ-3有6.5kb和5.0kb片段，说明F基因突变产生隐性致病基因（f）经限制酶切割后产生了6.5kb和5.0kb片段，f基因被切割成两个片段说明突变的F基因序列中存在一个限制酶M的酶切位点，A正确。 B、图1中，Ⅰ-1与Ⅰ-2正常，Ⅱ-3患病，说明该病为隐性遗传病。图2中，限制酶M处理家系成员的F基因后，Ⅱ-3有6.5kb和5.0kb片段，说明F基因突变产生隐性致病基因（f）经限制酶切割后产生了6.5kb和5.0kb片段，而6.5kb+5.0kb=11.5kb，致病基因可能由正常基因发生碱基对的替换形成 ，替换前的正常基因（F基因）序列不能被限制酶M识别，图中11.5kb片段即为F基因。即Ⅰ-1只含F基因，Ⅰ-2与Ⅱ-2既含F基因又含f基因，Ⅱ-3只含f基因，若该病为常染色体隐性遗传病，则Ⅱ-3基因型为ff，Ⅰ-1与Ⅰ-2基因型为Ff，与电泳结果不符，因此，该病不可能为常染色体隐性遗传病，该遗传病的致病基因是位于X染色体上的隐性基因，B正确； C、该遗传病的致病基因是位于X染色体上的隐性基因，Ⅱ-1基因型为XFY，Ⅱ-2基因型为XFXf，Ⅲ-1的基因型为XFXF或XFXf，Ⅲ-1的F基因经M酶切后电泳检测结果与I-1或I-2一致，C错误； D、该遗传病的致病基因是位于X染色体上的隐性基因，Ⅱ-1基因型为XFY，Ⅱ-2基因型为XFXf，生出患病孩子XFY的概率为1/4，D正确。 故选C。 10．（2024·北京丰台·一模）V蛋白对登革热病毒的增殖有抑制作用。V蛋白含有285个氨基酸，其cDNA长1241bp。将V蛋白在大肠杆菌中诱导表达，经纯化后免疫小鼠，最终获得5株分泌V单抗的杂交瘤细胞，提取单抗与V蛋白杂交，电泳结果如下图，相关叙述错误的是（    ） A．V蛋白的cDNA中含有不编码V蛋白的序列 B．获得的5株杂交瘤细胞都能无限增殖 C．用V蛋白免疫小鼠的目的是获得相应抗体 D．可培养5A8杂交瘤细胞大量生产单克隆抗体 【答案】C 【分析】1、单克隆抗体制备的过程：首先用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞，诱导与骨髓瘤细胞融合，第一次筛选获得杂交瘤细胞，第二次筛选获能够产生特定抗体的杂交瘤细胞，再注射到小鼠腹腔中或者体外培养，获得单克隆抗体。 2、构建cDNA文库的方法：提取某生物的mRNA，逆转录形成cDNA单链，然后通过复制形成cDNA双链，与载体体外重组，导入受体菌中储存。 【详解】A、V蛋白含有285个氨基酸，考虑终止密码子，cDNA中的碱基数应该为286×6=1716个，而V蛋白的cDNA有1241bp（碱基对），说明V蛋白的cDNA中含有不编码V蛋白的序列，A正确； B、5株杂交瘤细胞都能分泌单抗，这些杂交瘤细胞都能无限增殖，B正确； C、用V蛋白免疫小鼠的目的是能产生特定抗体的B淋巴细胞，C错误； D、如图5A8杂交瘤细胞产生的单抗与其他组相比，反应更强，说明其产生的抗体量更多，D正确。 故选C。 11．（2024·北京东城·一模）西北牡丹在白色花瓣基部呈现色斑，极具观赏价值。研究发现，紫色色斑内会积累花色素苷。PrF3H基因控制花色素苷合成途径中关键酶的合成。如图，分别提取花瓣紫色和白色部位的DNA，经不同处理后PCR扩增PrF3H基因的启动子区域，电泳检测扩增产物。分析实验结果可以得出的结论是（　　） A．花瓣紫色与白色部位PrF3H基因的碱基序列存在差异 B．白色部位PrF3H基因启动子甲基化程度高于紫色部位 C．PrF3H基因启动子甲基化程度高有利于花色素苷合成 D．启动子甲基化可调控基因表达说明性状并非由基因控制 【答案】B 【分析】生物的性状由基因决定，还受环境条件的影响，是生物的基因和环境共同作用的结果，即表现型=基因型+环境条件。 【详解】A、紫色部位和白色部位PrF3H的碱基序列相同，只是甲基化程度不同，A错误； B、根据电泳结构白色部位加入McrBC后没有出现电泳条带，而McrBC只能切割DNA的甲基化区域，说明白色区域的启动子甲基化程度高，B正确； C、白色部位PrF3H基因启动子甲基化程度高，而色色素表达少，因此可以推测PrF3H基因启动子甲基化程度高不利于花色素苷合成，C错误； D、启动子甲基化属于表观遗传，说明生物性状是由基因决定的，D错误。 故选B。 12．（2024·北京西城·一模）图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是（    ）    A．PCR扩增A时可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，即在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点，A正确； B、由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确； C、由题意可知，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色，不能在农杆菌中表达，C错误； D、启动子若为除草剂诱导启动子，表达后具有了除草剂的功能，将减少细胞物质和能量浪费，D正确。 故选C。 13．（2024·北京石景山·一模）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因一DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误； B．可通过感受态细胞的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌，B错误； C．基因表达载体上的启动子可调控蛛丝蛋白基因的表达，C错误； D．若需对蛛丝蛋白进行设计和改造以增强其韧性，可通过蛋白质工程来实现，D正确。 故答案为：D。 14．（2024·北京密云·模拟预测）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（　　）    A．过程①一般需要用促性腺激素处理 B．过程②是在雌鼠a的输卵管内完成 C．过程③需将表达载体注射到子宫中 D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 【答案】A 【分析】胚胎移植的生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。 【详解】A、过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，获得更多的卵母细胞，A正确； B、过程②是体外受精，体外受精是将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精，B错误； C、③是导入含S基因的表达载体，应该将含S基因的表达载体通过显微注射法注射至小鼠的受精卵中，C错误； D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程④不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，D错误。 故选A。 15．（23-24高三下·北京延庆·阶段练习）研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（    ）    A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程 B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器 C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色 【答案】D 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。依题意，改良后的药物t-PA蛋白将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸改良而来，因此，制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程，A正确； B、科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。因此，利用重组pCLY11质粒也可获得牛乳腺生物反应器，B正确； C、t-PA改良基因的黏性末端如图所示，则所选的限制酶所获得的切口应与t-PA改良基因的黏性末端相同，因此需选用限制酶XmaI和BglⅡ切开质粒pCLY11，C正确； D、结合图示可知，限制酶XmaI和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏新霉素抗性基因，导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，没有相应产物，因而菌落呈现白色，D错误。 故选D。 16．（23-24高三上·北京朝阳·期末）毕赤酵母是一种高效的分泌蛋白表达系统，能用于大量生产外源蛋白质。以下说法正确的是（    ） A．毕赤酵母属于基因工程常用的载体 B．可用显微注射法将目的基因导入毕赤酵母 C．可用DNA分子杂交技术检测目的基因是否成功表达 D．用毕赤酵母表达系统生产外源蛋白质可不必裂解酵母菌 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因工程常用的载体有这里、λ噬菌体和动植物病毒等，不包括毕赤酵母，A错误； B、毕赤酵母属于微生物，将目的基因导入微生物的常用方法是钙离子处理法，B错误； C、毕赤酵母高效表达的产物是蛋白质，可用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否成功表达，C错误； D、毕赤酵母是一种高效的分泌蛋白表达系统，能用于大量生产外源蛋白质，该类蛋白质合成和加工后可分泌到细胞外，故用毕赤酵母表达系统生产外源蛋白质可不必裂解酵母菌，D正确。 故选D。 二、非选择题 17．（2024·北京西城·二模）裸鼹鼠几乎不得癌症，其寿命可超过30年，同样大小的家鼠最长寿命为4年。为探究其原因，科研人员做了以下研究。 (1)将裸鼹鼠皮肤成纤维细胞置于 培养箱进行体外培养，经检测发现其分泌大量粘稠的高分子量透明质酸（HA），可抑制细胞过度增殖。 (2)研究者检测不同来源成纤维细胞中HA合成酶（HAS）的含量，结果如图1。另外，发现裸鼹鼠组织的HA降解酶（HAase）的活性远低于人和小鼠。结合图文信息，分析裸鼹鼠皮肤成纤维细胞分泌大量高分子量HA的原因是 。 结果显示，裸鼹鼠胚胎期HA合成酶低表达，推测其意义是 。 (3)为进一步研究高分子量HA能否提高小鼠的寿命，研究人员进行了下列实验（图2）。 NeoR：新霉素抗性基因；nmrHas2：裸鼹鼠 HA 合成酶 2 基因；CE：cre 重组酶-雌激素受体融合基因      注：启动子仅启动相邻基因的表达 ①通过转基因技术获得转基因小鼠A：为了将目的基因插入小鼠6号染色体的特定位点，需在其两端设计与6号染色体同源序列，实现同源序列之间的重组。由此获得的转基因小鼠A暂时无法表达HA合成酶2，原因是 。 ②B鼠为导入表达CE的纯合子，CE也插入6号染色体的相同位点。外源雌激素可诱导cre重组酶活化，活化的cre重组酶能识别并切除loxP位点间的序列。A、B鼠交配获得C、D鼠，请画出C鼠的基因组成情况 。 ③利用C、D鼠进行实验，测得实验组小鼠HA含量升高，癌症概率降低、炎症反应减少，寿命也得到了延长。请写出对照组的选材 （“C”或“D”）及实验处理。 (4)请简述本研究的应用前景 。 【答案】(1)CO2 (2) 裸鼹鼠体内HA合成酶2表达量（含量）高，促进HA合成；而HA降解酶活性低，减少分解 避免对胚胎期细胞分裂的抑制作用，保障正常生长发育 (3) 启动子未直接与HA合成酶2的基因相连 选材：D鼠，处理：注射外源雌激素 (4)高分子透明质酸未来可以应用于改善人类健康状况，治疗癌症和提升人类寿命等。 【分析】1、动物细胞培养所需气体主要有氧气和二氧化碳，氧气是细胞代谢所必需的，二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH值。进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将他们置于含有95%空气和5%二氧化碳混合气体的二氧化碳培养箱中进行培养 【详解】（1）动物细胞培养所需气体主要有氧气和二氧化碳，氧气是细胞代谢所必需的，二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH值。进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将他们置于含有95%空气和5%二氧化碳混合气体的二氧化碳培养箱中进行培养。将裸鼹鼠皮肤成纤维细胞置于CO2培养箱进行体外培养。 （2）根据图文信息可知，裸鼹鼠体内HA合成酶2表达量（含量）高，能够促进HA合成；而且HA降解酶活性低，减少分解，因此裸鼹鼠皮肤成纤维细胞分泌大量高分子量HA。根据题干信息可知，高分子量透明质酸（HA）可抑制细胞过度增殖。由此推测，裸鼹鼠胚胎期HA合成酶低表达，是为了避免对胚胎期细胞分裂的抑制作用，保障正常生长发育。 （3）通过将目的基因插入小鼠6号染色体的特定位点，需在其两端设计与6号染色体同源序列，实现同源序列之间的重组，由此获得的转基因小鼠A，由于启动子未直接与HA合成酶2的基因相连，因此转基因小鼠A暂时无法表达HA合成酶2。根据图示可知小鼠A、B的基因组成，将A、B鼠交配获得C、D鼠，C鼠基因组成如图所示： 根据题意信息可知，外源雌激素可诱导cre重组酶活化，活化的cre重组酶能识别并切除loxP位点间的序列。利用C、D鼠进行实验，测得实验组小鼠HA含量升高，癌症概率降低、炎症反应减少，寿命也得到了延长。因为D鼠没有loxP位点，因此C鼠为实验组，D鼠则是作为对照组，通过注射外源雌激素能够诱导cre重组酶活化，活化的cre重组酶能识别并切除loxP位点间的序列。 （4）根据题意可知，高分子量透明质酸可抑制细胞过度增殖，由此推测高分子透明质酸未来可以应用于改善人类健康状况，治疗癌症和提升人类寿命等。 18．（2024·北京通州·模拟预测）桑蚕的性别决定类型为ZW型，桃蚕食桑少、出丝率高，但在幼蚕阶段不易区分，研究人员利用基因工程技术对桑蚕进行改造，以实现蚕农只饲养雄蚕的愿望。 (1)建构TT’杂合雄蚕品系 研究发现，位于常染色体上的T基因，缺失后（基因型可表示为tt）会导致桑蚕胚胎停育。科研人员构建图1中的载体、应用 法将其导入雄蚕受精卵中，使载体与T基因两侧的同源区段发生重组，从而实现对T基因区段的替换，得到基因型为TT'的杂合雄蚕品系。    (2)构建特异性表达Cre酶的雌蚕品系 Cre酶可以特异性识别LoxP位点，从而将LoxP位点间的DNA片段进行切除。研究人员将胚胎发育后期启动子与Cre酶基因定点整合到W染色体上，构建了基因型为TT且特异性表达Cre酶的雌蚕品系。 ①将该品系与TT’杂合雄蚕杂交，当F1桑蚕胚胎发育至后期时，T’基因存在于 （选填“雄蚕”“雄蚕”“雌蚕和雄蚕”）中，会表现出绿色荧光的占F1桑蚕的 。 ②为对特异性表达Cre酶的雌蚕品系进行保持，科研人员在F1中筛选出Tt的雌蚕与TT’的雄蚕进行后续杂交，并利用图2中的引物对F2桑蚕的早期胚胎进行了PCR检测，结果如图3所示。      结合以上结果，在1~6号桑蚕的早期胚胎中，会发育为雄性的是 , 号桑蚕胚胎可能发生停育。 ③科研人员认为，F2桑蚕发育为幼虫后，仍然只有雄蚕可以呈现绿色荧光，你同意吗?请说明理由。 (3)结合以上桑蚕的分子育种方法，你认为以下说法正确的为 。 A．F1桑蚕的雌蚕幼虫中存在致死个体 B．F2桑蚕中胚胎致死的个体占雌蚕的1/4 C．F2桑蚕中雄蚕有4种基因型 D．该技术可以实现某基因的定点敲除 【答案】(1)显微注射 (2) 雄蚕 1/4 4、5、6 3 同意，雄蚕中，如T’ZZ或TT’ZZ，因不含Cre基因，不会发生T’基因的切除，故含有T’基因的雄蚕可以表现出绿色荧光 (3)BCD 【分析】1、题意分析：家蚕为ZW型性别决定，雄蚕出丝率及丝质量较高，经济价值明显高于雌蚕，所以在家蚕养殖中需进行雄蚕选育。限性遗传技术与性连锁平衡致死技术是常用的雄蚕选育技术。通过伴性遗传的特点，使得后代能够在幼年就通过性状区分性别，提高经济效益； 2、基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建，使目的基因与运载体结合；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与表达，检测目的基因的表达是否符合特定性状要求。 【详解】（1）将基因表达载体导入动物受精卵时常采用显微注射法； （2）由题意可知，将胚胎发育后期启动子与Cre酶基因定点整合到W染色体上，构建了基因型为TT且特异性表达Cre酶的雌蚕品系，该品系可表示为TO，因此与TT’杂合雄蚕杂交，子代为TT、TT’、TO、T’O，当F1桑蚕胚胎发育至后期时，T’基因存在于雄蚕中，会表现出绿色荧光的占F1桑蚕的 1/4；结合以上结果，在1~6号桑蚕的早期胚胎中，会发育为雄性的是4、5、6,3号胚胎缺少T或T’基因，导致3号桑蚕胚胎可能发生停育；雄蚕中，如T’OZZ或TT’ZZ，因不含Cre基因，不会发生T’基因的切除，故含有T’基因的雄蚕可以表现出绿色荧光，因此F2桑蚕发育为幼虫后，仍然只有雄蚕可以呈现绿色荧光； （3）A、由（2）可知，F1桑蚕的幼虫中不存在致死个体，A错误； B、Tt的雌蚕与TT’的雄蚕进行后续杂交，子代雌果蝇的基因型为TTZW、TT’ZW、TtZW、T’tZW（致死），故F2桑蚕中胚胎致死的个体占雌蚕的1/4，B正确； C、F2桑蚕中雄蚕有4种基因型：TTZZ、TT’ZZ、TtZZ、T’tZZ，C正确； D、由题意可知，启动子与Cre酶基因定点整合到W染色体上就可实现某基因的定点敲除，D正确。 故选BCD。 19．（2024·北京东城·二模）乳酸是一种需求量较大的工业原料，科研人员欲对酿酒酵母进行改造以进行乳酸生产。 (1)培养基中的葡萄糖可作为 为酿酒酵母提供营养。如图1，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后，无氧条件下发酵产物为 ，通过敲除丙酮酸脱羧酶基因获取高产乳酸的工程菌。该菌在有氧和无氧条件下均可产乳酸。 (2)为实现对菌体代谢的动态调控，研究人员设计了光感应系统，并导入绿色荧光蛋白（GFP）基因以检测光感应系统的调控能力。 ①如图2，系统1在酵母中表达由V、L和H组成的融合蛋白。光照下，融合蛋白空间结构改变， 后启动下游基因表达；在黑暗状态下，融合蛋白自发恢复到失活状态。 ②分别检测黑暗和光照下系统1的荧光强度，结果如图3。对照组能持续激活GFP表达。实验结果显示 ，可知系统1实现了光调控基因表达，但表达量较低。推测可能由于菌体密度高导致透光性差，不利于V-L-H对光照的响应。进一步优化设计出系统2（如图2），同等光照强度下，系统2荧光强度显著高于系统1，分析原因是 。    ③实验中发现黑暗条件下系统2的GFP基因有明显表达，为解决此问题，对系统2增加如图4所示组分，i、ii、iii依次为 （填字母序号）。    A．持续表达型启动子         B．Pc120             C．PGAL D．G80基因（G80蛋白可结合并抑制GAL4） E．GAL4基因（GAL4蛋白可结合并激活PGAL） F．PSD基因（含有PSD的融合蛋白在光下降解） (3)将优化后的系统2中GFP基因替换为乳酸脱氢酶基因，应用于酵母菌合成乳酸的发酵生产。发现在“先黑暗-后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，请推测“先黑暗-后光照”模式下乳酸产量高的原因 。 【答案】(1) 碳源 乳酸、乙醇 (2) ①结合启动子PC120 系统1在黑暗中荧光强度极低，光照后荧光强度升高但显著低于对照组 系统2中光直接调节GAL4的表达，GAL4进一步调控GFP表达，分级调节具有放大效应 ADF（或AFD） (3)发酵早期处于黑暗中，酵母菌不合成乳酸，物质和能量主要用于菌体生长繁殖，当菌体达到一定数量后，照光启动乳酸合成，因此乳酸总产量高。全程光照时，持续合成乳酸，消耗物质和能量较多，影响酵母菌生长繁殖，乳酸总产量低。 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）培养基中的葡萄糖可作为碳源为酿酒酵母提供营养；由图1可知，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后表达出乳酸脱氢酶，在无氧条件下将丙酮酸转化为乳酸，同时丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化作用下转化为乙醛，进而转化为乙醇，所以酿酒酵母无氧条件下发酵产物为乳酸、乙醇； （2）①由图2可以看出，光照下融合蛋白空间结构改变，融合蛋白与PC120启动子结合后启动下游基因表达； ②由图3可以看出，系统1在黑暗中荧光强度极低，光照后荧光强度升高但显著低于对照组，可知系统1实现了光调控基因表达，但表达量较低；由图2可知系统2在同等光照强度下，系统2中光直接调节GAL4的表达，GAL4进一步调控GFP表达，分级调节具有放大效应，所以系统2荧光强度显著高于系统1； ③实验中发现黑暗条件下系统2的GFP基因有明显表达，为解决此问题，对系统2增加如图4所示组分，i、ii、ii依次为持续表达型启动子、G80基因（G80蛋白可结合并抑制GAL4）、PSD基因（含有PSD的融合蛋白在光下降解）或持续表达型启动子、PSD基因（含有PSD的融合蛋白在光下降解）、G80基因（G80蛋白可结合并抑制GAL4），即选ADF或AFD； （3）在“先黑暗-后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，可能的原因是发酵早期处于黑暗中，酵母菌不合成乳酸，物质和能量主要用于菌体生长繁殖，当菌体达到一定数量后，照光启动乳酸合成，因此乳酸总产量高。全程光照时，持续合成乳酸，消耗物质和能量较多，影响酵母菌生长繁殖，乳酸总产量低。 20．（2024·北京朝阳·二模）贾第虫是寄生于人畜肠道内的单细胞动物，能依靠端粒酶维持端粒长度，反复传代呈现“永生化”。 (1)端粒是 两端的DNA—蛋白质复合体，正常情况下会随细胞分裂次数增加而逐渐截短，最终损伤端粒内侧正常基因，使细胞活动趋于异常。贾第虫端粒酶由RNA和逆转录酶组成，能以RNA为 催化合成新的端粒DNA序列，T区是逆转录酶的RNA结合功能域。 (2)研究者筛选出多种能与T区结合的蛋白，其中蛋白Z为贾第虫特有。通过图1所示实验进行验证（Myc和HA是已知短肽）。 ①为验证各组动物细胞均表达了相应的融合基因，可对 进行电泳后，做抗原—抗体杂交检测。 ②通过比较 两组的 抗体的检测结果证实T区与蛋白Z能够结合。 (3)研究者根据蛋白Z的基因序列设计核酶基因表达载体转染贾第虫，核酶可特异性结合并剪切Z基因的mRNA。检测贾第虫体内端粒酶活性，结果如图2。    ①端粒酶活性检测的原理是：端粒酶可将重复序列—（TTAGGG）连续加到寡核苷酸序列二（AATCCGTCGAGAGTT）的3'末端合成端粒DNA序列；根据 设计引物对端粒DNA序列进行PCR扩增，电泳检测产物；端粒酶活性越大，电泳条带 。 ②检测还发现：随着培养时间的延长，转基因贾第虫的端粒缩短而对照组无明显变化，对照组贾第虫数量显著增加而转基因贾第虫数量无明显变化。结合图2结果，解释贾第虫“永生化”的原因 。 (4)基于上述实验，提出一个研发贾第虫病特异性药物的方向 。 【答案】(1) 染色体 模板 (2) 总蛋白 乙、丙 抗Myc (3) 序列一、二（重复序列和寡核苷酸） 数目越多 Z蛋白可通过结合T区提高端粒酶活性，从而维持染色体端粒的长度，促进贾第虫反复传代 (4)研发抑制Z蛋白或T区活性的药物；研发抑制Z蛋白与T区结合的药物 【分析】由题意可知，端粒酶具活性，端粒DNA的相对长度就不会减少，说明端粒长度的保持、修复都与端粒酶有关；端粒是染色体两端DNA和蛋白质的复合体，贾第虫端粒酶由RNA和逆转录酶组成，能以RNA为模板修复端粒DNA。 【详解】（1）端粒是染色体两端的DNA—蛋白质复合体，正常情况下会随细胞分裂次数增加而逐渐截短，最终损伤端粒内侧正常基因，使细胞活动趋于异常。贾第虫端粒酶由RNA和逆转录酶组成，能以RNA为模板催化合成新的端粒DNA序列，T区是逆转录酶的RNA结合功能域； （2）①由题意可知，各组动物细胞均表达了相应的融合基因，就会得到相应的蛋白质，可以对总蛋白质进行电泳，并做抗原—抗体杂交检测相应的蛋白质； ②由图可知，甲、乙、丙三组抗体检测的结果是，甲组缺乏抗HA抗体，乙组有抗HA抗体和抗MYC抗体，丙组含有抗HA抗体，因此通过比较乙组和丙组的抗Myc抗体的检测结果证实T区与蛋白Z能够结合； （3）①根据序列—和序列二来设计引物对端粒DNA序列进行PCR扩增，电泳检测产物；端粒酶活性越大，电泳条带数目越多； ②结合图2结果，解释贾第虫“永生化”的原因Z蛋白可通过结合T区提高端粒酶活性，从而维持染色体端粒的长度，促进贾第虫反复传代； （4）由题意及电泳结果说明，可研发抑制Z蛋白或T区活性的药物或研发抑制Z蛋白与T区结合的药物来研发贾第虫病特异性药物。 21．（2024·北京东城·二模）水稻是人类重要的粮食作物之一，种子的胚乳由外向内分别为糊粉层和淀粉胚乳，通常糊粉层为单层活细胞，主要累积蛋白质、维生素等营养物质；淀粉胚乳为死细胞，主要储存淀粉。选育糊粉层加厚的品种可显著提高水稻的营养。 (1)用诱变剂处理水稻幼苗，结穗后按图1处理种子。埃文斯蓝染色剂无法使活细胞着色。用显微镜观察到胚乳中未染色细胞层数 的即为糊粉层加厚的种子，将其对应的含胚部分用培养基培养，筛选获得不同程度的糊粉层加厚突变体tal、ta2等，这说明基因突变具有 的特点。 (2)突变体tal与野生型杂交，继续自交得到F2种子，观察到野生型：突变型=3∶1，说明该性状的遗传遵循基因 定律。利用DNA的高度保守序列作为分子标记对F2植株进行分析后，将突变基因定位于5号染色体上。根据图2推测突变基因最可能位于 附近，对目标区域进行测序比对，发现了突变基因。 (3)由tal建立稳定品系t，检测发现籽粒中总蛋白、维生素等含量均高于野生型，但结实率较低。紫米品系N具有高产等优良性状。通过图3育种方案将糊粉层加厚性状引入品系N中，培育稳定遗传的高营养新品种。 ①补充完成图3育种方案 。 ②运用KASP技术对植物进行检测，在幼苗期提取每株植物的DNA分子进行PCR，加入野生型序列和突变型序列的相应引物，两种引物分别携带红色、蓝色荧光信号特异性识别位点，完成扩增后检测产物的荧光信号（红色、蓝色同时存在时表现为绿色荧光）。图3育种方案中阶段1和阶段2均进行KASP检测，请选择其中一个阶段，预期检测结果并从中选出应保留的植株。 ③将KASP技术应用于图3育种过程，优点是 。 【答案】(1) 增多 不定向性 (2) 分离 M83 (3) 阶段1：检测结果出现红色和绿色荧光，保留出现绿色荧光信号的植株。阶段2：检测结果出现红色、绿色和蓝色荧光，保留出现蓝色荧光信号的植株 在幼苗期即可测定基因型，准确保留目标植株，加快育种进程 【分析】基因突变： ⑴概念：是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变叫基因突变； ⑵特点： ①普遍性：生物界中普遍存在； ②随机性：生物个体发育的任何时期和任何部位都有可能发生； ③低频性：突变频率很低； ④有害性：一般是有害的，少数是有利的； ⑤不定向性：可以产生一个以上的等位基因。 【详解】（1）由题意可知，通常糊粉层为单层活细胞，选育糊粉层加厚的品种是活细胞且细胞层数增多了，因此要选择的糊粉层加厚的种子应为显微镜观察到胚乳中未染色细胞层数增多的种子；将其对应的含胚部分用培养基培养，筛选获得不同程度的糊粉层加厚突变体tal、ta2等，这说明基因突变具有不定向性的特点； （2）突变体tal与野生型杂交，继续自交得到F2种子，观察到野生型：突变型=3：1，说明该性状的遗传遵循基因分离定律；根据图2推测突变基因最可能位于发生重组个体数较少的区域附近，即M83附近，对目标区域进行测序比对，发现了突变基因； （3）①要通过图3的育种方案（杂交育种），首先是选择亲本杂交获得F1，让F1代与品系N回交获得F2，让F2代自交得到植株2，对植株2进行品质检测，最终挑选出稳定遗传的高营养新品种，育种方案如图所示： ； ②图3育种方案中阶段1和阶段2均进行KASP检测，阶段1：检测结果出现红色和绿色荧光，保留出现绿色荧光信号的植株；阶段2：检测结果出现红色、绿色和蓝色荧光，保留出现蓝色荧光信号的植株； ③将KASP技术应用于图3育种过程，优点是在幼苗期即可测定基因型，准确保留目标植株，加快育种进程。 22．（2024·北京西城·二模）科研人员获得了携带两种抗稻瘟病的抗性基因Pib和Pikm的水稻品系——川抗30，以及携带螟虫抗性基因CrylC的水稻品系——昌恢。为获得同时携带抗螟虫基因和两种抗稻瘟病基因的改良株系，开展了相关研究。 (1)水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对 。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻瘟病抗性，F1与野生型杂交，子代性状及分离比为 ，证明Pib和Pikm位于非同源染色体上。 (2)吕恢品系水稻在品质和产量上明显优于川抗30，科研人员结合分子标记技术筛选目标基因进行杂交育种，以获得改良优质水稻。请写出制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病）水稻的杂交育种技术路线（总体思路） 。 (3)研究者利用PCR技术检测改良优质水稻中是否含有Pib基因。 ①下表为利用PCR进行检测的反应体系的配方，请将表格补充完整。 PCR反应体系 组分 总体积/10μL 10倍浓缩的扩增缓冲液 1μL i 1.5μL 4种脱氧核苷酸等量混合液（2.5mmol·L-1） 0.5μL 引物I/II（5.0μmol·L-1） 1/1μL Taq DNA聚合酶 0．20μL H2O ii ②图为Pib基因的部分序列。 5'—…AATGCCC…ATGTGGA…—3' 3'—…TTACGGG…TACACCT…—5' 根据图，选择 作为引物对Pib基因进行扩增。 A．5'—…AATGCCC…—3'    B．5'—…TCCACAT…—3' C．5'—…TTACGGG…—3'    D．5'—…ATGTGGA…—3' 研究者最终确定改良优质水稻具备了相关抗性基因，成功培育出优质、高产的双抗水稻。 (4)检测发现本研究获得的优质双抗水稻的部分性状与昌恢品系相比出现株高上升、千粒重下降的现象，但是利用基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系，其他性状未发生改变，原因可能是 。请从育种的角度对这两种技术进行评价。 【答案】(1) 相对性状 稻瘟病抗性：敏感=3：1 (2)川抗30与昌恢杂交获得F1，F1与昌恢回交获得F2，利用分子标记技术筛选含有Pib和Pikm2基因的植株继续回交昌恢，重复筛选和回交步骤，将Fn所得植株自交，筛选Pib和Pikm2纯合的植株。 (3) 改良优质水稻的DNA 4.8μL A和B (4)与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下来 杂交育种技术简单，但育种周期长；基因编辑技术育种周期短，可定向改变生物的性状，但是技术难度高，存在“脱靶”等潜在风险 【分析】基因工程的基本操作程序： 第一步：目的基因的获取； 第二步：基因表达载体的构建（核心） 1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2、常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。 第四步：目的基因的检测和表达将目的基因导入细菌：感受态细胞法：用Ca2+处理细胞使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。1、首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。2、其次还要检测目的基因是否转录出mRNA。3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。 【详解】（1）水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对相对性状，同一性状的不同表现形式。假设两种抗性基因Pib和Pikm，分别用A，a和B、b表示，位于非同源染色体上，符合自由组合定律。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻瘟病抗性，说明抗性基因是由显性基因控制A、B控制的，F1的基因型为AaBb，与野生型的基因型为aabb杂交，后代的基因型为AaBb，aaBb，Aabb，aabb，性状及分离比为稻瘟病抗性：敏感=3：1。 （2）制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病），杂交育种的总体思路为：川抗30与昌恢杂交获得F1，F1与昌恢回交获得F2，利用分子标记技术筛选含有Pib和Pikm2基因的植株继续回交昌恢，重复筛选和回交步骤，将Fn所得植株自交，筛选Pib和Pikm2纯合的植株。 （3）①PCR进行检测的反应体系的配方缺少目的基因，因此i改良优质水稻的DNA，反应体系总体积10μL-1-1.5-0.5-1-1-0.2=4.8μL，因此水ii为4.84.8μL。 ②根据已知Pib基因的部分序列以及双链DNA分子的结构特点（反向平行），再结合DNA复制（PCR中）的特点，即子链合成的方向是从5′到3′，应选择引A和B物进行PCR扩增，故选A和B。 （4）基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下来,因此其他性状未发生改变。杂交育种和基因编辑技术育种都有优缺点，杂交育种技术简单，但育种周期长；基因编辑技术育种周期短，可定向改变生物的性状，但是技术难度高，存在“脱靶”等潜在风险。 23．（2024·北京海淀·二模）葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，科研人员通过改造工程菌以实现GA的大量生产。 (1)M酶和U酶是GA合成途径中的两个关键酶，科研人员将图1所示质粒1导入 处理的大肠杆菌，改造后的大肠杆菌可合成GA．    (2)为实现对工程菌合成GA的实时监测，科研人员设计了质粒2.并进行下表所示两种检测方案。 方案一 质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中 在液体培养基中培养一段时间 菌液分为5组 每组上清液加入适量GA，检测荧光强度。 方案二 质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中 将E菌液与S菌液混合，混合菌液培养一段时间后分为5组 ①据图1分析检测方案的原理为 。 ②检测结果如图2，据图对比两种方案，并结合两种质粒适用范围，选择其中一种更优方案并说明理由： 。    (3)进一步发现由于产物GA呈酸性影响了大肠杆菌合成GA的能力，因而科研人员尝试以酵母菌为受体细胞导入质粒1，改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA的途径如图3.但M酶的活性远小于U酶，限制了GA产量。为改进M酶的催化效率，将含不同突变的M酶基因分别导入酵母菌，利用上述所选方案菌株监测不同酵母菌的GA产量，操作为 ，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度（反应菌体浑浊程度），挑选 高的菌株即为GA高产菌株。    (4)据图3分析还可以通过 等方法改造酵母菌以提高GA的产量。 【答案】(1)Ca2+ (2) 菌株E可产生 GA，GA 与C蛋白结合激活 GFP 基因转录，通过荧光强度反映 GA 含量 方案二更优。理由:与方案一相比，方案二单位菌体密度的荧光强度更高，检测 GA 更灵敏，且还可检测真核生物合成GA的量 (3) 将不同酵母菌培养液上清分别与S菌液混合并培养 荧光值与吸光度比值 (4)提高I酶和N酶的表达量(合理即可) 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）为了增大细胞膜的通透性，通常用CaCl2处理大肠杆菌，以增大转化的成功率。 （2）①结合图1可知，菌株E可产生 GA，GA 与C蛋白结合激活 GFP 基因转录，通过荧光强度反映 GA 含量，因此不管是方案1将质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中，还是方案2将质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中，都可以通过荧光强度反映 GA 含量。 ②与方案一相比，方案二单位菌体密度的荧光强度更高，检测 GA 更灵敏，且还可检测真核生物合成GA的量 荧光值与吸光度比值，因此方案二更优。 （3）参考方案2，应将不同酵母菌培养液上清分别与A菌液混合并培养，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度；挑选荧光值（反映GA的合成）与吸光度（反映菌体密度）比值高的菌株即为GA高产菌株。 （4）结合图3可知，I酶可促进葡萄糖-6-P转化为肌醇-3-P，M酶可促进肌醇转化为葡萄糖醛酸，因此提高I酶和N酶的表达量可以提高GA的产量。 24．（2024·北京海淀·二模）种子成熟过程受脱落酸（ABA）等植物激素调控。为研究种子成熟的调控机制，研究者以拟南芥为材料进行了实验。 (1)ABA是对植物生长发育起 作用的微量有机物，在种子成熟过程中起重要作用。 (2)研究发现，种子成熟阶段S蛋白和J蛋白均有表达。研究者检测了不同拟南芥种子的成熟程度，结果如图1.根据图分析，S蛋白和J蛋白对种子成熟的调控作用分别是 。 (3)S蛋白可与J蛋白结合。为探究两蛋白在植物体中的作用关系，研究者在纯化的J蛋白溶液中分别加入野生型及S蛋白缺失突变体的种子细胞裂解液，使用药剂M进行相关处理，检测结果如图2.结果说明：S蛋白可使J蛋白 。 (4)检测发现，S蛋白缺失突变体比野生型体内的ABA含量低。编码S蛋白基因的启动子区有转录调控因子T的结合序列，T可被ABA激活。J蛋白也为一种转录调控因子。为研究T、J蛋白对S蛋白基因表达的调控，研究者构建了图3所示质粒并转化烟草叶肉原生质体，实验结果如图4. 图4结果说明： 。 (5)种子成熟对于种子提高萌发活力等具有重要作用。综合上述研究，分析ABA对种子成熟的调控机制 。 【答案】(1)调节 (2)促进、抑制 (3)降解 (4)T蛋白与S蛋白基因的启动子结合，促进S基因的表达，而J基因抑制T蛋白与S蛋白基因启动子的结合 (5)ABA激活T蛋白，T蛋白促进S蛋白合成，S蛋白可使抑制种子成熟的J蛋白降解，从而促进种子成熟 【分析】1、植物的生长发育过程，在根本上是基因组在一定时间和空间上程序性表达的结果。光照、温度等环境因子的变化，会引起植物体内产生包括植物激素合成在内的多种变化，进而对基因组的表达进行调节。2、脱落酸的作用：抑制细胞分裂，抑制植物的生长，也能抑制种子的萌发；促进叶和果实的衰老和脱落。 【详解】（1）ABA是植物激素，在植物生长发育过程中起调节作用。 （2）S蛋白缺失，种子成熟程度低，因此S蛋白促进种子成熟，而J蛋白过表达植株种子成熟度低，因此J蛋白抑制种子成熟。 （3）药剂M抑制蛋白质的降解，结合图示可知，S蛋白缺失的裂解液与J蛋白融合，J蛋白的含量多于与野生型的融合，说明J蛋白会被S蛋白降解。 （4）质粒1+2组作为对照，与1+2组相比，1+3组中T基因表达T蛋白，使得LUC/REN荧光强度比值明显增大，且REN、LUC不受T蛋白的影响，说明T蛋白能与S蛋白基因启动子结合，从而使得LUC增多，而1+4组与1+3+4组均与1+2组相同，说明第四组表达的J蛋白会抑制T蛋白与S蛋白基因启动子的结合，抑制LUC的合成。 （5）ABA激活T蛋白，T蛋白可与S蛋白的启动部位结合，启动S基因的表达，S蛋白增多，S蛋白可使J蛋白降解，而J蛋白抑制种子成熟，因此S蛋白可促进种子成熟，即ABA促进种子成熟。 25．（2024·北京房山·一模）肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的。科研人员利用基因工程技术，对小鼠肠道内相关菌株（B菌）进行改造，以期获得分泌更多BSH的工程菌BS菌。 (1)高脂饮食是引起高血脂症的一个主要原因，但脂质也是人体必要的物质，请写出属于脂质的2种化学物质 。 (2)工程菌的制备： ①X菌的筛选：16SrRNA基因是鉴定微生物的重要依据，其大小约为1500bp，高产BSH的X菌株的16SrRNA基因有限制酶ApaI的两个酶切位点，其他菌株中只有一个。通过PCR→ → →观察，结果如图1，可知 （填图1中序号）为所选目的菌种。 ②表达载体的构建： 科研人员操作如图2，进行同源重组构建表达载体。 I.将NC质粒用相关的限制酶进行酶切。 Ⅱ.在X菌株BSH基因两侧分别添加一段与上述载体同源（碱基排列次序相同）的序列A、B。 Ⅲ.表达载体同源重组过程如图2所示。如果BSH基因N链B端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC质粒M’链的碱基序列为 ，两者在5’-3’外切酶的作用下被降解，在DNA连接酶的作用下，在1、2处形成 键，完成基因表达载体的构建。 ③科研人员将表达载体用电击法导入B菌，获得BS菌株。 (3)关于图2所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有________ A．免去传统方法双酶切的繁杂操作 B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确 C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性 (4)用BS菌株给小鼠灌胃，同时给小鼠饲喂高脂饮食，对照组1不做处理，8周后检测小鼠肠道内容物，进行体外BSH活性检测，如图3所示，结果说明 。 (5)有人认为BS菌株适合开发为人体降脂的功能性菌剂，请辩证地评价该观点 。 【答案】(1)脂肪、磷脂（胆固醇、性激素） (2) 酶切 电泳 1/5/10/12 -T-T-T-C- 磷酸二酯 (3)ABC (4)成功获得分泌更多BSH的工程菌BS (5)为人体降脂治疗肥胖提供了一条重要的思路；可能破坏肠道菌群多样性和稳态，缺乏对人体健康的安全性评估 【分析】利用同源重组构建表达载体的方法优点有：①可以免去传统方法双酶切的繁杂操作，②保证目的片段插入载体时方向正确，③当载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部时，可克服传统方法中会破坏目的基因的局限性。 【详解】（1）脂质包括脂肪、磷脂和固醇，其中固醇可分为胆固醇、性激素和维生素D三种。 （2）①DNA电泳的基本步骤为PCR扩增基因、酶切处理适当大小的DNA片段、电泳分离、观察；根据题目信息可知，高产BSH的X菌株的16SrRNA基因有限制酶ApaI的两个酶切位点，16SrRNA基因经限制酶ApaI处理后可获得三种长度的DNA片段，普通菌株中的16SrRNA基因上只有一个该酶的切割位点，经该酶处理后可获得两种长度的DNA片段，观察图1发现，2、3、4、6、7、8、9组中电泳出1000和500两种DNA片段长度，1、5、10和12组中电泳出750、500、250三种DNA片段长度，11组电泳结果不明显，由此可知1、5、10和12组为所选目的菌种； ②Ⅲ.据图2可知，目的基因M链的3'端与NC质粒N'链的3'端在第二步时可以通过碱基互补配对将两个黏性末端拼接在一起，因此如果BSH基因N链B端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC质粒M’链的碱基序列为-T-T-T-C-；在DNA连接酶的作用下，在1、2处形成磷酸二酯键，将DNA链连在一起，完成基因表达载体的构建。 （3）利用同源重组构建表达载体的方法优点有：①可以免去传统方法双酶切的繁杂操作，②保证目的片段插入载体时方向正确，③当载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部时，可克服传统方法中会破坏目的基因的局限性。 故选ABC。 （4）分析图3可得，BS菌灌胃组的胆汁含量明显高于对照组，结合题干信息“肠道菌群分泌BSH，高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量”可知，该结果说明成功获得分泌更多BSH的工程菌BS菌。 （5）根据题干信息“肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的”可知，BS菌株有利于人体降脂，为人体降脂治疗肥胖提供了一条重要的思路，但作为新开发菌株，还缺少实验数据来确保该菌株的安全性，贸然摄入可能破坏肠道菌群多样性和稳态，缺乏对人体健康的安全性评估。 26．（2024·北京顺义·一模）人在衰老过程中某些性状会发生改变，为寻找衰老的原因，科研人员对染色质开展了相关研究。 (1)由图1可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域 ，某些DNA 。 (2)DNA甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散会 （促进/抑制）基因表达。 (3)科研人员推测：核内DNA断裂后的修复会导致表观遗传信息紊乱或丢失，加速细胞衰老。为验证该推测，科研人员基于图2原理，利用以下实验材料构建ICE模型鼠。 ①Cre酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于DNA上的Lx序列，导致两个Lx间的DNA片段丢失； ②I-E核酸酶基因：编码的I-E核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre酶形成复合物，切割DNA； ③口服诱导剂T：小分子化合物，可诱导Cre酶进细胞核。 请完善技术路线 ： (4)染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE小鼠的检测，发现已修复的DNA未发生碱基序列的改变。通过检测 ，可知获得的ICE鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。 【答案】(1) 松散、紧密连接蛋白减少 DNA低甲基化 (2)促进 (3) Cre酶 I-E核酸酶和绿色荧光蛋白基因 Lx 饲喂诱导剂T (4)DNA甲基化水平（DNA低甲基化） 【分析】分析图1，年轻状态时，DNA甲基化，染色质紧密，衰老状态时，DNA低甲基化，染色质松散，有利于基因表达。 【详解】（1）由图1可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域松散、紧密连接蛋白减少，某些DNA低甲基化。 （2）DNA甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散，有利于DNA解旋并进行转录，会促进基因表达。 （3）根据题图可知，无诱导剂T时，Cre酶会被降解，有诱导剂T时，Cre酶进入细胞核后作用于DNA上的Lx序列，导致两个Lx间的DNA片段丢失，I-E核酸酶基因会成功表达，并与ICE识别序列结合导致DNA双链断裂。技术路线如下：构建含有基因①Cre酶基因的基因表达载体，同时构建含基因②I-E核酸酶和绿色荧光蛋白基因的基因表达载体且载体中的终止子两侧插入Lx序列，分别将两种基因表达载体导入小鼠受精卵，并使之发育为小鼠1和小鼠2，利用两鼠杂交，筛选目标鼠后，饲喂诱导剂T，诱导Cre酶进细胞核，I-E核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre酶形成复合物，切割DNA在显微镜下观察细胞核是否出现绿色荧光，有绿色荧光说明融合基因已表达且位于细胞核，即为ICE鼠。 （4）染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE小鼠的检测，发现已修复的DNA未发生碱基序列的改变。通过检测DNA甲基化水平（DNA低甲基化），可知获得的ICE鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。 27．（2024·北京海淀·一模）温度是影响微生物生长的重要因素， 科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 (1)大肠杆菌是一种常见的微生物， 常被改造为基因工程菌， 其原因包括 （写出2点）。 (2)为实现温度控制蛋白质合成， 科研人员设计了方案1， 构建表达载体（见图1）， 将其导入大肠杆菌， 获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖， 当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体， ， 因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。 (3)为更精准调控荧光蛋白表达， 将上述表达载体改造为方案 2中的载体（见图2）。与方案1相比， 方案2的主要优势是 。 (4)为检测方案2， 科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制见图3.依据方案2， 每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带，请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况， 在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色 。 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 (5)聚羟基脂肪酸酯（PHA） 常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB 和4HB 随机聚合， 或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5）， 其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5.请完善以下表格， 通过改造方案 2 以实现应用工程菌大规模生产优质 PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。 操作 目的 对方案 2表达载体的改造为： 。 将构建好的表达载体导入大肠杆菌， 获得工程菌。 获得可以合成PHA的工程菌。 以葡萄糖为原料配置培养基， 灭菌后加入上述工程菌。 配制培养基、接种。 控制发酵条件： 。 发酵48 小时， 获得3HB 比例为25%的嵌段共聚物。 【答案】(1)遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等 (2) 抑制启动子R，F蛋白不表达，解除F蛋白对启动子N的抑制 绿色 (3)30℃条件下减弱红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且降低对绿色荧光蛋白表达的抑制 (4) 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 红、绿、红、绿 红、绿 绿 (5) 将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因 30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）大肠杆菌是一种常见菌种，其结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，基因克隆表达系统成熟完善，转基因操作简单；大肠杆菌繁殖速度快，易于大规模培养等。 （2）据图1分析可知，当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。 （3）据图2分析可知，在N启动子之后增加了L蛋白基因，使其编码出L蛋白，进一步抑制启动子R，因此在30℃条件下，RFP基因无法表达出红色荧光蛋白，减弱因红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰，且进一步抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，降低对绿色荧光蛋白表达的抑制。 （4）据图分析可知，将工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制为37℃培养10小时，随后切换至30℃发酵14小时， 每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带。培养温度为37℃时，C基因编码的C蛋白没有形成二聚体，启动子R正常启动转录，F基因表达出F蛋白对启动子N的抑制，使L蛋白基因、GFP基因表达受抑制，同时RFP基因表达出红色荧光蛋白，培养温度为30℃时，培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，所以菌落生长2天后出现4个不同的荧光环带颜色为：环带1：红、绿、红、绿，环带2：绿、红、绿，环带3：红、绿，环带4：绿。 （5）据图分析获知，4HB由D酶、E酶催化合成，3HB由A酶、B酶催化合成，再经X酶催化合成嵌段共聚物，要想发酵48小时， 获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。对方案2表达载体的改造为：将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因构建表达载体并导入大肠杆菌， 获得工程菌，以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入获得的工程菌，将接种后的培养基在30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时，最后分离获取代谢产物。 28．（2024·北京东城·一模）EB病毒（EBV）可引发鼻咽癌等癌症。我国科研人员制备有效阻断EBV感染的单克隆抗体，为治疗和疫苗研发提供思路。 (1)如图1所示，EBV表面的糖蛋白gHgL与上皮细胞表面受体（如E2等）结合后，引起gB发生 变化，启动病毒包膜和上皮细胞膜融合。膜融合过程体现了膜具有 性。gHgL可作为制备有效阻断EBV感染的单克隆抗体的 。 (2)研究人员从EBV感染者外周血中分离出单个核细胞（PBMC），包含自然杀伤（NK）细胞、T细胞、B细胞。将下表中不同荧光标记的分子与PBMC培养后筛选出目标细胞，将目标细胞中的抗体mRNA 为cDNA，扩增出gHgL抗体基因，转入细胞成功表达出单克隆抗体。筛选出的目标细胞应具有荧光 （选填字母）。 不同荧光标记的分子 相关分子的特点 荧光A-抗CD4抗体 CD4为辅助性T细胞的标记分子 荧光B-抗CD8抗体 CD8为细胞毒性T细胞的标记分子 荧光C-抗CD20抗体 CD20为B细胞的标记分子 荧光D-抗CD56抗体 CD56为NK细胞的标记分子 荧光E-gHgL gHgL可与细胞上的受体特异性结合 (3)经筛选得到单抗D8，与已报道的单抗A1相比，两者都有较强的gHgL结合能力，都能显著抑制EBV病毒感染上皮细胞。将gHgL与D8或A1混合接触后，检测与上皮细胞表面受体E2的结合能力，结果如图2。 分析实验结果可知D8与A1作用的区别是 。 【答案】(1) 空间结构 流动 抗原 (2) 逆转录 C、E (3)D8能够阻碍gHgL和E2结合，而A1不能 【分析】单克隆抗体的特点是既能无限增殖、又能分泌大量抗体。 【详解】（1）依据图1可知，gB是上皮细胞膜的蛋白质，当EBV表面的糖蛋白gHgL与上皮细胞表面受体（如E2等）结合后，引起gB发生了空间结构的改变，启动病毒包膜和上皮细胞膜融合，这体现了膜的流动性。由于gHgL与上皮细胞表面受体结合，导致单克隆抗体的抗原就不能与受体结合，也就是说gHgL起到了阻断作用。 （2）cDNA的获得是mRNA通过逆转录形成的。根据gHgL的作用机理，可知筛选出的目标细胞分泌产生的抗体与B细胞构成竞争关系，同时其发挥作用需要膜膜上的受体特异性结合，故筛选出的目标细胞应具有荧光C和E。 （3）依据图示信息和题干内容可知，gHgL与D8混合接触后，与上皮细胞表面受体E2的结合能力明显下降，而与A1混合接触后，变化不大，说明D8与A1作用的区别是D8能够阻碍gHgL和E2结合，而A1不能。 29．（2024·北京东城·一模）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因 出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。    ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 （选填字母）。 ② 由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 （填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。    (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。    ① 欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5’端和3’端 。 ② 对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 【答案】(1)转录 (2) ad C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 (3) 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，东方果蝇中dsx基因（DNA）通过转录形成前体RNA。 （2）①用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad。 ②RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。而在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。 （3）①图2虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：  。 ②由题意可知：RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。 对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。 ⅳ：在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 30．（2024·北京石景山·一模）贝氏不动杆菌（A菌）是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，此过程被称为基因水平转移（HGT）。科学家试图利用A菌的HGT能力检测结肠癌。 (1)通常用含蛋白胨的培养基培养A菌，蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成 等物质（答出2个即可）。 (2)结肠癌常由KRAS基因中G12位点突变导致，科学家以其作为结肠癌检测点。 ①如图1所示，将针对KRAS基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，某种酶能从相同序列特定位点切断 键，修复过程中切口被重新连接，从而实现特定基因片段的替换，获得转基因癌细胞。 ②为验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，依据①中的原理，构建图2所示的表达载体，导入A菌中获得传感器A。将传感器A与转基因癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察传感器A在不同培养基中的生长情况。请从a～e中选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列 。 a．KRAS片段1 b．KRAS片段2 c．kanR d．specR（壮观霉素抗性基因） e．G12位点 能证明传感器A发生特异性HGT的实验结果是 。 (3)肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，观察生长情况。为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，并对图2所示表达载体进行进一步改造（如图3）。请分析其能检测出结肠癌的机理 。    【答案】(1)蛋白质、核酸（或ATP等） (2) 磷酸二酯 bda 能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成菌落 (3)若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA片段，会将传感器中的抑制基因替换，从而解除对卡那霉素抗性基因表达的抑制，使传感器可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成蛋白质（元素组成是C、H、O、N等）、核酸（或ATP等）（元素组成是C、H、O、N、P）。 （2）①分析题意，该过程的酶能够切断DNA，DNA的基本单位是脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，故该酶作用的位点是磷酸二酯键。 ②本次设计的目的是验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，需要将G12位点突变切除，然后再重新连接，结合图2启动子方向与图1的箭头方向可知，该过程中III对应的应是KRAS片段1，I是KRAS片段2，两者之间需要插入标记基因，可选择dspecR（壮观霉素抗性基因），故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列是bda；由于卡那霉素抗性基因被替换，而specR（壮观霉素抗性基因）导入，且A菌具有吸收特定DNA片段的能力，故能证明传感器A发生特异性HGT的实验结果是：能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成菌落。 （3）肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，结合图示可知，若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA片段，会将传感器中的抑制基因替换，从而解除对卡那霉素抗性基因表达的抑制，使传感器可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落。 31．（2024·北京丰台·一模）太谷核不育小麦是完全的雄性不育突变体，是国宝级的种质资源。它的花药的退化在减数分裂早期阶段开始，导致所有花药败育。 (1)小麦的太谷核不育和矮变一号均为单基因突变体，太谷核不育为高秆核不育，矮变一号为矮秆可育，株高基因用A、a表示，育性基因用R、r表示。为了获得矮秆核不育重组类型，进行以下实验： i．太谷核不育为母本与矮变一号杂交，得到F1一半为矮秆核不育，一半为矮秆可育； ⅱ．F1矮秆核不育为母本与野生型测交，得到矮秆可育152株和高秆核不育169株。 根据以上结果可知，太谷核不育和矮变一号的基因型分别为 ，两对等位基因的遗传 （符合/不符合）自由组合定律。 (2)重复上述实验并扩大数量，在得到的8374株测交子代中分离出14株矮秆不育株。进行细胞学检查发现，仅有1株为正常二倍体。请设计杂交实验验证该正常二倍体的矮秆不育株为所需类型，并预期子代的表现型及比例 。 (3)推测P基因就是使太谷核不育小麦败育的基因。以下事实支持该推测的是 。 A．显性的P基因一直处于杂合状态 B．P基因缺失或突变后小麦育性恢复 C．P基因的表达会引起转基因细胞的死亡 D．与核不育基因紧密连锁的分子标记与P基因也紧密连锁 E．P基因只在不育植株的花中表达，在可育植株中不表达 (4)为验证上述推测，研究人员在野生型小麦中获得了P等位基因的启动子，并发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列。然后利用Ti质粒构建表达载体，部分结构如下图所示，GFP表达后会发出绿色荧光。 将载体转入小麦幼胚，获得转基因植株，对植株表型和P基因表达情况进行鉴定。从a~i中选择填表。 a．Ubi（通用的强启动子）  b．P等位基因启动子  c．插入TRIM序列的P等位基因启动子  d．P编码区 e．P基因  f．无关基因  g．仅在花药发育S2期表达  h．在花药发育各时期均不表达 i．在根、茎、叶、雌蕊中均不表达 实验材料 转入载体组成Ⅰ Ⅱ 植株表型 P基因表达情况 核不育小麦 雄性不育 g i 野生型小麦 可育 h i 野生型小麦 ad 死亡 野生型小麦 ① ② g i 在存活的转基因小麦花药中特异性检测到绿色荧光。以上实验结果显示 ，导致雄性不育。 (5)矮秆核不育小麦是便利的遗传改良工具，请说明雄性不育在育种中优势 。 【答案】(1) aaRr、AArr 不符合 (2)用矮秆核不育（作为母本）与野生型杂交，子代矮秆核不育：高秆可育=1：1 (3)ABCDE (4) cd 雄性不育 TRIM插入引起启动子序列改变，导致P基因在花药发育的S2期表达 (5)杂交作母本省去人工去雄的麻烦；保留子代的杂种优势 【分析】1、自由组合定律的实质：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。 2、基因分离定律的实质：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；生物体在进行减数分裂形成配子时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配子遗传给后代。 【详解】（1）太谷核不育为母本与矮变一号杂交，得到F1一半为矮秆核不育，一半为矮秆可育，说明在株高方面，高秆为隐性，矮秆为显性，则关于株高性状，太谷核不育基因型为aa，矮变一号基因型为AA；核不育：可育=1:1，说明亲本太谷核不育基因型为Rr，矮变一号rr，综上所述，太谷核不育的基因型是aaRr，矮变一号的基因型AArr。F1矮秆核不育基因型为AaRr，其为母本与野生型测交，得到矮秆可育：高秆核不育≈1:1，不符个1:1:1:1的变式，因此两对等位基因的遗传不符合自由组合定律。 （2）该正常二倍体的矮秆不育株为所需类型则其基因型为AaRr，且两对基因不遵循基因的自由组合定律，因此该矮秆核不育作为母本与野生型杂交，子代矮秆核不育：高秆可育=1：1。 （3）A、P基因就是使太谷核不育小麦败育的基因，不育形状为显性性状，存在P基因使小麦不育只能作母本，不含有P基因时小麦可育，可作父本，因此显性的P基因一直处于杂合状态，A正确； B、P基因存在时小麦败育，P基因缺失或突变后小麦育性恢复，B正确； C、P基因的表达会引起转基因细胞的死亡，进而导致小麦败育，C正确； D、若P基因就是使太谷核不育小麦败育的基因，则与核不育基因紧密连锁的分子标记与P基因也紧密连锁，都在同一条染色体上，D正确； E、可育植株中不存在P基因，因此P基因只在不育植株的花中表达，在可育植株中不表达，D正确。 故选ABCDE。 （4）由表中数据可知，核不育小麦中，P基因的表达情况为g仅在花药发育S2期表达，i在根、茎、叶、雌蕊中均不表达；野生型小麦中，P基因表达情况为h在花药发育各时期均不表达，i在根、茎、叶、雌蕊中均不表达。野生型小麦中，转入载体中存在Ubi和P编码区，小麦死亡；由题干信息可知，所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，因此若想是野生型小麦中，P基因的表达情况与核不育小麦相同，则应选择的启动子为c即插入TRIM序列的P等位基因启动子 ，且需要与荧光蛋白基因连接，Ⅱ处应为P编码区，综上所述，野生型小麦转入载体组成Ⅰ为c，Ⅱ为d；植株表现为雄性不育。在存活的转基因小麦花药中特异性检测到绿色荧光，说明TRIM插入引起启动子序列改变，导致P基因在花药发育的S2期表达，导致雄性不育。 （5）雄性不育在育种中优势为杂交作母本省去人工去雄的麻烦；保留子代的杂种优势。 32．（2024·北京丰台·一模）研究人员利用水稻突变体对相关基因进行研究。 (1)将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养，外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，获得水稻突变体库。该突变体库中包含株高、叶色、叶型、育性、分蘖数等明显性状改变，构建该突变体库的过程中，引起性状改变的原因可能有______ A．实验操作中其它微生物的污染 B．实验过程中偶然接触紫外线或化学药品 C．DNA复制过程中的DNA序列变化 D．外源T-DNA的插入导致DNA序列变化 E．组织培养过程中染色体的互换 (2)对突变体库进行自交和表型筛选获得纯合的早衰突变体。为研究早衰突变与T-DNA整合之间的关系，将纯合的早衰突变体与“中花11”回交之后，分析F2的性状分离情况和对bar基因的PCR检测结果： ①若F2的正常植株：早衰植株=3：1，则突变体的早衰性状是由 控制的； ②若F2的所有植株中含bar基因与不含bar基因之比为3：1，则T-DNA是单个插入； ③若F2的 ，则该突变为T-DNA插入引起。 经检验，实验结果与预期相符。请在下图中标出bar基因（用表示）可能的位置 。 (3)为获得该衰老相关基因，研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增，主要过程见下图。外源接头包括长单链接头和短单链接头，二者部分互补。以长单链接头的部分序列为引物a和b，根据T-DNA已知序列设计引物c、d、e、f。 实验的主要流程为：用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链，再以 为引物合成互补链，得到PCR产物1→为减少非特异性扩增，以 为引物进行PCR得到产物3（同理得到产物2和产物4）→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。 (4)引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和 等。该研究为延缓水稻衰老、提高水稻产量提供了理论依据。 【答案】(1)ABCD (2) 隐性单基因 早衰突变体全部具有bar基因 (3) a bc (4)基因的表达 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）生物的性状是由基因和环境共同影响的，将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养，外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，该过程中实验操作中其它微生物的污染、实验过程中偶然接触紫外线或化学药品都可能导致基因改变，DNA复制过程中若出现差错导致DNA序列变化、外源T-DNA的插入导致DNA序列变化都会引起DNA改变，而组织培养过程进行的是有丝分裂，染色体的互换（同源染色体非姐妹染色单体之间交换）发生在减数分裂过程中，ABCD正确，E错误。 故选ABCD。 （2）①若F2的正常植株：早衰植株=3：1，分离比符合一对等位基因控制的情况，即符合分离定律，且的表现为1/4的突变体的早衰性状是隐性性状，即突变体的早衰性状是由隐性单基因控制的。 ③若突变为T-DNA插入引起，由于外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，则后代性状都会发生改变，即F2的早衰突变体全部具有bar基因；经检验，实验结果与预期相符，则bar基因应插入到衰老相关基因片段上，故可绘制图形如下： （3）PCR能够实现体外扩增DNA，分析题意，为获得该衰老相关基因，研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增，实验的主要流程为：用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链（上面那条连扩增左半部分），再以a为引物合成互补链（结合右侧长单链结构与下侧图示顺序可知，且引物与模板的3'端结合），得到PCR产物1→为减少非特异性扩增，以bc为引物进行PCR得到产物3（同理得到产物2和产物4）→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。 （4）植物生命活动的调控是基因、环境和激素共同影响的， 引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和基因的表达等。 33．（23-24高三下·北京平谷·阶段练习）学习以下材料，回答（1）-（5）问题。 中心法则中的RNA通常指的是能够编码蛋白质的mRNA，但细胞中有许多不编码蛋白质的RNA-非编码RNA，但对细胞生命活动有调控作用。微小RNA（miRNA）是一种真核细胞中广泛存在的短链非编码RNA，长度为17~25个核苷酸。miRNA通常与mRNA的3'端非编码区结合，抑制依赖该mRNA的蛋白质翻译或促进靶标mRNA的降解，从而在转录后水平上调控基因的表达。当人体内某些miRNA功能失调时，疾病就可能发生。 前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤。已发现去乙酰化酶（SIRT）在前列腺癌的发生发展过程中有重要作用。研究推测在前列腺癌细胞CW中miRNA对SIRT基因有转录后调控作用。研究者利用数据库对SIRT基因3'端非编码区进行分析，发现19个可能的miRNA作用的靶标位点（如图1A），依据这些靶标位点的分布构建了4个截断片段（如图1B）。分别将这4个截断片段连接到P载体-荧光素酶基因F下游处，构建重组载体，并分别转入到CW细胞中，检测F的蛋白表达水平。结果如图2。 免疫原性是指能够刺激机体，使免疫细胞活化、增殖、分化而产生特异性抗体。由于miRNA分子无免疫原性，被认为是具有临床治疗应用前景的分子，但miRNA分子递送效率低，限制了其疗效。结合新型靶向基因递送系统可为前列腺癌的基因靶向治疗提供新型手段和药物来源。为研发靶向治疗肿瘤的RNA疫苗提供广阔的应用前景。 (1)miRNA与mRNA的3'端非编码区通过 原则互补结合，从而在转录后水平上调控基因的表达。 (2)P载体上有荧光素酶基因F，将SIRT基因3'端非编码区域片段连接到P载体的F下游，获得重组载体P-F-SIRT，转入CW细胞中，检测荧光素酶F的mRNA水平及蛋白质水平，如图3所示。实验发现：SIRT3'端非编码区域存在转录后调控区域，依据是 。 (3)结合图1和图2分析，SIRT基因3'端非编码 片段可能是miRNA靶位点，原因是 。 (4)结合全文的信息，下列说法正确的有____。 A．miRNA结构稳定性差，易降解 B．miRNA编码蛋白引起细胞免疫排斥 C．可调控miR-34a或miR124靶向治疗前列腺癌 D．miRNA可用脂质载体递送到细胞内 (5)你认为本文介绍的miRNA调控转录是否属于表观遗传学？请陈述原因 。 【答案】(1)碱基互补配对 (2)与对照组相比，实验组的FmRNA水平没有显著变化，而F蛋白水平降低 (3) 901-1300 CW细胞中miRNA与901-1300核苷酸片段结合，抑制了表达载体中F与SIRT基因mRNA的翻译或促进降解 (4)ACD (5)属于表观遗传学，基因的碱基序列保持不变，基因的表达和表型发生可以遗传变化 【分析】1、生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象，叫作表观遗传。表观遗传能 够使生物体在基因的碱基序列不变的情况下发生可遗传的 性状改变。 2、中心 法则：遗传信息可以从DNA流向DNA， 即DNA的复制；也可以从DNA流向RNA，进而流向蛋白 质，即遗传信息的转录和翻译。 【详解】（1）在DNA分子中，A（腺嘌呤）一定与T（胸腺嘧啶）配对；G（鸟嘌呤） 一定与C（胞嘧啶）配对，碱基之间的这种一一对应的关 系，叫作碱基互补配对原则；miRNA与mRNA的3'端非编码区通过碱基互补配对原则互补结合，从而在转录后水平上调控基因的表达。 （2）题干信息：RNA通常指的是能够编码蛋白质的mRNA，但细胞中有许多不编码蛋白质的RNA-非编码RNA，但对细胞生命活动有调控作用；由图3可知，与对照组相比，实验组的FmRNA水平没有显著变化，而F蛋白水平显著降低，说明SIRT3'端非编码区域存在转录后调控区域。 （3）图2可知，SIRT 901-1300核苷酸对应的F蛋白表达水平最低，可推测CW细胞中miRNA与901-1300核苷酸片段结合，抑制了表达载体中F与SIRT基因mRNA的翻译或促进降解，故SIRT基因3'端非编码901-1300核苷酸可能是miRNA靶位点。 （4）A、miRNA是单链，其miRNA分子递送效率低，可见其结构稳定性差，易降解，A正确； B、题干信息可知，miRNA分子无免疫原性，被认为是具有临床治疗应用前景的分子，可见miRNA编码蛋白不会引起细胞免疫排斥，B错误； C、题干信息：新型靶向基因递送系统可为前列腺癌的基因靶向治疗提供新型手段和药物来源，可知可调控miR-34a或miR124靶向治疗前列腺癌，C正确； D、miRNA分子递送效率低，miRNA可用脂质载体递送到细胞内，D正确。 故选ACD。 （5）生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象，叫作表观遗传。可见本文介绍的miRNA调控转录属于表观遗传学。 34．（23-24高三下·北京延庆·阶段练习）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，期望用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。 (1)科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，如下图。    ①利用来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子Tcl42作为“开关”构建温控抑制元件，在 （选填“λ噬菌体”、“大肠杆菌”或“人”）中具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL；当控温至42℃时才开启特定基因的表达。 ②Tcl42开关仅在加热时瞬时激活特定基因，而免疫疗法需要数周才能见效，所以设计了“基因电路”——一次短暂的温度激活后可维持长期的基因表达。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型αPD-L1蛋白基因（该蛋白可用免疫治疗）等。 请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线： 及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL → → 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） → → 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。 A、重组酶Bxb1基因不表达      B、菌体升温至42℃时 C、用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件 D、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录 E、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组 (2)科研人员用 处理大肠杆菌，使其处于感受态，从而将“基因电路”质粒导入菌体内，经过培养、涂布后，筛选 （选项），由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌（EcT）。 A、含有四环素的培养基上形成的菌落        B、具有绿色荧光的菌落 C、同时具有A和B特征的菌落             D、具有A或B特征的菌落均可 (3)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，选取若干组生理状态相近的小鼠，经过7天的成瘤建模后，分别进行如下处理，并检测记录小鼠体内肿瘤体积。 第1组：注射生理盐水，2天后FUS处理； 第2组：注射温控工程菌，2天后FUS处理。请评价并完善实验方案 。 最终证明温控工程菌可被FUS处理局部激活，并具有持续性肿瘤免疫治疗效果。 (4)若期望将上述温控工程菌用于临床实验，还需利用小鼠开展 方面的研究。 【答案】(1) 大肠杆菌 C A B E D (2) Ca2+ A (3)该实验方案无法排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，应增设温控工程菌在未热激活状态的对照组 (4)温控工程菌或温控工程菌 +FUS对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系统等）的影响；与现行临床药物相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS处理部位是否有非特异性激活 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）①“基因电路”的技术路线实验的目的是利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的大肠杆菌质粒系统，因此，使Tcl42持续性表达的具强活性的启动子pLac应该来自大肠杆菌。 ②“基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题意，当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一个表达单位的重组酶Bxb1基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1基因不表达，则αPD-L1不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制，重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组，启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录。从而使细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：C、用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL →A、重组酶Bxb1基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →B、菌体升温至42℃时→ 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→E、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组→D、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。 （2）在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将“基因电路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可含有四环素的培养基来筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落，A符合题意，BCD不符合题意。 故选A。 （3）依题意，该实验的目的是验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，但若按照题意实验，则无法排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，因此，应增设一组温控工程菌在未热激活状态的对照组。 （4）若期望将上述温控工程菌用于临床实验，则还要检验工程菌的优势、作用效果、安全性等方面的影响实验。因此，还需利用小鼠开展温控工程菌或温控工程菌 +FUS对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系统等）的影响；与现行临床药物相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS处理部位是否有非特异性激活方面的研究。 35．（23-24高三上·北京东城·期末）为监测与记录体内细胞间通讯，我国科研人员建立了一种新的系统，利用转基因技术经筛选获得转基因小鼠（gL），以揭示正在进行的细胞与细胞之间的接触情况。 (1)gL小鼠中细胞—细胞接触的信号通路如图。将绿色荧光蛋白（GFP）设计为信号分子，αGFP-N-tTA融合蛋白为 ，完成细胞间的信息交流。利用转基因技术获得以心肌细胞作为信号发送细胞的转基因小鼠，为保证在心肌细胞中特异性表达GFP，表达载体中应含有 。将构建好的表达载体导入小鼠的 中，同理获得内皮细胞特异性表达αGFP-N-tTA的转基因小鼠，将上述两种转基因小鼠杂交，经筛选获得gL小鼠。    (2)如图，在gL小鼠中，科研人员使用LacZ基因作为报告基因。当内皮细胞与心肌细胞接触时，由于GFP和aGFP-N-tTA结合，引起 ，进入细胞核与tetO结合，启动LacZ基因表达，使正在与心肌细胞接触的内皮细胞呈蓝色。 (3)研究人员进一步构建gT小鼠，以实现体内所有与心肌细胞有过接触的内皮细胞都持续发出红色荧光。请利用以下实验材料，完善制备gT小鼠的技术路线。 DNA序列 loxP：该序列中有Cre酶的识别位点，loxP本身不影响附近的DNA序列的功能 Cre：编码的酶进入细胞核后作用于loxP，导致两个loxP中间的DNA片段丢失 STOP：转录终止序列 Pc：持续表达强启动子 tetO：tTA识别和结合序列，结合后启动下游基因的表达 RFP：红色荧光蛋白基因 小鼠品系 a。内皮细胞特异性表达aGFP-N-tTA的转基因小鼠 b。野生型小鼠    (4)在gT小鼠胚胎发育早期，观察到部分内皮细胞发出红色荧光。随着胚胎发育的进行，观察到肝脏中很大一部分血管也呈现红色，这表明 。 【答案】(1) 受体 心肌细胞中特异表达基因的启动子 受精卵 (2)受体被切断，tTA被释放 (3)   (4)胚胎发育早期接触过心肌的内皮细胞会迁移到肝脏，参与形成肝脏的血管 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2、实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。 3、基因表达载体是载体的一种，应包含目的基因、标记基因、启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。 【详解】（1）依题意，GFP与αGFP-N-tTA融合蛋白结合，完成细胞间的信息交流，GFP为信息分子，则αGFP-N-tTA融合蛋白为受体。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。因此，为保证在心肌细胞中特异性表达GFP，表达载体中应含有心肌细胞中特异表达基因的启动子。动物细胞不能体现细胞的全能性，要获得小鼠个体，只能由受精卵发育而成。因此，基因表达载体应导入小鼠的受精卵中。 （2）据图可知，GFP和aGFP-N-tTA结合后，αGFP-N-tTA融合蛋白位于的信号接收细胞获得信息，细胞作出反应把受体切断，使tTA被释放，进入细胞核与tetO结合，启动LacZ基因表达，使正在与心肌细胞接触的内皮细胞呈蓝色。 （3）实验目的是构建gT小鼠，以实现体内所有与心肌细胞有过接触的内皮细胞都持续发出红色荧光。gT小鼠要发出红色荧光，则应向受体细胞内导入RFP，且RFP要在内皮细胞内特异性表达，还要有控制其特异性的表达的启动子。依题意可知，题目只提供了Pc持续表达强启动子，没有控制其特异性的表达的启动子，因此还要构建一个能控制RFP在内皮细胞特异性表达的机制。由图示可知GFP和αGFP-N-tTA结合后，αGFP-N-tTA融合蛋白位于的信号接收细胞获得信息，使tTA被释放，进入细胞核与tetO结合，启动下游基因表达。可以利用这个细胞与细胞之间的通信来控制RFP的表达。根据以上分析要选择a内皮细胞特异性表达αGFP-N-tTA的转基因小鼠作为受体鼠。把Pc、loxP、STOP序列按流程图中顺序连接，再连接上RFP，构成成一个表达载体；另把Cre连接在tetO之后，构建另一个表达载体，同时导入a内皮细胞特异性表达αGFP-N-tTA的转基因小鼠。整个流程如图所示：   最后获得的gT小鼠内皮细胞膜上表达出的αGFP-N-tTA融合蛋白，心肌细胞膜上表达出的绿色荧光蛋白，两细胞相接，GFP和αGFP-N-tTA结合后，αGFP-N-tTA融合蛋白位于的信号接收细胞获得信息，使tTA被释放，进入细胞核与tetO结合，激活连接其后的Cre表达出相应酶，该酶进入细胞核后作用于loxP，导致两个loxP中间的STOP片段丢失，Pc控制连接其后的RFP持续表达，使与心肌细胞相接触的内皮细胞持续表达出红色荧光蛋白，达到实验目的。 （4）在gT小鼠胚胎发育早期，观察到部分内皮细胞发出红色荧光。随着胚胎发育的进行，观察到肝脏中很大一部分血管也呈现红色，这表明胚胎发育早期接触过心肌的内皮细胞会迁移到肝脏，参与形成肝脏的血管。 36．（23-24高三上·北京朝阳·期末）为研究胰腺A蛋白的生理功能，科研人员利用基因工程技术构建了A基因胰腺特异性敲除模型小鼠。 (1)利用如图载体构建A基因中有LoxP序列的小鼠。图中载体与A基因颜色相同的区域序列相同。通过同源臂使载体与A基因上的对应相同序列发生片段互换，将LoxP整合到A基因上得到A′基因，A′基因与A基因功能相同。 将载体导入 （细胞）中，获得了基因型为AA′的杂合鼠。 (2)来自于噬菌体的Cre酶可将它所在细胞中含LoxP序列的基因敲除。研究人员将Cre酶基因与特异性启动子拼接，使其仅在小鼠胰腺细胞中表达。胰腺细胞特异表达Cre酶的小鼠称为C鼠。 以下是利用AA′杂合鼠和C鼠杂交获得A基因胰腺特异性敲除鼠的操作过程，并利用小鼠尾部细胞检测杂交后代基因型。（注：A和Cre酶基因位于小鼠的不同染色体上） ①第一批杂交：AA′鼠分别与AA′鼠、C鼠杂交，在子一代中筛选，获得两类鼠：A′A′鼠和 鼠。 ②第二批杂交：将第一批杂交筛选获得的两类鼠进行一次杂交，获得多只小鼠，其中含有A基因胰腺特异性敲除小鼠。利用PCR的方法检测这些小鼠尾部细胞的基因型，引物（P1~P6）及产物电泳结果如下图所示。 得到B图甲的电泳结果，A图P1~P4中应选择的一对引物是 。其中1、2为对照；3—10号小鼠中，含A基因的有 ，可实现A基因胰腺特异性敲除的有 。 (3)将纯合A′A′鼠（无Cre酶）与第二批杂交筛选得到的A基因胰腺特异性敲除的小鼠进行杂交，出生的后代有、无Cre酶的小鼠数量之比接近 时，说明胰腺中A基因特异性敲除的小鼠可正常出生，无胚胎致死；利于在后续研究中应用。 【答案】(1)受精卵 (2) 基因型为AA'的C鼠（有Cre酶基因的AA'鼠） P1、P3 3、4、7、8 5、10 (3)1:1 【分析】基因工程的四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 【详解】（1）小鼠是动物，所以在基因工程操作程序中，常利用受精卵作为受体细胞，可以获得基因型为AA′的杂合鼠。 （2）AA′鼠与AA′鼠杂交，理论上AA鼠:AA′鼠:A′A′鼠=1：2：1，AA′鼠与C鼠杂交，可获得AA′鼠，该鼠含有Cre酶。因为实验目的是A基因胰腺特异性敲除模型小鼠，所以经过筛选后，获得A′A′鼠和含有Cre酶的AA′鼠。 第一批杂交筛选获得的两类鼠进行一次杂交，用就是用A′A′鼠和含有Cre酶的AA′鼠杂交，后代鼠的类型有：①Cre酶基因的AA'鼠②AA'鼠③Cre酶基因的A'A'鼠④A'A'鼠。含有基因胰腺特异性敲除小鼠为Cre酶基因的A'A'鼠（因为Cre酶可将含LoxP序列的基因敲）。 由于图中载体与A基因颜色相同的区域序列相同，所以要区分A和A'，一定要找到特异性的引物，用P1和P3为引物，扩增出的序列中含有LoxP，则说明是A'基因，若不含有LoxP，则说明是A基因。通过电泳图甲可以看出，3-10分别是AA'鼠、AA'鼠、Cre酶基因的A'A'鼠、A'A'鼠、Cre酶基因的AA'鼠、AA'鼠、A'A'鼠、Cre酶基因的A'A'鼠。因此含A基因的有3、4、7、8，可实现A基因胰腺特异性敲除的有5、10。 （3）A′A′鼠（无Cre酶）和A基因胰腺特异性敲除的小鼠（Cre酶基因的A'A'鼠）杂交，A′A′鼠（无Cre酶）只产生一种类型的配子A′，Cre酶基因的A'A'鼠产生A′和A′C，雌雄配子随机结合后，A′A′鼠：Cre酶基因的A'A'鼠=1:1，说明胰腺中A基因特异性敲除的小鼠可正常出生，无胚胎致死；利于在后续研究中应用。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题18 基因工程 五年考情 考情分析 基因工程 2024年北京卷第20题 2023年北京卷第 21题 2022年北京卷第21 题 2021年北京卷第20 题 2021年北京卷第 21题 2020年北京卷第12 题 2020年北京卷第 17题 通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，PCR技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。 1、（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 （1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生___________的过程称为细胞分化，分化是基因___________的结果。 （2）对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A. 增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B. 增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C. 一个增强子只能作用于一个基本启动子 D. 很多增强子在不同组织中的活性不同 （3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测___________。 （4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称_____（略）。 2、（2023·北京·高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。    (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。 3、（2022·北京·高考真题）．生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。 (2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子： 。 ①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ.基因： A．GFP    B．Gal4    C．雌激素受体基因（ER）  D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） (4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后 造成不育。 (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。 4、（2021·北京·高考真题）玉米是我国重要的农作物，研究种子发育的机理对培育高产优质的玉米新品种具有重要作用。 (1)玉米果穗上的每一个籽粒都是受精后发育而来。我国科学家发现了甲品系玉米，其自交后的果穗上出现严重干瘪且无发芽能力的籽粒，这种异常籽粒约占1/4。籽粒正常和干瘪这一对相对性状的遗传遵循孟德尔的 定律。上述果穗上的正常籽粒均发育为植株，自交后，有些植株果穗上有约1/4干瘪籽粒，这些植株所占比例约为 。 (2)为阐明籽粒干瘪性状的遗传基础，研究者克隆出候选基因A/a。将A基因导入到甲品系中，获得了转入单个A基因的转基因玉米。假定转入的A基因已插入a基因所在染色体的非同源染色体上，请从下表中选择一种实验方案及对应的预期结果以证实“A基因突变是导致籽粒干瘪的原因” 。 实验方案 预期结果 I．转基因玉米×野生型玉米 II．转基因玉米×甲品系 III．转基因玉米自交 IV．野生型玉米×甲品系 ①正常籽粒：干瘪籽粒≈1：1 ②正常籽粒：干瘪籽粒≈3：1 ③正常籽粒：干瘪籽粒≈7：1 ④正常籽粒：干瘪籽粒≈15：1 (3)现已确认A基因突变是导致籽粒干瘪的原因，序列分析发现a基因是A基因中插入了一段DNA（见图1），使A基因功能丧失。甲品系果穗上的正常籽粒发芽后，取其植株叶片，用图1中的引物1、2进行PCR扩增，若出现目标扩增条带则可知相应植株的基因型为 。 (4)为确定A基因在玉米染色体上的位置，借助位置已知的M/m基因进行分析。用基因型为mm且籽粒正常的纯合子P与基因型为MM的甲品系杂交得F1，F1自交得F2。用M、m基因的特异性引物，对F1植株果穗上干瘪籽粒（F2）胚组织的DNA进行PCR扩增，扩增结果有1、2、3三种类型，如图2所示。 统计干瘪籽粒（F2）的数量，发现类型1最多、类型2较少、类型3极少。请解释类型3数量极少的原因 。 5、（2021·北京·高考真题）近年来发现海藻糖-6-磷酸（T6P）是一种信号分子，在植物生长发育过程中起重要调节作用。研究者以豌豆为材料研究了T6P在种子发育过程中的作用。 (1)豌豆叶肉细胞通过光合作用在 中合成三碳糖，在细胞质基质中转化为蔗糖后运输到发育的种子中转化为淀粉贮存。 (2)细胞内T6P的合成与转化途径如下： 底物T6P海藻糖 将P酶基因与启动子U（启动与之连接的基因仅在种子中表达）连接，获得U-P基因，导入野生型豌豆中获得U-P纯合转基因植株，预期U-P植株种子中T6P含量比野生型植株 ，检测结果证实了预期，同时发现U-P植株种子中淀粉含量降低，表现为皱粒。用同样方法获得U-S纯合转基因植株，检测发现植株种子中淀粉含量增加。 (3)本实验使用的启动子U可以排除由于目的基因 对种子发育产生的间接影响。 (4)在进一步探讨T6P对种子发育的调控机制时，发现U-P植株种子中一种生长素合成酶基因R的转录降低，U-S植株种子中R基因转录升高。已知R基因功能缺失突变体r的种子皱缩，淀粉含量下降。据此提出假说：T6P通过促进R基因的表达促进种子中淀粉的积累。请从①~⑤选择合适的基因与豌豆植株，进行转基因实验，为上述假说提供两个新的证据。写出相应组合并预期实验结果 。 ①U-R基因    ②U-S基因    ③野生型植株④U-P植株    ⑤突变体r植株 6、（2020·北京·高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 7、（2020·北京·高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是 。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。（举一例） 一、单选题 1．（2024·北京·模拟预测）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是（    ）    A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒 B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因 C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒 D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功 2．（2024·北京东城·二模）为更有效地处理含重金属的废水，研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端，且无合适的限制酶识别序列，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是（    ） A．不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码了和终止密码子 B．将目的基因插入载体P时，应选择SmaI进行酶切，再用DNA连接酶连接 C．构建表达载体时，应选择XhoI和PstI酶切载体E和含目的基因的载体P D．基因表达载体构建完成后，需利用农杆菌转化法导入受体细胞 3．（2024·北京昌平·二模）下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ）    A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 4．（2024·北京西城·二模）为加速绿色荧光蛋白基因（GFP）进化，快速获得荧光强度更高的GFP蛋白，科研人员将DNA1（编码易错DNA聚合酶）和DNA2共同导入大肠杆菌（如图）。下列说法错误的是（    ）    A．用卡那霉素筛选含DNA1的大肠杆菌 B．易错DNA聚合酶催化GFP基因复制 C．GFP基因在此复制过程中突变率升高 D．连续传代并筛选强荧光菌落加速GFP进化 5．（2024·北京丰台·二模）为研究玉米的抗逆机制，科研人员利用图中的双分子荧光互补技术分析玉米M5与B72蛋白的相互作用。下列说法正确的是（　　） A．直接将YFP剪切为N端和C端后，分别与M5和B72蛋白连接 B．设计特异性引物以玉米cDNA为模板扩增M5和B72基因 C．将M5和B72基因融合后连接到质粒上的YFP基因中 D．将含有M5和B72的基因表达载体分别导入不同细胞中 6．（2024·北京丰台·二模）CAR-T细胞免疫疗法是将从患者体内提取的T细胞通过基因工程改造，使其表达肿瘤嵌合抗原受体（CAR），大量扩增后输回患者体内以清除癌细胞。下列有关说法错误的是（　　） A．CAR-T疗法的T细胞来源于细胞毒性T细胞 B．该疗法利用了细胞免疫和基因重组的基本原理 C．CAR-T细胞清除癌细胞的过程属于细胞坏死 D．CAR-T细胞上的CAR能够精准识别癌细胞 7．（2024·北京海淀·一模）双向启动子可同时结合两个 RNA聚合酶来驱动下游基因的表达， 研究人员构建了下图所示的表达载体， 以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是（    ） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS 基因， 需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加潮霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 8．（2024·北京朝阳·一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。    下列相关分析不正确的是（　　） A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因 B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接 C．扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列 D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果 9．（2024·北京朝阳·一模）F基因突变可引发人类某种单基因遗传病。以下图1为该遗传病的家系图谱，图2为用限制酶M处理家系成员的F基因后，进行电泳的部分结果。 下列叙述不正确的是（　　） A．突变的F基因序列中存在一个限制酶M的酶切位点 B．该遗传病的致病基因是位于X染色体上的隐性基因 C．Ⅲ-1的F基因经M酶切后电泳检测结果与I-2一致 D．若Ⅱ-1与Ⅱ-2再生育，生出患病孩子的概率为1/4 10．（2024·北京丰台·一模）V蛋白对登革热病毒的增殖有抑制作用。V蛋白含有285个氨基酸，其cDNA长1241bp。将V蛋白在大肠杆菌中诱导表达，经纯化后免疫小鼠，最终获得5株分泌V单抗的杂交瘤细胞，提取单抗与V蛋白杂交，电泳结果如下图，相关叙述错误的是（    ） A．V蛋白的cDNA中含有不编码V蛋白的序列 B．获得的5株杂交瘤细胞都能无限增殖 C．用V蛋白免疫小鼠的目的是获得相应抗体 D．可培养5A8杂交瘤细胞大量生产单克隆抗体 11．（2024·北京东城·一模）西北牡丹在白色花瓣基部呈现色斑，极具观赏价值。研究发现，紫色色斑内会积累花色素苷。PrF3H基因控制花色素苷合成途径中关键酶的合成。如图，分别提取花瓣紫色和白色部位的DNA，经不同处理后PCR扩增PrF3H基因的启动子区域，电泳检测扩增产物。分析实验结果可以得出的结论是（　　） A．花瓣紫色与白色部位PrF3H基因的碱基序列存在差异 B．白色部位PrF3H基因启动子甲基化程度高于紫色部位 C．PrF3H基因启动子甲基化程度高有利于花色素苷合成 D．启动子甲基化可调控基因表达说明性状并非由基因控制 12．（2024·北京西城·一模）图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是（    ）    A．PCR扩增A时可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 13．（2024·北京石景山·一模）蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 14．（2024·北京密云·模拟预测）研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（　　）    A．过程①一般需要用促性腺激素处理 B．过程②是在雌鼠a的输卵管内完成 C．过程③需将表达载体注射到子宫中 D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥 15．（23-24高三下·北京延庆·阶段练习）研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（    ）    A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程 B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器 C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色 16．（23-24高三上·北京朝阳·期末）毕赤酵母是一种高效的分泌蛋白表达系统，能用于大量生产外源蛋白质。以下说法正确的是（    ） A．毕赤酵母属于基因工程常用的载体 B．可用显微注射法将目的基因导入毕赤酵母 C．可用DNA分子杂交技术检测目的基因是否成功表达 D．用毕赤酵母表达系统生产外源蛋白质可不必裂解酵母菌 二、非选择题 17．（2024·北京西城·二模）裸鼹鼠几乎不得癌症，其寿命可超过30年，同样大小的家鼠最长寿命为4年。为探究其原因，科研人员做了以下研究。 (1)将裸鼹鼠皮肤成纤维细胞置于 培养箱进行体外培养，经检测发现其分泌大量粘稠的高分子量透明质酸（HA），可抑制细胞过度增殖。 (2)研究者检测不同来源成纤维细胞中HA合成酶（HAS）的含量，结果如图1。另外，发现裸鼹鼠组织的HA降解酶（HAase）的活性远低于人和小鼠。结合图文信息，分析裸鼹鼠皮肤成纤维细胞分泌大量高分子量HA的原因是 。 结果显示，裸鼹鼠胚胎期HA合成酶低表达，推测其意义是 。 (3)为进一步研究高分子量HA能否提高小鼠的寿命，研究人员进行了下列实验（图2）。 NeoR：新霉素抗性基因；nmrHas2：裸鼹鼠 HA 合成酶 2 基因；CE：cre 重组酶-雌激素受体融合基因      注：启动子仅启动相邻基因的表达 ①通过转基因技术获得转基因小鼠A：为了将目的基因插入小鼠6号染色体的特定位点，需在其两端设计与6号染色体同源序列，实现同源序列之间的重组。由此获得的转基因小鼠A暂时无法表达HA合成酶2，原因是 。 ②B鼠为导入表达CE的纯合子，CE也插入6号染色体的相同位点。外源雌激素可诱导cre重组酶活化，活化的cre重组酶能识别并切除loxP位点间的序列。A、B鼠交配获得C、D鼠，请画出C鼠的基因组成情况 。 ③利用C、D鼠进行实验，测得实验组小鼠HA含量升高，癌症概率降低、炎症反应减少，寿命也得到了延长。请写出对照组的选材 （“C”或“D”）及实验处理。 (4)请简述本研究的应用前景 。 18．（2024·北京通州·模拟预测）桑蚕的性别决定类型为ZW型，桃蚕食桑少、出丝率高，但在幼蚕阶段不易区分，研究人员利用基因工程技术对桑蚕进行改造，以实现蚕农只饲养雄蚕的愿望。 (1)建构TT’杂合雄蚕品系 研究发现，位于常染色体上的T基因，缺失后（基因型可表示为tt）会导致桑蚕胚胎停育。科研人员构建图1中的载体、应用 法将其导入雄蚕受精卵中，使载体与T基因两侧的同源区段发生重组，从而实现对T基因区段的替换，得到基因型为TT'的杂合雄蚕品系。    (2)构建特异性表达Cre酶的雌蚕品系 Cre酶可以特异性识别LoxP位点，从而将LoxP位点间的DNA片段进行切除。研究人员将胚胎发育后期启动子与Cre酶基因定点整合到W染色体上，构建了基因型为TT且特异性表达Cre酶的雌蚕品系。 ①将该品系与TT’杂合雄蚕杂交，当F1桑蚕胚胎发育至后期时，T’基因存在于 （选填“雄蚕”“雄蚕”“雌蚕和雄蚕”）中，会表现出绿色荧光的占F1桑蚕的 。 ②为对特异性表达Cre酶的雌蚕品系进行保持，科研人员在F1中筛选出Tt的雌蚕与TT’的雄蚕进行后续杂交，并利用图2中的引物对F2桑蚕的早期胚胎进行了PCR检测，结果如图3所示。      结合以上结果，在1~6号桑蚕的早期胚胎中，会发育为雄性的是 , 号桑蚕胚胎可能发生停育。 ③科研人员认为，F2桑蚕发育为幼虫后，仍然只有雄蚕可以呈现绿色荧光，你同意吗?请说明理由。 (3)结合以上桑蚕的分子育种方法，你认为以下说法正确的为 。 A．F1桑蚕的雌蚕幼虫中存在致死个体 B．F2桑蚕中胚胎致死的个体占雌蚕的1/4 C．F2桑蚕中雄蚕有4种基因型 D．该技术可以实现某基因的定点敲除 19．（2024·北京东城·二模）乳酸是一种需求量较大的工业原料，科研人员欲对酿酒酵母进行改造以进行乳酸生产。 (1)培养基中的葡萄糖可作为 为酿酒酵母提供营养。如图1，酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后，无氧条件下发酵产物为 ，通过敲除丙酮酸脱羧酶基因获取高产乳酸的工程菌。该菌在有氧和无氧条件下均可产乳酸。 (2)为实现对菌体代谢的动态调控，研究人员设计了光感应系统，并导入绿色荧光蛋白（GFP）基因以检测光感应系统的调控能力。 ①如图2，系统1在酵母中表达由V、L和H组成的融合蛋白。光照下，融合蛋白空间结构改变， 后启动下游基因表达；在黑暗状态下，融合蛋白自发恢复到失活状态。 ②分别检测黑暗和光照下系统1的荧光强度，结果如图3。对照组能持续激活GFP表达。实验结果显示 ，可知系统1实现了光调控基因表达，但表达量较低。推测可能由于菌体密度高导致透光性差，不利于V-L-H对光照的响应。进一步优化设计出系统2（如图2），同等光照强度下，系统2荧光强度显著高于系统1，分析原因是 。    ③实验中发现黑暗条件下系统2的GFP基因有明显表达，为解决此问题，对系统2增加如图4所示组分，i、ii、iii依次为 （填字母序号）。    A．持续表达型启动子         B．Pc120             C．PGAL D．G80基因（G80蛋白可结合并抑制GAL4） E．GAL4基因（GAL4蛋白可结合并激活PGAL） F．PSD基因（含有PSD的融合蛋白在光下降解） (3)将优化后的系统2中GFP基因替换为乳酸脱氢酶基因，应用于酵母菌合成乳酸的发酵生产。发现在“先黑暗-后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式，请推测“先黑暗-后光照”模式下乳酸产量高的原因 。 20．（2024·北京朝阳·二模）贾第虫是寄生于人畜肠道内的单细胞动物，能依靠端粒酶维持端粒长度，反复传代呈现“永生化”。 (1)端粒是 两端的DNA—蛋白质复合体，正常情况下会随细胞分裂次数增加而逐渐截短，最终损伤端粒内侧正常基因，使细胞活动趋于异常。贾第虫端粒酶由RNA和逆转录酶组成，能以RNA为 催化合成新的端粒DNA序列，T区是逆转录酶的RNA结合功能域。 (2)研究者筛选出多种能与T区结合的蛋白，其中蛋白Z为贾第虫特有。通过图1所示实验进行验证（Myc和HA是已知短肽）。 ①为验证各组动物细胞均表达了相应的融合基因，可对 进行电泳后，做抗原—抗体杂交检测。 ②通过比较 两组的 抗体的检测结果证实T区与蛋白Z能够结合。 (3)研究者根据蛋白Z的基因序列设计核酶基因表达载体转染贾第虫，核酶可特异性结合并剪切Z基因的mRNA。检测贾第虫体内端粒酶活性，结果如图2。    ①端粒酶活性检测的原理是：端粒酶可将重复序列—（TTAGGG）连续加到寡核苷酸序列二（AATCCGTCGAGAGTT）的3'末端合成端粒DNA序列；根据 设计引物对端粒DNA序列进行PCR扩增，电泳检测产物；端粒酶活性越大，电泳条带 。 ②检测还发现：随着培养时间的延长，转基因贾第虫的端粒缩短而对照组无明显变化，对照组贾第虫数量显著增加而转基因贾第虫数量无明显变化。结合图2结果，解释贾第虫“永生化”的原因 。 (4)基于上述实验，提出一个研发贾第虫病特异性药物的方向 。 21．（2024·北京东城·二模）水稻是人类重要的粮食作物之一，种子的胚乳由外向内分别为糊粉层和淀粉胚乳，通常糊粉层为单层活细胞，主要累积蛋白质、维生素等营养物质；淀粉胚乳为死细胞，主要储存淀粉。选育糊粉层加厚的品种可显著提高水稻的营养。 (1)用诱变剂处理水稻幼苗，结穗后按图1处理种子。埃文斯蓝染色剂无法使活细胞着色。用显微镜观察到胚乳中未染色细胞层数 的即为糊粉层加厚的种子，将其对应的含胚部分用培养基培养，筛选获得不同程度的糊粉层加厚突变体tal、ta2等，这说明基因突变具有 的特点。 (2)突变体tal与野生型杂交，继续自交得到F2种子，观察到野生型：突变型=3∶1，说明该性状的遗传遵循基因 定律。利用DNA的高度保守序列作为分子标记对F2植株进行分析后，将突变基因定位于5号染色体上。根据图2推测突变基因最可能位于 附近，对目标区域进行测序比对，发现了突变基因。 (3)由tal建立稳定品系t，检测发现籽粒中总蛋白、维生素等含量均高于野生型，但结实率较低。紫米品系N具有高产等优良性状。通过图3育种方案将糊粉层加厚性状引入品系N中，培育稳定遗传的高营养新品种。 ①补充完成图3育种方案 。 ②运用KASP技术对植物进行检测，在幼苗期提取每株植物的DNA分子进行PCR，加入野生型序列和突变型序列的相应引物，两种引物分别携带红色、蓝色荧光信号特异性识别位点，完成扩增后检测产物的荧光信号（红色、蓝色同时存在时表现为绿色荧光）。图3育种方案中阶段1和阶段2均进行KASP检测，请选择其中一个阶段，预期检测结果并从中选出应保留的植株。 ③将KASP技术应用于图3育种过程，优点是 。 22．（2024·北京西城·二模）科研人员获得了携带两种抗稻瘟病的抗性基因Pib和Pikm的水稻品系——川抗30，以及携带螟虫抗性基因CrylC的水稻品系——昌恢。为获得同时携带抗螟虫基因和两种抗稻瘟病基因的改良株系，开展了相关研究。 (1)水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对 。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交，F1表现为稻瘟病抗性，F1与野生型杂交，子代性状及分离比为 ，证明Pib和Pikm位于非同源染色体上。 (2)吕恢品系水稻在品质和产量上明显优于川抗30，科研人员结合分子标记技术筛选目标基因进行杂交育种，以获得改良优质水稻。请写出制备优质、高产的纯合双抗（抗螟虫和抗稻瘟病）水稻的杂交育种技术路线（总体思路） 。 (3)研究者利用PCR技术检测改良优质水稻中是否含有Pib基因。 ①下表为利用PCR进行检测的反应体系的配方，请将表格补充完整。 PCR反应体系 组分 总体积/10μL 10倍浓缩的扩增缓冲液 1μL i 1.5μL 4种脱氧核苷酸等量混合液（2.5mmol·L-1） 0.5μL 引物I/II（5.0μmol·L-1） 1/1μL Taq DNA聚合酶 0．20μL H2O ii ②图为Pib基因的部分序列。 5'—…AATGCCC…ATGTGGA…—3' 3'—…TTACGGG…TACACCT…—5' 根据图，选择 作为引物对Pib基因进行扩增。 A．5'—…AATGCCC…—3'    B．5'—…TCCACAT…—3' C．5'—…TTACGGG…—3'    D．5'—…ATGTGGA…—3' 研究者最终确定改良优质水稻具备了相关抗性基因，成功培育出优质、高产的双抗水稻。 (4)检测发现本研究获得的优质双抗水稻的部分性状与昌恢品系相比出现株高上升、千粒重下降的现象，但是利用基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系，其他性状未发生改变，原因可能是 。请从育种的角度对这两种技术进行评价。 23．（2024·北京海淀·二模）葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，科研人员通过改造工程菌以实现GA的大量生产。 (1)M酶和U酶是GA合成途径中的两个关键酶，科研人员将图1所示质粒1导入 处理的大肠杆菌，改造后的大肠杆菌可合成GA．    (2)为实现对工程菌合成GA的实时监测，科研人员设计了质粒2.并进行下表所示两种检测方案。 方案一 质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中 在液体培养基中培养一段时间 菌液分为5组 每组上清液加入适量GA，检测荧光强度。 方案二 质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中 将E菌液与S菌液混合，混合菌液培养一段时间后分为5组 ①据图1分析检测方案的原理为 。 ②检测结果如图2，据图对比两种方案，并结合两种质粒适用范围，选择其中一种更优方案并说明理由： 。    (3)进一步发现由于产物GA呈酸性影响了大肠杆菌合成GA的能力，因而科研人员尝试以酵母菌为受体细胞导入质粒1，改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA的途径如图3.但M酶的活性远小于U酶，限制了GA产量。为改进M酶的催化效率，将含不同突变的M酶基因分别导入酵母菌，利用上述所选方案菌株监测不同酵母菌的GA产量，操作为 ，取等量培养液，测定其荧光值和吸光度（反应菌体浑浊程度），挑选 高的菌株即为GA高产菌株。    (4)据图3分析还可以通过 等方法改造酵母菌以提高GA的产量。 24．（2024·北京海淀·二模）种子成熟过程受脱落酸（ABA）等植物激素调控。为研究种子成熟的调控机制，研究者以拟南芥为材料进行了实验。 (1)ABA是对植物生长发育起 作用的微量有机物，在种子成熟过程中起重要作用。 (2)研究发现，种子成熟阶段S蛋白和J蛋白均有表达。研究者检测了不同拟南芥种子的成熟程度，结果如图1.根据图分析，S蛋白和J蛋白对种子成熟的调控作用分别是 。 (3)S蛋白可与J蛋白结合。为探究两蛋白在植物体中的作用关系，研究者在纯化的J蛋白溶液中分别加入野生型及S蛋白缺失突变体的种子细胞裂解液，使用药剂M进行相关处理，检测结果如图2.结果说明：S蛋白可使J蛋白 。 (4)检测发现，S蛋白缺失突变体比野生型体内的ABA含量低。编码S蛋白基因的启动子区有转录调控因子T的结合序列，T可被ABA激活。J蛋白也为一种转录调控因子。为研究T、J蛋白对S蛋白基因表达的调控，研究者构建了图3所示质粒并转化烟草叶肉原生质体，实验结果如图4. 图4结果说明： 。 (5)种子成熟对于种子提高萌发活力等具有重要作用。综合上述研究，分析ABA对种子成熟的调控机制 。 25．（2024·北京房山·一模）肠道菌群分泌的胆盐水解酶（BSH）与高脂血症密切相关，研究表明高脂饮食后小肠BSH活性上升，提高血液中胆汁含量，达到降低血脂的目的。科研人员利用基因工程技术，对小鼠肠道内相关菌株（B菌）进行改造，以期获得分泌更多BSH的工程菌BS菌。 (1)高脂饮食是引起高血脂症的一个主要原因，但脂质也是人体必要的物质，请写出属于脂质的2种化学物质 。 (2)工程菌的制备： ①X菌的筛选：16SrRNA基因是鉴定微生物的重要依据，其大小约为1500bp，高产BSH的X菌株的16SrRNA基因有限制酶ApaI的两个酶切位点，其他菌株中只有一个。通过PCR→ → →观察，结果如图1，可知 （填图1中序号）为所选目的菌种。 ②表达载体的构建： 科研人员操作如图2，进行同源重组构建表达载体。 I.将NC质粒用相关的限制酶进行酶切。 Ⅱ.在X菌株BSH基因两侧分别添加一段与上述载体同源（碱基排列次序相同）的序列A、B。 Ⅲ.表达载体同源重组过程如图2所示。如果BSH基因N链B端同源臂的碱基序列为-A-A-A-G-，则NC质粒M’链的碱基序列为 ，两者在5’-3’外切酶的作用下被降解，在DNA连接酶的作用下，在1、2处形成 键，完成基因表达载体的构建。 ③科研人员将表达载体用电击法导入B菌，获得BS菌株。 (3)关于图2所示同源重组构建表达载体的方法，其优点有________ A．免去传统方法双酶切的繁杂操作 B．同源重组，保证目的片段插入载体时方向正确 C．如果载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列出现在目的基因内部，该技术可克服传统方法的局限性 (4)用BS菌株给小鼠灌胃，同时给小鼠饲喂高脂饮食，对照组1不做处理，8周后检测小鼠肠道内容物，进行体外BSH活性检测，如图3所示，结果说明 。 (5)有人认为BS菌株适合开发为人体降脂的功能性菌剂，请辩证地评价该观点 。 26．（2024·北京顺义·一模）人在衰老过程中某些性状会发生改变，为寻找衰老的原因，科研人员对染色质开展了相关研究。 (1)由图1可知，导致个体衰老的原因包括某些染色质区域 ，某些DNA 。 (2)DNA甲基化会抑制转录并引发更紧密的染色质结构的形成，推测衰老染色质结构松散会 （促进/抑制）基因表达。 (3)科研人员推测：核内DNA断裂后的修复会导致表观遗传信息紊乱或丢失，加速细胞衰老。为验证该推测，科研人员基于图2原理，利用以下实验材料构建ICE模型鼠。 ①Cre酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于DNA上的Lx序列，导致两个Lx间的DNA片段丢失； ②I-E核酸酶基因：编码的I-E核酸酶位于细胞核，与诱导剂T、Cre酶形成复合物，切割DNA； ③口服诱导剂T：小分子化合物，可诱导Cre酶进细胞核。 请完善技术路线 ： (4)染色质上的修复蛋白因子可修复受损DNA，通过对ICE小鼠的检测，发现已修复的DNA未发生碱基序列的改变。通过检测 ，可知获得的ICE鼠表观遗传信息紊乱；检测细胞的形态结构，可知细胞衰老。 27．（2024·北京海淀·一模）温度是影响微生物生长的重要因素， 科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 (1)大肠杆菌是一种常见的微生物， 常被改造为基因工程菌， 其原因包括 （写出2点）。 (2)为实现温度控制蛋白质合成， 科研人员设计了方案1， 构建表达载体（见图1）， 将其导入大肠杆菌， 获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖， 当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体， ， 因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。 (3)为更精准调控荧光蛋白表达， 将上述表达载体改造为方案 2中的载体（见图2）。与方案1相比， 方案2的主要优势是 。 (4)为检测方案2， 科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制见图3.依据方案2， 每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带，请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况， 在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色 。 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 (5)聚羟基脂肪酸酯（PHA） 常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB 和4HB 随机聚合， 或通过分段聚合形成嵌段共聚物（见图5）， 其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5.请完善以下表格， 通过改造方案 2 以实现应用工程菌大规模生产优质 PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。 操作 目的 对方案 2表达载体的改造为： 。 将构建好的表达载体导入大肠杆菌， 获得工程菌。 获得可以合成PHA的工程菌。 以葡萄糖为原料配置培养基， 灭菌后加入上述工程菌。 配制培养基、接种。 控制发酵条件： 。 发酵48 小时， 获得3HB 比例为25%的嵌段共聚物。 28．（2024·北京东城·一模）EB病毒（EBV）可引发鼻咽癌等癌症。我国科研人员制备有效阻断EBV感染的单克隆抗体，为治疗和疫苗研发提供思路。 (1)如图1所示，EBV表面的糖蛋白gHgL与上皮细胞表面受体（如E2等）结合后，引起gB发生 变化，启动病毒包膜和上皮细胞膜融合。膜融合过程体现了膜具有 性。gHgL可作为制备有效阻断EBV感染的单克隆抗体的 。 (2)研究人员从EBV感染者外周血中分离出单个核细胞（PBMC），包含自然杀伤（NK）细胞、T细胞、B细胞。将下表中不同荧光标记的分子与PBMC培养后筛选出目标细胞，将目标细胞中的抗体mRNA 为cDNA，扩增出gHgL抗体基因，转入细胞成功表达出单克隆抗体。筛选出的目标细胞应具有荧光 （选填字母）。 不同荧光标记的分子 相关分子的特点 荧光A-抗CD4抗体 CD4为辅助性T细胞的标记分子 荧光B-抗CD8抗体 CD8为细胞毒性T细胞的标记分子 荧光C-抗CD20抗体 CD20为B细胞的标记分子 荧光D-抗CD56抗体 CD56为NK细胞的标记分子 荧光E-gHgL gHgL可与细胞上的受体特异性结合 (3)经筛选得到单抗D8，与已报道的单抗A1相比，两者都有较强的gHgL结合能力，都能显著抑制EBV病毒感染上皮细胞。将gHgL与D8或A1混合接触后，检测与上皮细胞表面受体E2的结合能力，结果如图2。 分析实验结果可知D8与A1作用的区别是 。 29．（2024·北京东城·一模）东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 (1)研究发现，东方果蝇中dsx基因 出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 (2)蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。    ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 （选填字母）。 ② 由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 （填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 。    (3)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。    ① 欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5’端和3’端 。 ② 对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 30．（2024·北京石景山·一模）贝氏不动杆菌（A菌）是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，此过程被称为基因水平转移（HGT）。科学家试图利用A菌的HGT能力检测结肠癌。 (1)通常用含蛋白胨的培养基培养A菌，蛋白胨能提供碳源、氮源等成分，其中氮源可用于合成 等物质（答出2个即可）。 (2)结肠癌常由KRAS基因中G12位点突变导致，科学家以其作为结肠癌检测点。 ①如图1所示，将针对KRAS基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，某种酶能从相同序列特定位点切断 键，修复过程中切口被重新连接，从而实现特定基因片段的替换，获得转基因癌细胞。 ②为验证A菌具有吸收特定DNA片段的能力，依据①中的原理，构建图2所示的表达载体，导入A菌中获得传感器A。将传感器A与转基因癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察传感器A在不同培养基中的生长情况。请从a～e中选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应的序列 。 a．KRAS片段1 b．KRAS片段2 c．kanR d．specR（壮观霉素抗性基因） e．G12位点 能证明传感器A发生特异性HGT的实验结果是 。 (3)肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，观察生长情况。为实现上述目的，需改造A菌使其仅能降解正常的KRAS序列，并对图2所示表达载体进行进一步改造（如图3）。请分析其能检测出结肠癌的机理 。    31．（2024·北京丰台·一模）太谷核不育小麦是完全的雄性不育突变体，是国宝级的种质资源。它的花药的退化在减数分裂早期阶段开始，导致所有花药败育。 (1)小麦的太谷核不育和矮变一号均为单基因突变体，太谷核不育为高秆核不育，矮变一号为矮秆可育，株高基因用A、a表示，育性基因用R、r表示。为了获得矮秆核不育重组类型，进行以下实验： i．太谷核不育为母本与矮变一号杂交，得到F1一半为矮秆核不育，一半为矮秆可育； ⅱ．F1矮秆核不育为母本与野生型测交，得到矮秆可育152株和高秆核不育169株。 根据以上结果可知，太谷核不育和矮变一号的基因型分别为 ，两对等位基因的遗传 （符合/不符合）自由组合定律。 (2)重复上述实验并扩大数量，在得到的8374株测交子代中分离出14株矮秆不育株。进行细胞学检查发现，仅有1株为正常二倍体。请设计杂交实验验证该正常二倍体的矮秆不育株为所需类型，并预期子代的表现型及比例 。 (3)推测P基因就是使太谷核不育小麦败育的基因。以下事实支持该推测的是 。 A．显性的P基因一直处于杂合状态 B．P基因缺失或突变后小麦育性恢复 C．P基因的表达会引起转基因细胞的死亡 D．与核不育基因紧密连锁的分子标记与P基因也紧密连锁 E．P基因只在不育植株的花中表达，在可育植株中不表达 (4)为验证上述推测，研究人员在野生型小麦中获得了P等位基因的启动子，并发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列。然后利用Ti质粒构建表达载体，部分结构如下图所示，GFP表达后会发出绿色荧光。 将载体转入小麦幼胚，获得转基因植株，对植株表型和P基因表达情况进行鉴定。从a~i中选择填表。 a．Ubi（通用的强启动子）  b．P等位基因启动子  c．插入TRIM序列的P等位基因启动子  d．P编码区 e．P基因  f．无关基因  g．仅在花药发育S2期表达  h．在花药发育各时期均不表达 i．在根、茎、叶、雌蕊中均不表达 实验材料 转入载体组成Ⅰ Ⅱ 植株表型 P基因表达情况 核不育小麦 雄性不育 g i 野生型小麦 可育 h i 野生型小麦 ad 死亡 野生型小麦 ① ② g i 在存活的转基因小麦花药中特异性检测到绿色荧光。以上实验结果显示 ，导致雄性不育。 (5)矮秆核不育小麦是便利的遗传改良工具，请说明雄性不育在育种中优势 。 32．（2024·北京丰台·一模）研究人员利用水稻突变体对相关基因进行研究。 (1)将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养，外源T-DNA（含bar标记基因）会整合到水稻基因组，获得水稻突变体库。该突变体库中包含株高、叶色、叶型、育性、分蘖数等明显性状改变，构建该突变体库的过程中，引起性状改变的原因可能有______ A．实验操作中其它微生物的污染 B．实验过程中偶然接触紫外线或化学药品 C．DNA复制过程中的DNA序列变化 D．外源T-DNA的插入导致DNA序列变化 E．组织培养过程中染色体的互换 (2)对突变体库进行自交和表型筛选获得纯合的早衰突变体。为研究早衰突变与T-DNA整合之间的关系，将纯合的早衰突变体与“中花11”回交之后，分析F2的性状分离情况和对bar基因的PCR检测结果： ①若F2的正常植株：早衰植株=3：1，则突变体的早衰性状是由 控制的； ②若F2的所有植株中含bar基因与不含bar基因之比为3：1，则T-DNA是单个插入； ③若F2的 ，则该突变为T-DNA插入引起。 经检验，实验结果与预期相符。请在下图中标出bar基因（用表示）可能的位置 。 (3)为获得该衰老相关基因，研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增，主要过程见下图。外源接头包括长单链接头和短单链接头，二者部分互补。以长单链接头的部分序列为引物a和b，根据T-DNA已知序列设计引物c、d、e、f。 实验的主要流程为：用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链，再以 为引物合成互补链，得到PCR产物1→为减少非特异性扩增，以 为引物进行PCR得到产物3（同理得到产物2和产物4）→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。 (4)引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和 等。该研究为延缓水稻衰老、提高水稻产量提供了理论依据。 33．（23-24高三下·北京平谷·阶段练习）学习以下材料，回答（1）-（5）问题。 中心法则中的RNA通常指的是能够编码蛋白质的mRNA，但细胞中有许多不编码蛋白质的RNA-非编码RNA，但对细胞生命活动有调控作用。微小RNA（miRNA）是一种真核细胞中广泛存在的短链非编码RNA，长度为17~25个核苷酸。miRNA通常与mRNA的3'端非编码区结合，抑制依赖该mRNA的蛋白质翻译或促进靶标mRNA的降解，从而在转录后水平上调控基因的表达。当人体内某些miRNA功能失调时，疾病就可能发生。 前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤。已发现去乙酰化酶（SIRT）在前列腺癌的发生发展过程中有重要作用。研究推测在前列腺癌细胞CW中miRNA对SIRT基因有转录后调控作用。研究者利用数据库对SIRT基因3'端非编码区进行分析，发现19个可能的miRNA作用的靶标位点（如图1A），依据这些靶标位点的分布构建了4个截断片段（如图1B）。分别将这4个截断片段连接到P载体-荧光素酶基因F下游处，构建重组载体，并分别转入到CW细胞中，检测F的蛋白表达水平。结果如图2。 免疫原性是指能够刺激机体，使免疫细胞活化、增殖、分化而产生特异性抗体。由于miRNA分子无免疫原性，被认为是具有临床治疗应用前景的分子，但miRNA分子递送效率低，限制了其疗效。结合新型靶向基因递送系统可为前列腺癌的基因靶向治疗提供新型手段和药物来源。为研发靶向治疗肿瘤的RNA疫苗提供广阔的应用前景。 (1)miRNA与mRNA的3'端非编码区通过 原则互补结合，从而在转录后水平上调控基因的表达。 (2)P载体上有荧光素酶基因F，将SIRT基因3'端非编码区域片段连接到P载体的F下游，获得重组载体P-F-SIRT，转入CW细胞中，检测荧光素酶F的mRNA水平及蛋白质水平，如图3所示。实验发现：SIRT3'端非编码区域存在转录后调控区域，依据是 。 (3)结合图1和图2分析，SIRT基因3'端非编码 片段可能是miRNA靶位点，原因是 。 (4)结合全文的信息，下列说法正确的有____。 A．miRNA结构稳定性差，易降解 B．miRNA编码蛋白引起细胞免疫排斥 C．可调控miR-34a或miR124靶向治疗前列腺癌 D．miRNA可用脂质载体递送到细胞内 (5)你认为本文介绍的miRNA调控转录是否属于表观遗传学？请陈述原因 。 34．（23-24高三下·北京延庆·阶段练习）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，期望用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。 (1)科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，如下图。    ①利用来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子Tcl42作为“开关”构建温控抑制元件，在 （选填“λ噬菌体”、“大肠杆菌”或“人”）中具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL；当控温至42℃时才开启特定基因的表达。 ②Tcl42开关仅在加热时瞬时激活特定基因，而免疫疗法需要数周才能见效，所以设计了“基因电路”——一次短暂的温度激活后可维持长期的基因表达。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型αPD-L1蛋白基因（该蛋白可用免疫治疗）等。 请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线： 及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL → → 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） → → 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。 A、重组酶Bxb1基因不表达      B、菌体升温至42℃时 C、用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件 D、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录 E、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组 (2)科研人员用 处理大肠杆菌，使其处于感受态，从而将“基因电路”质粒导入菌体内，经过培养、涂布后，筛选 （选项），由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌（EcT）。 A、含有四环素的培养基上形成的菌落        B、具有绿色荧光的菌落 C、同时具有A和B特征的菌落             D、具有A或B特征的菌落均可 (3)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，选取若干组生理状态相近的小鼠，经过7天的成瘤建模后，分别进行如下处理，并检测记录小鼠体内肿瘤体积。 第1组：注射生理盐水，2天后FUS处理； 第2组：注射温控工程菌，2天后FUS处理。请评价并完善实验方案 。 最终证明温控工程菌可被FUS处理局部激活，并具有持续性肿瘤免疫治疗效果。 (4)若期望将上述温控工程菌用于临床实验，还需利用小鼠开展 方面的研究。 35．（23-24高三上·北京东城·期末）为监测与记录体内细胞间通讯，我国科研人员建立了一种新的系统，利用转基因技术经筛选获得转基因小鼠（gL），以揭示正在进行的细胞与细胞之间的接触情况。 (1)gL小鼠中细胞—细胞接触的信号通路如图。将绿色荧光蛋白（GFP）设计为信号分子，αGFP-N-tTA融合蛋白为 ，完成细胞间的信息交流。利用转基因技术获得以心肌细胞作为信号发送细胞的转基因小鼠，为保证在心肌细胞中特异性表达GFP，表达载体中应含有 。将构建好的表达载体导入小鼠的 中，同理获得内皮细胞特异性表达αGFP-N-tTA的转基因小鼠，将上述两种转基因小鼠杂交，经筛选获得gL小鼠。    (2)如图，在gL小鼠中，科研人员使用LacZ基因作为报告基因。当内皮细胞与心肌细胞接触时，由于GFP和aGFP-N-tTA结合，引起 ，进入细胞核与tetO结合，启动LacZ基因表达，使正在与心肌细胞接触的内皮细胞呈蓝色。 (3)研究人员进一步构建gT小鼠，以实现体内所有与心肌细胞有过接触的内皮细胞都持续发出红色荧光。请利用以下实验材料，完善制备gT小鼠的技术路线。 DNA序列 loxP：该序列中有Cre酶的识别位点，loxP本身不影响附近的DNA序列的功能 Cre：编码的酶进入细胞核后作用于loxP，导致两个loxP中间的DNA片段丢失 STOP：转录终止序列 Pc：持续表达强启动子 tetO：tTA识别和结合序列，结合后启动下游基因的表达 RFP：红色荧光蛋白基因 小鼠品系 a。内皮细胞特异性表达aGFP-N-tTA的转基因小鼠 b。野生型小鼠    (4)在gT小鼠胚胎发育早期，观察到部分内皮细胞发出红色荧光。随着胚胎发育的进行，观察到肝脏中很大一部分血管也呈现红色，这表明 。 36．（23-24高三上·北京朝阳·期末）为研究胰腺A蛋白的生理功能，科研人员利用基因工程技术构建了A基因胰腺特异性敲除模型小鼠。 (1)利用如图载体构建A基因中有LoxP序列的小鼠。图中载体与A基因颜色相同的区域序列相同。通过同源臂使载体与A基因上的对应相同序列发生片段互换，将LoxP整合到A基因上得到A′基因，A′基因与A基因功能相同。 将载体导入 （细胞）中，获得了基因型为AA′的杂合鼠。 (2)来自于噬菌体的Cre酶可将它所在细胞中含LoxP序列的基因敲除。研究人员将Cre酶基因与特异性启动子拼接，使其仅在小鼠胰腺细胞中表达。胰腺细胞特异表达Cre酶的小鼠称为C鼠。 以下是利用AA′杂合鼠和C鼠杂交获得A基因胰腺特异性敲除鼠的操作过程，并利用小鼠尾部细胞检测杂交后代基因型。（注：A和Cre酶基因位于小鼠的不同染色体上） ①第一批杂交：AA′鼠分别与AA′鼠、C鼠杂交，在子一代中筛选，获得两类鼠：A′A′鼠和 鼠。 ②第二批杂交：将第一批杂交筛选获得的两类鼠进行一次杂交，获得多只小鼠，其中含有A基因胰腺特异性敲除小鼠。利用PCR的方法检测这些小鼠尾部细胞的基因型，引物（P1~P6）及产物电泳结果如下图所示。 得到B图甲的电泳结果，A图P1~P4中应选择的一对引物是 。其中1、2为对照；3—10号小鼠中，含A基因的有 ，可实现A基因胰腺特异性敲除的有 。 (3)将纯合A′A′鼠（无Cre酶）与第二批杂交筛选得到的A基因胰腺特异性敲除的小鼠进行杂交，出生的后代有、无Cre酶的小鼠数量之比接近 时，说明胰腺中A基因特异性敲除的小鼠可正常出生，无胚胎致死；利于在后续研究中应用。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$