专题09 生物技术与工程-【好题汇编】3年（2022-2024）高考1年模拟生物真题分类汇编（辽宁专用）

专题09 生物技术与工程 考点 三年考情（2022-2024） 命题趋势 考点1 发酵工程 2024·辽宁、吉林、黑龙江 2023·辽宁 2022·辽宁（2道选择） 从近三年辽宁省高考试题来看，常出现的考点是发酵工程和细胞工程、基因工程，发酵工程和细胞工程难度适中，基因工程非选择题难度较大。发酵工程和细胞工程常以选择题的形式考察、每年一道或2道、基因工程是高频考点，每年选择非选择都有考察。 考点2 细胞工程和胚胎工程 2024·辽宁、吉林、黑龙江 2023·辽宁 2022·辽宁（1道选择、1道非选择） 考点3 基因工程 2024·辽宁、吉林、黑龙江（1道选择、1道非选择） 2023·辽宁（1道选择、1道非选择） 2022·辽宁 考点01发酵工程 1.（2024·黑吉辽）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是（ ） A. 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品 B. 将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测 C. 将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落 D. 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小 【答案】CD 【解析】 【分析】1、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技 术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。 2、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来 统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养 基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含 有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30〜300 的平板进行计数。 【详解】A、题干信息：某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误； B、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误； C、题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确； D、题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。 2.（2023·辽宁）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m³）。下列叙述错误的是（ ） A. 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理 B. 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置 C. 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值 D. 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高 【答案】D 【解析】 【分析】稀释涂布平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。 【详解】A、为防止杂菌感染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌，对实验操作者的双手进行消毒，A正确； B、纯化培养时，为防止污染培养基和水分蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，B正确； C、微生物计数时在同一稀释度下，应至少需要对3个菌落数目在30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确； D、使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。 3.（2022·辽宁）为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是（ ） A. 航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物 B. 细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀 C. 在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品 D. 采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征 【答案】D 【解析】 【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】A、嗜极微生物适应极端环境的特性使它们有在空间暴露环境或地外星球环境中存活的可能，因此航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确； B、细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀，会腐蚀舱内材料以及设备线路、元器件，B正确； C、对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测，需要在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品，C正确； D、航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不需要采用平板划线法，D错误。 4.（2022·辽宁） β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。下列叙述正确的是（ ） A. 所用培养基及接种工具分别采用湿热灭菌和灼烧灭菌 B. 通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌 C. 还需进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力 D. 该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发 【答案】ACD 【解析】 【分析】选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。 【详解】A、培养基一般选择高压蒸汽灭菌，接种工具一般用灼烧灭菌，A正确； B、分离纯化酵母菌，操作如下：配制培养基→灭菌→接种→培养→挑选菌落，B错误； C、为了筛选到目的菌，应该进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力，C正确； D、筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌可应用于白酒新产品的开发，D正确。 考点02 细胞工程和胚胎工程 1.（2024·黑吉辽）从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是（ ） A. 传代培养时，培养皿需密封防止污染 B. 选取①的细胞进行传代培养比②更合理 C. 直接用离心法收集细胞进行传代培养 D. 细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关 【答案】B 【解析】 【分析】动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。动物细胞培养需要的条件有：①无菌、无毒的环境；②营养；③温度和pH；④气体环境：95%空气+5%CO2；动物细胞培养技术主要应用在：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质等。 【详解】A、传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气+5%CO2的气体环境，而非密封，A错误； B、选取①的细胞进行传代培养比②更合理，①的细胞核型更为稳定，B正确； C、对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，先需要用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，C错误； D、细胞增长进入平台期可能与接触抑制有关，D错误。 2.（2023·辽宁）大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，可用于流感疫苗的生产。下列叙述错误的是（ ） A. 悬浮培养单克隆细胞可有效避免接触抑制 B. 用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清 C. 当病毒达到一定数量时会影响细胞的增殖 D. 培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量 【答案】D 【解析】 【分析】培养动物细胞使用合成培养基时需要加入血清等一些天然成分，必须保证环境是无菌、无毒的，培养液还需要定期更换。O2是细胞代谢所必需的，CO2主要作用是维持培养液的pH。细胞贴附在培养瓶的瓶壁上称为细胞贴壁，贴壁细胞在生长增殖时会发生接触抑制的现象。 【详解】A、悬浮培养单克隆细胞，可以保证足够的气体交换，通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内，可有效避免接触抑制，A正确； B、由于细胞的生长是比较复杂的过程，血清中含有一些必须的因子，用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清，B正确； C、病毒借助于细胞进行繁殖，利用了活细胞的物质、能量、酶等，当病毒达到一定数量时细胞的生命活动受到影响，会影响细胞的增殖，C正确； D、细胞的正常生命活动需要适宜的pH，培养基pH会影响细胞代谢，进而影响单克隆细胞的病毒产量，D错误。 3.（2022·辽宁）蓝莓细胞富含花青素等多酚类化合物。在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变。褐变会引起细胞生长停滞甚至死亡，导致蓝莓组织培养失败。下列叙述错误的是（ ） A. 花青素通常存在于蓝莓细胞的液泡中 B. 适当增加培养物转移至新鲜培养基的频率以减少褐变 C. 在培养基中添加合适的抗氧化剂以减少褐变 D. 宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体 【答案】D 【解析】 【分析】根据题干信息：在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变。减少褐变的措施有：减少氧化剂的浓度，如勤换培养基，或添加抗氧化剂。在植物组织培养的过程中，一般选用代谢旺盛、再生能力强的器官或组织为材料制备外植体。 【详解】A、液泡中含有糖类、无机盐、色素和蛋白质等，其中的色素是指水溶性色素，如花青素，A正确； B、适当增加培养物转移至新鲜培养基的频率可减少代谢积累的氧化剂的浓度，从而减少褐变，B正确； C、根据题干信息：在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变，可知在培养基中添加合适的抗氧化剂以减少褐变，C正确； D、一般选用代谢旺盛、再生能力强的器官或组织为材料制备外植体，D错误。 4.（2022·辽宁）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。 Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1 （1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。 （2）质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。 Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2 （3）用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。 （4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集___________，提取单克隆抗体。 （5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。 【答案】（1） ①. 检测目的基因是否成功导入受体细胞 ②. 双分子层中 （2）蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸 （3） ①. 胰蛋白酶或胶原蛋白 ②. CO2培养箱 （4） ①. 克隆化 ②. 抗原抗体杂交 ③. 细胞培养液 （5）抗体-药物偶联物##ADC 【解析】 【分析】1、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 2、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。 3、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。 【小问1详解】 构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。 【小问2详解】 由于目的基因为N蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。 【小问3详解】 进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。 【小问4详解】 用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。 【小问5详解】 利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。 考点03 基因工程 1.（2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【解析】 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 2.（2024·黑吉辽）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 （2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】（1） ①. 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 ②. 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA （2） ①. PCR技术扩增 ②. 人工合成 （3） ①. RNA聚合酶识别并结合的部位 ②. 同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性 （4）HygBR （5） ① F3 ②. R2 （6）CD 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 【小问2详解】 本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 【小问3详解】 穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性。 【小问4详解】 结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 【小问5详解】 为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 【小问6详解】 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列、用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，AB不符合题意，CD符合题意。 故选CD。 3.（2023·辽宁）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ） A. CD163基因中编码起始密码子的序列 B. CD163基因中编码终止密码子的序列 C. RFP基因中编码起始密码子的序列 D. RFP基因中编码终止密码子的序列 【答案】B 【解析】 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。 【详解】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都得转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 4.（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： （1）上述过程属于_____工程。 （2）PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 （3）某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。 （4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。 （5）目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 （6）采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 【答案】（1）蛋白质 （2）③ （3）② （4）标记基因 （5） ①. 筛选导入目的基因的大肠杆菌 ②. 5.7 （6）逆转录 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。 【小问2详解】 PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。 【小问3详解】 根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。 【小问4详解】 作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。 【小问5详解】 目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。 【小问6详解】 转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 5.（2022·辽宁）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ） A. 预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 【答案】B 【解析】 【分析】PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误； B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确； C、延伸过程需引物参与，C错误； D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误； 考点01 发酵工程 1．（2024·辽宁鞍山·模拟预测）发酵工程逐步完善和发展，发酵产品实现了大规模生产。下列说法正确的是（    ） A．发酵过程中培养基和设备可采用相同的方法进行消毒处理 B．发酵工程的中心环节是发酵罐内的发酵 C．通过发酵获得的单细胞蛋白是一种分泌蛋白 D．利用大麦和酵母菌发酵生产啤酒时，大部分代谢物在后发酵阶段生成 【答案】B 【分析】发酵工程的中心环节是发酵。在发酵过程中要随时检测培养液中微生物的数量、产物浓度等，以了解发酵进程。 生产啤酒过程中，大麦发酵主要是分为两个阶段：主发酵和后发酵；酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵完成。 【详解】A、培养基和发酵设备都需要进行灭菌处理，而不是消毒处理，且灭菌方法不完全相同，如培养基可用湿热灭菌，设备可用干热灭菌，A错误； B、发酵工程的中心环节是发酵罐内的发酵，B正确； C、单细胞蛋白是利用发酵工程获得的菌体本身，而不是菌体产生的蛋白质，C错误； D、利用大麦和酵母菌发酵生产啤酒时，大部分代谢物在主发酵阶段生成，D错误。 2．（2024·辽宁·模拟预测）黄酒是中国最古老的酒种，享有“酒中之祖、酒中之王”的美誉，深得大众喜爱。但研究发现黄酒中的潜在致癌物质—氨基甲酸乙酯（EC）的含量远高于其他酒。已知酒液中的EC主要由尿素和乙醇反应生成，而尿素主要由酵母菌代谢产生。下列叙述错误的是（    ） A．在黄酒工艺流程中加入酸性脲酶可起到降低EC含量的作用 B．降低黄酒中EC含量可以通过抑制CAR1基因的表达来实现 C．酒精浓度升高导致酵母菌活性下降会使发酵过程中酒精度数无法提高 D．可用二苯胺鉴定经PCR扩增后的目的基因DUR1，2的特定核苷酸序列 【答案】D 【分析】1、基因控制性状的途径有两条：基因通过控制酶的合成控制代谢进程，进而控制生物体的性状；基因还能通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状。 2、DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2molL的NaCI溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定 DNA的试剂。 【详解】A、由题意可知，EC主要由尿素和乙醇反应形成，脲酶可以将尿素分解成氨，减少尿素的含量，所以适量加入脲酶，可以减少黄酒中EC的含量，A正确； B、为了降低黄酒中EC含量，可减少黄酒中尿素的含量，由图可知，可以抑制CAR1基因的表达或增强DUR1，2基因的表达，B正确； C、在黄酒发酵过程中出现酒精度数无法提高，原因可能是酒精浓度升高导致酵母菌活性下降，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，故可用二苯胺试剂鉴定DNA，但不能鉴定特定核苷酸序列，D错误。 3．（2024·辽宁·模拟预测）乳糖不耐受患者肠道内的乳糖无法被身体吸收利用，进而被大肠内的部分菌群利用，其代谢产物包含较多气体和酸类物质，导致身体不适，如腹胀和腹泻。下列相关叙述不合理的是（    ） A．患者消化道内缺乏乳糖酶 B．乳糖为肠道菌群提供氮源 C．患者肠道内分泌液增多导致出现腹泻 D．乳糖耐受和不耐受属于相对性状 【答案】B 【分析】氮元素是构成生物体的蛋白质、核酸及其他含氮化合物的材料，把从外界吸入的含氮化合物或氮气，称为该生物的氮源。 【详解】A、患者体内缺乏乳糖酶，因而无法将乳糖水解，A正确； B、乳糖的元素组成为C、H、O，不含N，无法为肠道菌群提供氮源，B错误； C、腹泻的原因是乳糖不耐受患者饮用牛奶等含乳糖饮料后乳糖在体内无法被乳糖酶分解后吸收，一方面增加了小肠内的渗透压，水分向肠道内渗透，产生腹泻症状，另一方面乳糖在细菌作用下分解产生其他代谢物，进而引起腹痛、腹胀的症状，C正确； D、乳糖耐受和不耐受属于相对性状，是同一性状的不同表现形式，D正确。 4．（2024·辽宁沈阳·三模）辽宁盛产南国梨，以南果梨为主要原料制酒，开创了世界“果粮混合固态发酵酒”之先河，该酒以果香为体、粮香为魂。下列叙述错误的是（    ） A．“果粮混合固态发酵酒”的发酵全过程均需严格的灭菌操作 B．制作该酒所需的酵母菌的代谢类型为异养兼性厌氧型 C．将南国梨先用清水冲洗再去除果柄，沥干后用于发酵 D．南国梨和粮食中的多种糖类作为发酵的物质和能量来源 【答案】A 【分析】果酒制备的菌种是酵母菌，属于兼性厌氧型真菌，发酵前期酵母菌先进性有氧呼吸，促进酵母菌的繁殖，后期进行无氧呼吸产生酒精。果酒制作的原理是酵母菌在无氧的条件下进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳。 【详解】A、酵全过程如果经过严格的灭菌操作，会将菌种杀死，A错误； B、制作该酒所需的酵母菌的代谢类型为异养兼性厌氧型，发酵前期酵母菌先进性有氧呼吸，促进酵母菌的繁殖，后期进行无氧呼吸产生酒精，B正确； C、将南国梨用清水将梨冲洗干净去除果柄（可防止因去除果柄而导致梨果皮的破损而导致材料污染），沥干水分后用于发酵，C 正确； D、南国梨和粮食中富含多种糖类，可以作为酵母菌发酵所需的物质和能量的来源，D 正确。 5．（2024·辽宁大连·二模）野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，赖氨酸营养缺陷型突变菌株由于发生基因突变只能在添加了赖氨酸的培养基上生长。下图是以野生型菌株为材料，诱变、纯化赖氨酸营养缺陷型突变菌株的部分流程，数字代表培养基，A、B、C表示操作步骤。下列叙述错误的是（    ） A．紫外线照射可提高突变率，获得更多的突变菌株 B．B步骤采用了稀释涂布平板法在②培养基上接种 C．③培养基中不需要添加赖氨酸，不需要提供氮源 D．挑取④培养基中菌落甲进行纯化培养可获得所需突变菌株 【答案】C 【分析】由题图信息分析可知，图中首先利用稀释涂布平板法分离细菌，然后运用影印法将菌种接种到两种培养基中，分别是基本培养基、完全培养基；野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，而氨基酸营养缺陷型菌株由于发生基因突变无法合成某种氨基酸只能在完全培养基上生长，据此利用培养基的种类便可以选择出氨基酸突变株。 【详解】A、紫外线作为物理诱变因素，用其照射可提高突变率，获得更多的突变菌株，A正确； B、根据图②中菌落分布均匀可知，B步骤采用了稀释涂布平板法在②培养基上接种，B正确； C、图中①②④为完全培养基，需添加赖氨酸，③为基本培养基，不能添加赖氨酸，但由于野生型菌株其它含氮物质的合成也需要氮源，所以③中应添加除赖氨酸以外的其它氮源，C错误； D、结合图示可知，甲在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明甲是氨基酸缺陷型菌落，故经C过程影印及培养后，可从④培养基中挑取甲菌落进行纯化培养即可获得所需突变株，D正确。 6．（2024·黑龙江·三模）双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基融化并冷却至45～48℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。恒温培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列有关叙述正确的是（    ） A．平板上的细菌和噬菌体为种间竞争关系，细菌在竞争中处于劣势 B．由于上层培养基中琼脂含量较低，双层平板法获得的噬菌斑较小 C．平板上形成的噬菌斑的数目与原液中噬菌体数量呈正相关 D．用该方法统计出的噬菌体数量一般会比噬菌体实际数量大 【答案】C 【分析】微生物常见的接种的方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】A、细菌和噬菌体为寄生关系，A错误； B、双层平板法因上层培养基中琼脂浓度较低，故形成的噬菌斑较大，有利于计数，B错误； C、原液中噬菌体数量越多，在平板上形成的噬菌斑就越多，C正确； D、若两个噬菌体重叠只能观测到一个噬菌斑，因此用该方法统计的数目比实际数目要小，D错误。 7．（2024·黑龙江·模拟预测）下图表示我国传统酿醋工艺的主要流程，其中糖化即淀粉水解过程。下列叙述错误的是（    ） A．加入的菌种a、b都是原核生物，细胞没有线粒体 B．蒸煮的目的是灭菌和使细胞破裂，释放淀粉 C．拌麸皮后的发酵温度应高于拌麸皮前 D．醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况 【答案】A 【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精。 【详解】A、加入的菌种a是真核生物酵母菌，菌种b是原核生物醋酸菌，原核细胞没有线粒体，真核细胞有线粒体，A错误； B、蒸煮的目的是使原料在高温下灭菌，同时使细胞结构破裂，淀粉被释放出 来，淀粉由颗粒状变为溶胶状态，B正确； C、拌麸皮后用于醋酸发酵，醋酸发酵的适宜温度为30~35℃， 发酵温度高于拌麸皮前的酒精发酵，C正确； D、醋酸发酵过程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程 中经常翻动发酵物，有利于散热，可控制发酵温度和改善通气状况，D正确。 8．（2024·黑龙江·模拟预测）下列有关微生物的培养或纯化的叙述，正确的是（    ） A．高压蒸汽灭菌后，打开排气阀，待压力表指针降至“0”后开盖取物 B．采用稀释涂布平板法接种后，不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落 C．在含有刚果红的培养基上，纤维素分解菌菌落周围会出现抑菌圈 D．用平板划线法分离菌种，划线4个区域，接种环需要灼烧灭菌5次 【答案】D 【分析】微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。用稀释涂布平板法进行微生物计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 【详解】A、灭菌后，等压力表指针降至“0”时，打开排气阀排气，打开锅盖，取出灭菌物品，A错误； B、采用稀释涂布平板法接种后，稀释到合适浓度的菌液才可在培养基表面形成单菌落，B错误； C、刚果红 能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌产生的纤维素酶分解后，刚果红一 纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，不是抑菌圈，C错误； D、用平板划线法分离菌种，划线4个区域，每次接种之前需要灼烧接种环灭菌，最后划线完成后也需要 灼烧灭菌，共灼烧灭菌5次，D正确。 9．（2024·吉林长春·模拟预测）随着咖啡豆销量的增加，产生大量咖啡果皮果肉等附属产物。咖啡果皮果肉营养物质丰富，可将其加工成果醋。某研究小组利用含葡萄糖和酒精成分的M和N培养基，从自然发酵的咖啡果醋中分离出产酸能力高的醋酸菌，工艺流程大致如下。 下列叙述错误的是（    ） A．培养基N比培养基M中多了凝固剂 B．过程②可采用稀释涂布法进行接种 C．过程③挑取菌落与透明圈直径比值小的单菌落 D．培养基M、N均需要干热灭菌 【答案】D 【分析】选择培养和扩大培养： （1）选择培养：通常根据菌落的特征选择菌株，应采用固体培养基进行培养。 （2）扩大培养：主要目的是让菌体快速繁殖和将营养物质充分利用，常采用液体培养基进行培养。 【详解】A、培养基N是固态，而扩大培养一般使用液态培养基，所以培养基N比培养基M中多了凝固剂，A正确； B、过程②是分离得到单菌落，应采用稀释涂布法进行接种，B正确； C、过程③挑取菌落与透明圈直径比值小的单菌落，代表分解能力强，C正确； D、M培养基加了葡萄糖，而葡萄糖不耐高温，需要过滤除菌，不能使用干热灭菌，D错误。 10．（23-24高二下·吉林·期中）凯里红酸汤是贵州省凯里市特产，其颜色鲜红、气味清香、味道酸爽。凯里红酸汤的制作流程如图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．红酸汤中的酸味物质主要是乳酸菌产生的乳酸 B．食盐、大蒜、白酒等既可调味又可抑制杂菌生长 C．过期红酸汤表面产生的白膜通常与酵母菌增殖有关 D．装坛时要留1/3的空间，以创设利于发酵的有氧条件 【答案】D 【分析】分析题图：图示是利用乳酸菌发酵形成红酸汤的过程，乳酸菌是厌氧菌，只能进行无氧呼吸，产物是乳酸。 【详解】A、红酸汤中的酸味物质主要是乳酸菌产生的乳酸，A 正确； B、食盐、大蒜、白酒等既可调味又可抑制杂菌生长，故制作红酸汤时可适当加入上述物质，B正确； C、过期红酸汤表面产生的白膜，这是酵母菌繁殖引起的，C正确； D、凯里红酸汤的发酵主要以乳酸菌为主，乳酸菌是厌氧型细菌，D错误。 考点02 细胞工程和胚胎工程 11．（2024·吉林长春·模拟预测）某研究小组为培育高产耐盐碱再生植株，利用甲植物细胞（细胞核基因具有耐盐碱效应）和乙植物细胞（细胞质基因具有高产效应）进行体细胞杂交，在原生质体融合前，对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合的原生质体分散固定在平板中，独立生长、分裂形成愈伤组织。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞的理由是（    ） ①甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 ②同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 ③培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 ④杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 A．①②③ B．①②④ C．①③④ D．②③④ 【答案】B 【分析】植物体细胞杂交技术：（1）植物体细胞杂交技术：是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。（2）过程：①诱导融合的方法：物理法；化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂；②细胞融合完成的标志是新的细胞壁的生成；③植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束；④杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征，原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 【详解】① 未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂，因此甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞，①正确； ②同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂，因此同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞，②正确； ③培养基不含有抑制物质，③错误； ④只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，具备有完整的结构和功能，可以生长、分裂，因此杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞，④正确。 综上所述，①②④正确。 12．（2024·吉林·一模）请据图判断，下列说法正确的是（    ） A．由a和b形成c的过程必须依赖细胞膜的结构特点 B．若d是有性杂交后代，在体外进行时a和b均需获能处理 C．在细胞工程中，d最终都可以发育成个体 D．若d是杂交瘤细胞，其产生的单克隆抗体利用同位素或荧光标记技术可以治疗肿瘤、心血管畸形等疾病 【答案】A 【分析】1、细胞膜的结构特点具有一定的流动性；细胞膜的功能特点选择透过性。 2、有性生殖杂交的后代是受精卵发育而来的个体，精子和卵细胞的融合称为受精作用。 3、细胞工程中的植物体细胞杂交技术可获得无性杂种个体，细胞融合原理为细胞膜的流动性（细胞的全能性）。 【详解】A、细胞a和细胞b融合成细胞c的过程主要体现了细胞的结构特点，具有一定的流动性，A正确； B、体外受精时，精子需要获能处理，卵细胞不需要进行获能处理，B错误； C、在细胞工程中，d最终可以发育成个体，也可以发育成组织、器官等，C错误； D、利用放射性同位素或荧光标记的单克隆抗体可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病，而不是治疗，D错误。 13．（2024·吉林·一模）阿尔兹海默病是老年人常见的一种疾病，该病主要表现为患者逐渐丧失记忆和语言功能、情绪不稳定。研究发现该病是由患者大脑内某些区域的神经元中，β淀粉样蛋白异常加工，进而引起细胞大量死亡造成。下列关于其致病机理的说法不正确的是（    ） A．阿尔兹海默病与细胞内肽链的折叠错误有关 B．阿尔兹海默症患者记不住刚刚发生过的事情，可能与大脑中形状像海马的脑区神经元大量死亡有关 C．神经干细胞和iPS细胞在治疗阿尔兹海默病方面具有重要作用和前景 D．阿尔兹海默病与主导语言功能的大脑的右半球功能障碍有关 【答案】D 【分析】干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞可培养诱导出新的组织细胞，在治疗相关疾病方面有重要价值。 【详解】A、由题意可知，阿尔兹海默病β淀粉样蛋白异常加工，将细胞内肽链的折叠错误，A正确； B、海马体主要负责学习和记忆，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中，所以人脑的短期记忆与大脑皮层形状像海马的脑区有关，阿尔兹海默症患者记不住刚刚发生过的事情，可能与海马区神经元大量死亡有关，B正确； C、神经干细胞和iPS细胞可以培养诱导出新的组织细胞，在治疗阿尔茨海默病等方面有重要价值，C正确； D、语言功能是人脑特有的高级功能，语言区位于大脑皮层左半球侧面，D错误。 14．（2024·辽宁沈阳·模拟预测）人体细胞呼吸产生的CO2是机体生命活动的重要调节因子。以下相关说法错误的是（　　） A．人体内环境的稳态也包括体液中CO2含量的相对稳定 B．缺氧导致细胞质基质产生的CO2增多，引起呼吸频率增加，该过程属于体液调节 C．理论上，正常机体细胞内液中CO2的浓度始终高于细胞外液 D．临床上给病人输入O2时和动物细胞培养时都需加入5%的CO2，两者的目的不同 【答案】B 【分析】1、 有氧呼吸的第一、二、三阶段的场所依次是细胞质基质、线粒体基质和线粒体内膜，有氧呼吸第一阶段是葡萄糖分解成丙酮酸和[H]，合成少量ATP；第二阶段是丙酮酸和水反应生成二氧化碳和[H]，合成少量ATP；第三阶段是氧气和[H]反应生成水，合成大量ATP。2、脑干中含有呼吸中枢等。 【详解】A、内环境稳态包括成分和理化性质的稳态，CO2属于内环境的成分，则人体内环境的稳态也包括体液中CO2含量的相对稳定，A正确； B、人体呼吸作用产生CO2的只能是有氧呼吸第二阶段，场所是线粒体基质，B错误； C、CO2在细胞内产生，跨膜运输的方式为自由扩撒，理论上正常机体细胞内液中CO2的浓度始终高于细胞外液，C正确； D、临床上给病人输入O2时需要加入5%的CO2，目的是为了刺激呼吸中枢，而动物细胞培养时加入5%的CO2目的是维持培养液的pH，两者目的不同，D正确。 15．（2024·辽宁丹东·二模）自然情况下，牛的生育率很低，畜牧业生产上可通过下图两种途径实现良种牛的快速大量繁殖。下列相关叙述正确的是（    ） A．胚胎移植前需要用外源促性腺激素对雌性牛A与雌性牛B做同期发情处理 B．途径1和途径2过程中都有胚胎的形成，均为有性生殖 C．途径2获得的克隆牛的遗传性状完全由雌性牛C决定 D．两个途径中从雌性牛A卵巢内取得的卵母细胞都需要先体外培养至MⅡ再进行操作 【答案】D 【分析】试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，对囊胚阶段的胚胎进行分割时要注意将内细胞团等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 【详解】A、胚胎移植前需要用雌激素（孕激素）对雌性牛A与雌性牛B做同期发情处理，A错误； B、途径1获得试管牛的技术流程中包括体外受精、体外胚胎培养和胚胎移植等技术，属于有性生殖；途径2获得是试管牛是通过核移植技术获得的，为无性生殖，B错误； C、途径2获得的克隆牛的遗传性状主要由雌性牛C决定，雌牛B在形成重构胚的过程中，提供了细胞质基因，所以也会影响克隆牛的性状，C错误； D、两个途径中从雌性牛A卵巢内取得的卵母细胞都需要先体外培养至MⅡ再进行操作，D正确。 16．（2024·辽宁沈阳·模拟预测）下图是一种“生物导弹”的作用原理示意图，没有与肿瘤细胞结合的“生物导弹”一段时间后被机体清除。阿霉素是一种抗肿瘤药物，可抑制DNA和RNA的合成，对正常细胞也有一定毒性。下列说法正确的是（　　） A．杂交瘤细胞释放单克隆抗体，体现了细胞膜具有一定的选择透过性 B．活化阿霉素不具有选择性杀伤肿瘤细胞的功能 C．仅注射图示“生物导弹”就能抑制肿瘤细胞内DNA和RNA的合成 D．使用图示“生物导弹”，可以大量增加阿霉素用量 【答案】B 【分析】题图分析：生物导弹是由单克隆抗体和碱性磷酸酶组成，单克隆抗体能与肿瘤细胞特异性结合，碱性磷酸酶能将非活化磷酸阿霉素活化，抑制肿瘤细胞中的DNA复制和转录过程，从而抑制肿瘤细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。治疗中，应先注射生物导弹再注射非活化磷酸阿霉素。 【详解】A、杂交瘤细胞通过胞吐的方式释放单克隆抗体，体现了细胞膜具有一定的流动性，A错误； B、活化阿霉素对正常细胞也有一定毒性，不具有选择性杀伤肿瘤细胞的功能，B正确； C、由图可知，生物导弹只是单克隆抗体和碱性磷酸酶，如果没有阿霉素，抗体也不能发挥作用，因此仅注射“生物导弹”不能对肿瘤细胞内DNA和RNA的合成起抑制作用，C错误； D、生物导弹是由单克隆抗体和碱性磷酸酶组成，单克隆抗体能与肿瘤细胞特异性结合，碱性磷酸酶能将非活化磷酸阿霉素活化，使用图示“生物导弹”，可以适当减少阿霉素用量，D错误。 17．（2024·辽宁大连·二模）毛花猕猴桃为二倍体，果实大，维生素C含量高。软枣猕猴桃为四倍体，极耐寒，在-40℃下可安全越冬。农科所想利用下图技术流程培育兼具这两种猕猴桃优点的新品种。下列叙述正确的是（    ） A．新品种是通过植物组织培养技术获得的 B．新品种的体细胞中含有三个染色体组 C．①处用相关酶的低渗溶液处理可获得原生质体 D．从愈伤组织到新品种的过程需要经历低温筛选 【答案】D 【分析】图示表示植物体细胞杂交过程，过程①表示纤维素酶、果胶酶去除细胞壁获得细胞原生质体的过程。 【详解】A、新品种是通过植物体细胞杂交获得的，A错误； B、毛花猕猴桃为二倍体，软枣猕猴桃为四倍体，两者形成的杂种植株有6个染色体组，B错误； C、过程①是利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得细胞原生质体的过程，此过程需要在等渗溶液中进行，目的是为了维持原生质体的活性和形态，C错误； D、要培育兼具两种猕猴桃优点的新品种，从愈伤组织到新品种的过程需要经历低温筛选，D正确。 18．（2024·辽宁·二模）人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，常作为女性是否怀孕的检测指标。某科研人员将小鼠B细胞和骨髓瘤细胞融合后，经过筛选获得能稳定分泌抗 HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞。下列相关分析错误的是（    ） A．获取小鼠 B细胞之前需给小鼠多次间隔注射 HCG B．可采用灭活的病毒诱导B细胞与骨髓瘤细胞融合 C．应将抗体检测呈阴性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养 D．抗 HCG 单克隆抗体比普通抗 HCG 抗体检测女性怀孕的准确率更高 【答案】C 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、获取小鼠 B细胞之前需给小鼠多次间隔注射 HCG，以促进小鼠产生更多的对应B淋巴细胞，A正确； B、诱导动物细胞融合的方法有物理法、化学法和生物法，灭活病毒诱导属于生物法，B正确； C、应将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养，该过程属于体内培养，C错误； D、单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，抗HCG单克隆抗体孕检的准确率比普通抗HCG抗体高，D正确。 19．（2024·黑龙江·三模）下图是利用体细胞核移植来克隆高产奶牛的大致流程示意图。下列相关叙述错误的是（    ） A．体外培养至MⅡ期的卵母细胞要先经过获能处理才能用于后续操作 B．图中过程①常用显微操作法去除细胞中的纺锤体和染色体的复合物 C．图中过程③是将供体细胞整个注入去核卵母细胞中 D．图中的重构胚中含有卵母细胞和供体细胞的细胞质 【答案】A 【分析】动物核移植是指将动物的一个细胞的细胞核移入一个去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎。在体外将采集到的卵母细胞培养到减数第二次分裂中期才成熟，可以通过显微操作技术去除卵母细胞的细胞核和第一极体，核移植时，对提供细胞核和细胞质的奶牛不需要进行同期发情处理，使用电脉冲等方法可以激活重组细胞使其完成细胞分裂和发育。 【详解】A、体外培养至MⅡ期的卵母细胞不需要进行获能处理就可进行后续操作，A错误； B、卵母细胞去核通常是用显微操作法去除细胞中的纺锤体和染色体的复合物，B正确； CD、过程③构建重构胚时是将供体细胞整个注入去核卵母细胞中，因此图中的重构胚中含有卵母细胞和供体细胞的细胞质，CD正确。 20．（2024·黑龙江·模拟预测）视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是一种自身免疫性疾病，病因是机体产生了水通道蛋白4（AQP4）的抗体。NMOSD的诊断依赖对外周血的检测，检测过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．图示操作的目的是检测患者体内是否存在AQP4抗体 B．荧光标记的“二抗”会与结合在AQP4上的抗体结合 C．患者的检测结果应为在细胞质中观察到免疫荧光 D．这种检测方法保持了抗原结构，因此具有较高的特异性 【答案】C 【分析】根据题意，研究发现，人体内针对自身跨膜蛋白--水通道蛋白4（AQP4）的抗体是导致视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的重要因素。因此AQP4相当于是抗原，AQP4作为抗原可被抗原呈递细胞加工、呈递。因为A位于细胞膜的外表面，抗体在细胞外液中，故抗体可识别A部位。 【详解】A、图示操作加入患者血浆样本，血浆中含有抗体，因此图示操作的目的是检测患者体内是否存在AQP4抗体，A正确； B、血浆中的抗体先与膜上的AQP4抗原结合形成复合物，再加入荧光“二抗”，此时加入的荧光“二抗”能与AQP4上的抗体结合，B正确； C、抗体分布在细胞外液中，则患者的检测结果应为在细胞外中观察到免疫荧光，C错误； D、这种方法能与抗原结合的抗体不会被洗脱，不能结合的就会被洗脱，加入的二抗能与结合的抗体结合并通过荧光观察，这种检测方法保持了抗原结构，且具有较高的特异性，D正确。 考点03 基因工程 21．（2024·辽宁沈阳·三模）将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中、其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又保持了目的基因表达产物的活性，因此可以通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关该技术的说法、错误的是（    ） A．可使用同种限制酶切割荧光蛋白基因和目的基因以便连接 B．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在不同的启动子后面 C．荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高 D．荧光蛋白还可用于检测目的基因表达产物的转移和分布情况 【答案】B 【分析】基因工程的操作步骤包括目的基因的获取、构建基因表达载体、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 【详解】A、可使用同种限制酶切割荧光蛋白基因和目的基因，可以形成相同的末端，以便连接，A正确； B、需要将荧光蛋白基因和目的基因连接在相同的启动子后面，B错误； C、荧光蛋白基因进入受体细胞后会表达出荧光蛋白，荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高，C正确； D、荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中，其表达产物具有荧光蛋白的特性，可以通过检测荧光强度来检测目的基因表达产物的转移和分布情况，D正确。 22．（2024·黑龙江·三模）中国科学家领衔的国际团队发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（    ） A．研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B．PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C．DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D．一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物 【答案】C 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、题意显示，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，因此研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A正确； B、PCR 反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，B正确； C、DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误； D、一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。 23．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B．环化阶段，可选E．coliDNA连接酶而不能选T4DNA连接酶 C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者不能互补配对 D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 【答案】A 【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。酶切时用限制性内切酶，环化时用DNA链接酶，再用引物和DNA聚合酶扩增。在环化后，通过一对方向相反的引物实现已知序列两侧基因序列的扩增。 【详解】A、在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确； B、T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B错误； C、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C错误； D、PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。 24．（2024·辽宁沈阳·模拟预测）S基因与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。已知S基因转录的模板链位于b链，转录时mRNA自身的延伸方向为5’→3’。如下图，为使S基因按正确方向与质粒连接，酶切目的基因时选用的限制酶组合是（    ） A．BamHⅠ和HindⅢ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．MunI和BamHⅠ D．EcoRⅠ和HindⅢ 【答案】A 【分析】基因工程的工具酶有限制酶和DNA连接酶，通常要用同一种限制酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，然后再用DNA连接酶连接成重组质粒。 【详解】据图可知，质粒中EcoRⅠ的酶切位点没有位于启动子和终止子之间，不能选用；MunI会破坏目的基因，也不能选择；同时为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切。 25．（2024·辽宁·模拟预测）病毒性疾病具有一定的传染性和危害性，临床诊断病毒的类型对于对症治疗具有重要意义。下列关于病毒诊断方法的原理及其适用范围的叙述，错误的是（　　） 选项 诊断方法 具体操作 原理 适用范围 A 病毒中和 固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，再比较病毒被中和后的感染力 抗原与抗体特异性结合 DNA病毒和RNA病毒 B 免疫PCR 用抗体来捕获抗原，提取核酸后，再用PCR扩增 抗原与抗体特异性结合 DNA病毒和RNA病毒 C 核酸杂交 先将待测核酸固定在膜上，然后用放射性同位素标记的单链核酸与其进行杂交，使杂交体带上标记而被显示出来 碱基互补配对原则 DNA病毒和RNA病毒 D 快速免疫滤纸测定 把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上，结合抗原后可以发生显色反应 抗原与抗体特异性结合 DNA病毒和RNA病毒 A．A B．B C．C D．D 【答案】B 【分析】抗体检测是利用抗原-抗体杂交的原理检测病毒的有无，若病毒表达量低则误差较大，而核酸检测是检测病毒的RNA，通过RNA逆转录形成的DNA，再对其进行荧光定量PCR，检测荧光含量，由于PCR可以对核酸进行扩增，因此即使病毒含量少也能检测出来，适用于病毒早期的检测，且准确率高于抗体检测。 【详解】A、病毒中和是利用抗原与抗体特异性结合使抗原失去感染性，从而确定病毒的种类，DNA病毒和RNA病毒均可利用该方法进行检测，A正确； B、PCR不能直接扩增RNA，免疫PCR的原理是DNA半保留复制，B错误； C、用同位素标记的单链核酸与病毒的核酸杂交的原理是碱基互补配对原则，DNA和RNA均可以和探针互补配对，C正确； D、快速免疫滤纸测定利用抗原与抗体特异性结合的原理，可以检测DNA病毒和RNA病毒，D正确。 26．（2024·辽宁大连·模拟预测）有一环状双链DNA，其中一条链的核苷酸片段序列为：CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA（共30个碱基，其中G+C=18个）限制酶EcoRⅠ在单链上的识别位点序列为GAATTC，下列叙述错误的是（    ） A．该单链片段中G+C占比为60%，其互补片段中A+T占比为40% B．用EcoRⅠ切该环状双链DNA，至少会产生2个片段 C．如果该环状DNA缺失了一个碱基对，用EcoRⅠ可能切不开该DNA D．若该DNA分子连续复制2次，共需要消耗36个腺嘌呤脱氧核苷酸 【答案】B 【分析】限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中的特定部位的磷酸二酯键断开。 【详解】A、DNA分子按照碱基互补配对原则形成双链，即A-T、G-C。DNA链由A、T、G、C四种碱基构成，该DNA一条链中G+C=18，占18÷30=60％，则A＋T=40％，其互补链中的T+A=40％，A正确； B、该条链的核苷酸片段序列中只有一个-GAATTC-的碱基序列，要产生2个片段，用EcoR I切该环状双链DNA，至少有限制酶EcoRⅠ的两个酶切位点，而该序列只有一个，因此用EcoRⅠ切该环状双链DNA，只能形成一个线性DNA分子，B错误； C、如果该环状DNA缺失了一个碱基对，该DNA序列会发生改变，酶切位点也可能会发生改变，用EcoR Ⅰ可能切不开该DNA，C正确； D、该单链片段共30个碱基，G+C=18个，则A＋T=12个，由于DNA两条链之间碱基互补，因此该DNA含A为12个，若该DNA分子连续复制2次，共需要消耗（22－1）×12=36个腺嘌呤脱氧核苷酸，D正确。 27．（2024·吉林·模拟预测）DNA受紫外线照射时，会使同一条DNA链上相邻的嘧啶通过共价键连接成二聚体，相邻的两个T或两个C或C与T间都可以环丁基环连成二聚体，其中最容易形成的是T—T二聚体，进而导致DNA受到破坏。如图是紫外线照射导致DNA受损后的修复过程。下列相关叙述错误的是（　　） A．紫外线会影响DNA的双螺旋结构从而使 DNA 分子复制受阻 B．图示紫外线损伤的DNA分子中嘌呤与嘧啶的比例会有所升高 C．外切酶可找到损伤位点并切开 DNA链，与酶的专一性有关 D．修复过程中以未损伤的DNA 链作为模板，用DNA连接酶封闭切口 【答案】B 【分析】DNA复制是指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程，从一个原始DNA分子产生两个DNA分子的生物学过程。DNA复制是通过名为半保留复制的机制来得以顺利完成的。 【详解】A、紫外线照射时，会使同一条DNA链上相邻的嘧啶通过共价键连接成二聚体，因此影响DNA的双螺旋结构从而使 DNA 分子复制受阻，A正确； B、图示紫外线损伤的DNA分子中嘌呤与嘧啶的比例不变，B错误； C、酶具有专一性，外切酶可找到损伤位点并切开 DNA链，C正确； D、修复过程中以未损伤的DNA 链作为模板，通过碱基互补配对合成子链，用DNA连接酶封闭切口，D正确。 28．（2024·吉林长春·模拟预测）科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZaA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如图所示，为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中应选择的引物是（    ） A．5′-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3′ B．5′-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3′ C．5′-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3′ D．5′-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3′ 【答案】AB 【分析】1、PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）； 2、PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】重组质粒Ⅰ上既含有MEL基因又含有Ec-cLYZ，且两基因相连，因此重组质粒Ⅰ可作为过程①PCR反应体系中的模板，为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，且两端带有pPICZαA的同源序列，因此所设计的引物，一侧应包含pPICZαA和Ec-cLY的碱基序列，且连接处应含有限制酶EcoRⅠ识别序列，又因为子链延伸的方向是5'→3'，因此，该侧引物序列应为5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’，即A选项；另一侧引物应包含MEL和pPICZαA，且连接处应含有限制酶SalⅠ识别序列，子链延伸的方向是5'→3'，因此，该侧引物序列应为5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’，即B选项。综上所述AB正确，CD错误。 29．（2024·吉林长春·模拟预测）DNA粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”，下列说法正确的是（    ） A．实验材料可以选择猪的成熟红细胞或肝细胞 B．将研磨液从冰箱中取出后取沉淀物继续进行实验 C．进行DNA鉴定时，对照组不需要加入DNA D．可以利用DNA溶于酒精的特性将DNA提取出来 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、猪为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误； B、DNA提取的实验中，要将研磨液过滤到烧杯中，在冰箱放置一段时间后，由于上清液中含有DNA和蛋白质，故取上清液继续进行实验，B错误； C、进行DNA鉴定时，对照组不需要加入DNA，只加二苯胺试剂作为空白对照组，目的是与实验组进行颜色对照，以鉴定提取出的物质是DNA，C正确； D、利用DNA不溶于酒精，而蛋白质等溶于酒精，可将DNA与蛋白质等分离，D错误。 30．（2024·吉林·模拟预测）基因工程、细胞工程都可以克服远缘杂交不亲和的障碍，在农作物新品选育等方面具有广阔的前景和较高的应用价值。为达到相应目的，必须通过分子检测的是（    ） A．筛选含有青霉素抗性基因的大肠杆菌 B．筛选产生新冠病毒抗体的杂交瘤细胞 C．转基因耐盐水稻植株耐盐效果的鉴定 D．检查卵母细胞受精状况和受精能力 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、筛选含有青霉素抗性基因的大肠杆菌，属于个体水平上的鉴定，A错误； B、筛选产生新冠病毒抗体的杂交瘤细胞，属于细胞工程的应用，需要通过分子检测，B正确； C、转基因耐盐水稻植株耐盐效果的鉴定，属于个体水平上的鉴定，C错误； D、检查卵母细胞受精状况和受精能力，属于胚胎工程的应用，不需要通过分子检测，D错误。 31．（2024·吉林长春·模拟预测）防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子。β﹣防御素是一种由H基因编码的抗菌肽，获得了β﹣防御素。回答下列问题： (1)为获得β﹣防御素基因，研究者利用致病细菌的脂多糖（LPS）刺激结肠癌细胞株提高β﹣防御素的表达量，经过 后，作为模板进行PCR扩增。PCR产物常采用 来鉴定，鉴定后进行测序。测序结果与 数据库中的公开数据进行比较，进而得到正确的β﹣防御素基因。 (2)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图），扩增目的基因时设计的1对引物为P1（5′ATCGAATTCATGGGAAGTCATAAACACATTAGA3′）和P2（5′TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT3′）。 ①本实验中引物的作用是 （答出2点即可）； ②部分限制酶识别序列及切点如下表，结合图中限制酶切点与引物，推测本实验酶切时 ，采用双酶切法的优势是 （答出2点即可）。 限制酶 识别序列及酶切位点 BglⅠ 5′…A↓GATCT…3′ EcoRⅠ 5′…G↓AATTC…3′ SnaBⅠ 5′…TAC↓GTA…3′ SacⅠ 5′…GAGAT↓C…3′ AurⅠ 5′…C↓CTAGC…3′ SalⅠ 5′…G↓TCGAC…3′ NotⅠ 5′…GC↓GGCCGC…3′ (3)毕赤酵母表达系统最大的优点是可对β﹣防御素 （答出2点即可），直接表达出具有生物活性的产品。 (4)毕赤酵母表达系统发酵结束后，采取适当的 措施来获得产品。 【答案】(1) 逆转录/反转录 琼脂糖凝胶电泳 GenBank (2) 使TaqDNA聚合酶从引物的8'端开始连接脱氧核苷酸，5'端引入限制酶切位点 EcoRⅠ和NotⅠ 防止载体或目的基因自身环化，防止目的基因与载体反向链接 (3)加工、修饰 (4)提取、分离 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）经RNA到DNA的过程是逆转录，故研究者利用致病细菌的脂多糖（LPS）刺激结肠癌细胞株提高β﹣防御素的表达量，经过逆转录后；PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定；测序结果与GenBank（或BLAST）数据库中的公开数据进行比较。 （2）①扩增目的基因时，需要一对引物，引物的作用是使 Taq DNA 聚合酶从引物的 3'端开始连接脱氧核苷酸，并在5'端引入限制酶切位点。 ②分析题意，扩增目的基因时设计的1对引物为P1（5'ATCGAATTCATGGGAAGTCATAAACACATTAGA3'）和P2（5'TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT3'），引物需要与模板的3'端结合，用于延伸子链，据图可知，引物P1中5'→3'有-GAATTC-序列，P2中5'→3'有-GCGGCCGC-序列，据此推测本实验中采用的一对限制酶是EcoR Ⅰ、Not Ⅰ；采用双酶切法的优势是避免目的基因和载体自身环化，目的基因和载体基因反向连接（确保目的基因和载体正确连接）。 （3）毕赤酵母位真核生物，毕赤酵母真核表达系统最大的优点在于，该体系可对目的蛋白加工、折叠、修饰，直接表达出具有生物活性的蛋白。 （4）毕赤酵母表达系统发酵结束后，采取适当的提取、分离措施来获得产品。 32．（2024·黑龙江哈尔滨·三模）抗凝血酶Ⅲ（AT—Ⅲ）是血浆中最重要的抗凝血成分，它主要由肝脏合成后进入血液。AT—Ⅲ水平降低可发生血栓或DIC（弥散性血管内凝血）。利用乳腺生物反应器可以让哺乳动物批量生产人的AT—Ⅲ用于治疗相关疾病，其过程如图所示。亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸，四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列相关问题： 注：质粒S中的Leu为亮氨酸合成酶基因，GFP为绿色荧光蛋白基因 限制酶 BamHI BgIⅡ Hindll Xbal 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -A↓GATCT- -A↓AGCTT- -T↓CTAGA- (1)为获取人的抗凝血酶Ⅲ基因，提取人肝细胞的mRNA，经 过程得到cDNA，经PCR扩增后对其产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与 等有关（答出两点）。如果电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因 （答出两条）。 (2)构建基因表达载体时，②过程为利用限制酶 切割得到产物B。为使AT—Ⅲ基因在乳腺细胞中特异性表达，应将AT—Ⅲ基因与 的启动子等调控元件重组在一起。为达到筛选目的，培养基的营养成分中不应含有 。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出 （选填“显示”或“不显示”）绿色荧光的细胞用于过程⑤。 (3)⑨过程是指胚胎移植，该过程的实质是 ，为筛选雌性胚胎，在胚胎移植前应从囊胚中 的取样做DNA分析，鉴定性别。 【答案】(1) 逆转录 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高等 (2) BamHⅠ、HindⅢ 山羊乳腺蛋白基因 亮氨酸 不显示 (3) 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 滋养层 【分析】据图可知，①是逆转录过程，②是目的基因的获取，③是基因表达载体的构建，④是将重组质粒导入受体细胞，⑤、⑥、⑦是核移植，⑧是早期胚胎培养，⑨是胚胎移植。 【详解】（1）获取人的抗凝血酶Ⅲ基因，提取人肝细胞的mRNA，经逆转录过程得到cDNA，经PCR扩增后对其产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。琼脂糖凝胶电泳时，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，如果电泳鉴定的结果不止一条条带，可能是由于引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高等。 （2）根据黏性末端可以看出，过程②需要的限制酶有BamHⅠ、HindⅢ，过程③为基因表达载体的构建过程，需要的酶是限制酶和DNA连接酶。为使AT—Ⅲ基因在乳腺细胞中特异性表达，应将AT—Ⅲ基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起。结合题意可知，质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成控制亮氨酸的合成，基因GFP控制合成绿色荧光蛋白，故质粒S中用作标记基因的是基因Leu、基因GFP；由于亮氨酸可通过Leu基因合成，故为达到筛选目的，培养基的营养成分中不应含有亮氨酸；GFP标记基因可以控制合成绿色荧光蛋白，而BamH I酶会破坏该标记基因，则重组质粒中该基因不能发挥作用，故将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出不显示绿色荧光的细胞用于过程⑤。 （3）胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，由于滋养层将来发育为胎儿的胎膜和胎盘，故性别鉴定应取滋养层细胞。 33．（2024·吉林·一模）紫杉醇是目前最好的抗肿瘤药物之一，但其药源植物红豆杉十分稀缺。大多数红豆杉细胞培养物的紫杉醇产量较低，研究人员通过构建紫杉醇合成关键酶（Bapt）基因表达载体来进一步提高红豆杉细胞紫杉醇产量，请回答下列问题：（MspI、BamHI、MboI、SmaI4种限制酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG） (1)紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种 （填“初生”或“次生”）代谢物，具有高抗癌活性，与从红豆杉的树皮和树叶中提取紫杉醇相比，利用植物细胞培养技术获得紫杉醇的优点是 （答出1点即可）。 (2)图1表示Bapt基因（D基因）的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，用限制酶MspI完全切割图1中DNA片段，则产物中共有 种不同长度的DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，再用限制酶SmaI完全切割，其产物长度分别为 bp。 (3)图2表示所用质粒的结构和部分碱基序列。若用同种限制酶处理图1、图2中的两种分子，以便构建重组质粒，最好选用的限制性核酸内切酶是 。 (4)为了获得含重组质粒的单个大肠杆菌的菌落，一般需要用添加 的固体培养基进行筛选，常用的接种方法是 。 (5)能否通过Bapt基因探针来检测目的基因是否成功导入受体细胞?为什么? 。 【答案】(1) 次生 不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，有利于保护濒危植物红豆杉 (2) 3/三 1327bp、661 (3)BamHI (4) 抗生素B 平板划线法或稀释涂布平板法 (5)不能，因为红豆杉细胞中本身存在Bapt基因，不管超表达载体是否成功导入，都能与Bapt基因探针形成杂交分子 【分析】分析题图：外源DNA含有BamHI、MboI、SmaI3种限制性核酸内切酶的识别序列，其中限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点在目的基因上。质粒含有MspI、BamHI、MboI3种限制性核酸内切酶的识别序列，其中BamHI酶的切割位点位于抗生素A的抗性基因上；MboI酶的切割位点位于抗生素B和抗生素A的抗性基因上。 【详解】（1）紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种次生代谢物，不是植物生长生长所必需的物质，具有高抗癌活性，与从红豆杉的树皮和树叶中提取紫杉醇相比，利用植物细胞培养技术获得紫杉醇的优点是不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，有利于保护濒危植物红豆杉。 （2）限制酶MspI识别序列和切割位点为C↓CGG，用限制酶MspI完全切割图1中DNA片段，存在2个切割位点，结合标识的碱基长度可知，产物中共有3种不同长度的DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，则限制酶MspI只有1个切割位点，SmaI识别序列和切割位点为CCC↓GGG，也只存在1个切割位点，但是先经限制酶MspI切割后，不存在CCCGGG序列，故SmaI识别和切割，最终只能产生2个不同长度的DNA产物：1327bp（534＋796—3）、661（658＋3）bp。 （3）限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点位于目的基因D上，若用这两种酶切割会被破坏目的基因D；运载体的两个标记基因上都有限制酶MboⅠ的切割位点，用该酶切割会破坏这两个标记基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和质粒。 （4）用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的固体培养基培养，常用的接种方法是平板划线法或稀释涂布平板法。 （5）不能通过Bapt基因探针来检测目的基因是否成功导入受体细胞，因为红豆杉细胞中本身存在Bapt基因，不管超表达载体是否成功导入，都能与Bapt基因探针形成杂交分子。 34．（2024·辽宁鞍山·模拟预测）产脂肪酶酵母可用于处理含油废水，同时可获得蛋白质。有研究人员尝试从餐馆厨房污水排放沟取样，筛选产脂肪酶酵母菌株，初步流程如下图所示。据图回答下列问题： (1)Ⅰ号培养基中应选择 作为唯一的碳源。 (2)过程③的接种方式为 。要判断所制备的培养基是否具有筛选作用，同时还需将样本接种到牛肉膏和蛋白陈的完全培养基上，若 ，说明具有筛选作用。 (3)酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母菌的絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，可大幅节约生产成本。科研人员发现酵母菌的R基因对絮凝能力有一定的抑制作用，下图表示科研人员利用同源重组（在两个DNA分子的同源序列之间直接交换的一种重组）基因敲除技术敲除R基因的过程。 ①研究人员将整合了lox序列的庆大霉素抗性基因导入酵母菌，lox-庆大霉素抗性基因通过同源重组的方式整合到酵母菌基因组中，重组片段上庆大霉素抗性基因的作用是 。利用PCR技术检测1ox-庆大霉素抗性基因是否替换R基因，扩增时引物应选择下图中的 。在PCR延伸阶段中 催化脱氧核苷酸连接到引物上。 ②将导入PC质粒的酵母菌，接种于添加 的马铃薯琼脂培养基中，获得敲除R基因且无庆大霉素抗性基因标记的酵母菌。Cre酶与基因工程中 （工具酶）作用类似，上述过程中其发挥作用时需断裂 个磷酸二酯键。 【答案】(1)脂肪 (2) 稀释涂布平板法 牛肉膏和蛋白胨的完全培养基上的菌落数明显多于制备的选择培养基 (3) 作为标记基因，筛选出R基因敲除的突变菌株 引物1和引物6 耐高温的DNA聚合酶 乳糖 限制酶 4 【分析】接种微生物的方法主要是稀释涂布平板法和平板划线法；稀释涂布线法：逐步稀释菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养；平板划线法由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 【详解】（1）根据Ⅰ号培养基的功能，Ⅰ号培养基为选择培养基，需要使用以脂肪为唯一的碳源，目的是筛选能产脂肪酶的酵母菌株。 （2）Ⅰ号培养基上菌落分布均匀，因此过程③的接种方式为稀释涂布平板法。要判断所制备的培养基是否具有筛选作用，同时还需将样本接种到含有牛肉膏和蛋白胨的完全培养基上，由于多种微生物都能利用牛肉膏和蛋白胨，因此若含有牛肉膏和蛋白胨的完全培养基上菌落数明显多于所制备的选择培养基，则说明该选择培养基具有筛选作用。 （3）①由题图可知，利用庆大霉素抗性基因同源重组替换了R基因，若酵母菌具有庆大霉素抗性，说明其R基因被成功敲除，因此庆大霉素抗性基因作用是作为标记基因，用于筛选出R基因敲除突变菌。 PCR扩增时，应选择一对方向相反的引物，且引物应与目的基因的3'端结合，该过程的目的是通过PCR技术证明该菌基因组中R基因已被lox-庆大霉素抗性基因替换，即扩增基因应为lox-庆大霉素抗性基因，据图可知，应选择引物1和引物6。 在PCR延伸阶段，耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）催化脱氧核苷酸连接到引物的3'端，逐渐延伸形成子链。 ②给酵母菌导入PC质粒，该质粒上的启动子是乳糖诱导型启动子，所以需要在培养基中添加乳糖，进而诱导该质粒上的Cre基因表达出产物Cre酶，该酶可以特异性识别lox序列并敲除目标基因即庆大霉素抗性基因，导致该酵母菌失去庆大霉素抗性，即筛选出敲除R基因且无庆大霉素抗性基因标记的R菌。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．Cre酶能特异性识别lox序列并敲除目标基因，其功能类似于基因工程中的限制酶。Cre酶切割两次，需断裂4个磷酸二酯键。 35．（2024·辽宁·模拟预测）图1为Ti质粒的部分结构示意图，①～⑥为部分限制酶识别位点，LB与RB为T－DNA左边界序列和右边界序列，tms与tmr为激素基因，Tetr为四环素抗性基因，Ori为复制原点，Pro为启动子。图2为部分限制酶及其识别序列与切割位点。回答下列问题： (1)研究人员分别将质粒A（结构如图1）、质粒B（去除了图1中tms与tmr的Ti质粒）、质粒C（去除了图1中LB或RB的Ti质粒）导入不含质粒的农杆菌中，将导入质粒的农杆菌与植物外植体分别共培养后，研究人员认为LB与RB是T－DNA进入植物细胞不可缺少的结构，与该结论相对应的实验结果是 。为获得胚状体或试管苗，研究人员用携带了质粒B的农杆菌侵染植物，而不用携带质粒A的农杆菌，原因最可能是 。 (2)在农杆菌侵染植物的过程中，农杆菌会产生酶甲，甲将T－DNA的一条核苷酸链切割下来，该单链进入植物细胞后形成双链，甲识别与切割的序列应为T－DNA中的 ，甲 （填“属于”或“不属于”）限制酶，理由是 。在利用质粒B构建表达载体时，需在目的基因的首尾两端添加限制酶的识别序列，在目的基因尾端最宜添加的序列是 ，理由是用该限制酶处理质粒与目的基因时 。 【答案】(1) 含质粒A或质粒B的农杆菌侵染植物时均出现转化，含质粒C的农杆菌侵染植物时不出现转化 T－DNA中的tms与tmr在植物细胞中表达，产生的激素会影响愈伤组织的形成及分化 (2) LB与RB 不属于 限制酶能识别双链DNA并断开DNA的双链，甲只能切割T－DNA的一条链 5′－CCCGGG－3′/XmaⅠ或SmaⅠ所识别的序列 限制酶④或⑤不会破坏Tetr，不会出现质粒与目的基因的自身环化，并保证质粒与目的基因正向连接 【分析】基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】（1）将质粒A（含LB、RB、tms与tmr）、质粒B（含LB与RB、不含tms与tmr）、质粒C（不含LB与RB、含tms与tmr）导入不含质粒的农杆菌中，将导入质粒的农杆菌与植物外植体分别共培养。若实验结果为含质粒A或质粒B的农杆菌侵染植物时均出现转化、含质粒C的农杆菌侵染植物时不出现转化，则说明LB与RB是T-DNA进入植物细胞不可缺少的结构，而tms与tmr则不是。在植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素共同控制着愈伤组织的形成及分化；质粒A中含有tms与tmr，二者表达会产生相应的激素，质粒B不含有tms与tmr；为获得胚状体或试管苗，用携带了质粒B的农杆菌侵染植物，而不用携带质粒A的农杆菌，原因可能是进入植物细胞的T-DNA中的tms与tmr在受体细胞中表达，所产生的激素会影响愈伤组织的形成及分化。 （2）在农杆菌侵染植物的过程中，农杆菌会产生酶甲，甲将T-DNA的一条核苷酸链切割下来，该单链进入植物细胞并在植物细胞中形成双链，由于LB与RB是T-DNA进入植物细胞不可缺少的结构，因此甲识别与切割的序列应为T-DNA中的LB与RB。甲不属限制酶，理由是限制酶能识别双链DNA并断开DNA的双链，甲只能切割T－DNA的一条链； 质粒B的T-DNA区段含有限制酶③④⑤⑥的识别序列，在利用该质粒构建表达载体时，需在目的基因的首尾两端添加限制酶的识别序列，根据启动子位置判断，在目的基因尾端最宜添加XmaI或SmaI所识别的序列（5'-CCCGGG-3'），添加后用XmaI或SmaI处理质粒与目的基因时，才不会破坏质粒中的Tet'，不会导致质粒与目的基因的自身环化，并保证质粒与目的基因正向连接。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！6 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题09 生物技术与工程 考点 三年考情（2022-2024） 命题趋势 考点1 发酵工程 2024·辽宁、吉林、黑龙江 2023·辽宁 2022·辽宁（2道选择） 从近三年辽宁省高考试题来看，常出现的考点是发酵工程和细胞工程、基因工程，发酵工程和细胞工程难度适中，基因工程非选择题难度较大。发酵工程和细胞工程常以选择题的形式考察、每年一道或2道、基因工程是高频考点，每年选择非选择都有考察。 考点2 细胞工程和胚胎工程 2024·辽宁、吉林、黑龙江 2023·辽宁 2022·辽宁（1道选择、1道非选择） 考点3 基因工程 2024·辽宁、吉林、黑龙江（1道选择、1道非选择） 2023·辽宁（1道选择、1道非选择） 2022·辽宁 考点01发酵工程 1.（2024·黑吉辽）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是（ ） A. 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品 B. 将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测 C. 将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落 D. 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小 2.（2023·辽宁）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m³）。下列叙述错误的是（ ） A. 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理 B. 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置 C. 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值 D. 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高 3.（2022·辽宁）为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是（ ） A. 航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物 B. 细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀 C. 在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品 D. 采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征 4.（2022·辽宁） β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌应用于白酒生产。下列叙述正确的是（ ） A. 所用培养基及接种工具分别采用湿热灭菌和灼烧灭菌 B. 通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌 C. 还需进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力 D. 该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发 考点02 细胞工程和胚胎工程 1.（2024·黑吉辽）从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是（ ） A. 传代培养时，培养皿需密封防止污染 B. 选取①的细胞进行传代培养比②更合理 C. 直接用离心法收集细胞进行传代培养 D. 细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关 2.（2023·辽宁）大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，可用于流感疫苗的生产。下列叙述错误的是（ ） A. 悬浮培养单克隆细胞可有效避免接触抑制 B. 用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清 C. 当病毒达到一定数量时会影响细胞的增殖 D. 培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量 3.（2022·辽宁）蓝莓细胞富含花青素等多酚类化合物。在蓝莓组织培养过程中，外植体切口处细胞被破坏，多酚类化合物被氧化成褐色醌类化合物，这一过程称为褐变。褐变会引起细胞生长停滞甚至死亡，导致蓝莓组织培养失败。下列叙述错误的是（ ） A. 花青素通常存在于蓝莓细胞的液泡中 B. 适当增加培养物转移至新鲜培养基的频率以减少褐变 C. 在培养基中添加合适的抗氧化剂以减少褐变 D. 宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体 4.（2022·辽宁）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。 Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1 （1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。 （2）质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。 Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2 （3）用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。 （4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集___________，提取单克隆抗体。 （5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。 考点03 基因工程 1.（2024·黑吉辽）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 2.（2024·黑吉辽）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 （2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 3.（2023·辽宁）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ） A. CD163基因中编码起始密码子的序列 B. CD163基因中编码终止密码子的序列 C. RFP基因中编码起始密码子的序列 D. RFP基因中编码终止密码子的序列 4.（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： （1）上述过程属于_____工程。 （2）PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 （3）某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。 （4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。 （5）目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 （6）采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 5.（2022·辽宁）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ） A. 预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 考点01 发酵工程 1．（2024·辽宁鞍山·模拟预测）发酵工程逐步完善和发展，发酵产品实现了大规模生产。下列说法正确的是（    ） A．发酵过程中培养基和设备可采用相同的方法进行消毒处理 B．发酵工程的中心环节是发酵罐内的发酵 C．通过发酵获得的单细胞蛋白是一种分泌蛋白 D．利用大麦和酵母菌发酵生产啤酒时，大部分代谢物在后发酵阶段生成 2．（2024·辽宁·模拟预测）黄酒是中国最古老的酒种，享有“酒中之祖、酒中之王”的美誉，深得大众喜爱。但研究发现黄酒中的潜在致癌物质—氨基甲酸乙酯（EC）的含量远高于其他酒。已知酒液中的EC主要由尿素和乙醇反应生成，而尿素主要由酵母菌代谢产生。下列叙述错误的是（    ） A．在黄酒工艺流程中加入酸性脲酶可起到降低EC含量的作用 B．降低黄酒中EC含量可以通过抑制CAR1基因的表达来实现 C．酒精浓度升高导致酵母菌活性下降会使发酵过程中酒精度数无法提高 D．可用二苯胺鉴定经PCR扩增后的目的基因DUR1，2的特定核苷酸序列 3．（2024·辽宁·模拟预测）乳糖不耐受患者肠道内的乳糖无法被身体吸收利用，进而被大肠内的部分菌群利用，其代谢产物包含较多气体和酸类物质，导致身体不适，如腹胀和腹泻。下列相关叙述不合理的是（    ） A．患者消化道内缺乏乳糖酶 B．乳糖为肠道菌群提供氮源 C．患者肠道内分泌液增多导致出现腹泻 D．乳糖耐受和不耐受属于相对性状 4．（2024·辽宁沈阳·三模）辽宁盛产南国梨，以南果梨为主要原料制酒，开创了世界“果粮混合固态发酵酒”之先河，该酒以果香为体、粮香为魂。下列叙述错误的是（    ） A．“果粮混合固态发酵酒”的发酵全过程均需严格的灭菌操作 B．制作该酒所需的酵母菌的代谢类型为异养兼性厌氧型 C．将南国梨先用清水冲洗再去除果柄，沥干后用于发酵 D．南国梨和粮食中的多种糖类作为发酵的物质和能量来源 5．（2024·辽宁大连·二模）野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，赖氨酸营养缺陷型突变菌株由于发生基因突变只能在添加了赖氨酸的培养基上生长。下图是以野生型菌株为材料，诱变、纯化赖氨酸营养缺陷型突变菌株的部分流程，数字代表培养基，A、B、C表示操作步骤。下列叙述错误的是（    ） A．紫外线照射可提高突变率，获得更多的突变菌株 B．B步骤采用了稀释涂布平板法在②培养基上接种 C．③培养基中不需要添加赖氨酸，不需要提供氮源 D．挑取④培养基中菌落甲进行纯化培养可获得所需突变菌株 6．（2024·黑龙江·三模）双层平板法是一种利用底层和上层均为牛肉膏蛋白胨培养基对噬菌体进行检测的常用方法。具体操作如下：先在无菌培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后，将琼脂含量为1%的培养基融化并冷却至45～48℃，然后加入宿主细菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液，充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。恒温培养一段时间后，在上层平板上看见由于噬菌体侵染周围细菌而使宿主细胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。根据噬菌斑的数目计算原液中噬菌体的数量，如图所示。下列有关叙述正确的是（    ） A．平板上的细菌和噬菌体为种间竞争关系，细菌在竞争中处于劣势 B．由于上层培养基中琼脂含量较低，双层平板法获得的噬菌斑较小 C．平板上形成的噬菌斑的数目与原液中噬菌体数量呈正相关 D．用该方法统计出的噬菌体数量一般会比噬菌体实际数量大 7．（2024·黑龙江·模拟预测）下图表示我国传统酿醋工艺的主要流程，其中糖化即淀粉水解过程。下列叙述错误的是（    ） A．加入的菌种a、b都是原核生物，细胞没有线粒体 B．蒸煮的目的是灭菌和使细胞破裂，释放淀粉 C．拌麸皮后的发酵温度应高于拌麸皮前 D．醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况 8．（2024·黑龙江·模拟预测）下列有关微生物的培养或纯化的叙述，正确的是（    ） A．高压蒸汽灭菌后，打开排气阀，待压力表指针降至“0”后开盖取物 B．采用稀释涂布平板法接种后，不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单菌落 C．在含有刚果红的培养基上，纤维素分解菌菌落周围会出现抑菌圈 D．用平板划线法分离菌种，划线4个区域，接种环需要灼烧灭菌5次 9．（2024·吉林长春·模拟预测）随着咖啡豆销量的增加，产生大量咖啡果皮果肉等附属产物。咖啡果皮果肉营养物质丰富，可将其加工成果醋。某研究小组利用含葡萄糖和酒精成分的M和N培养基，从自然发酵的咖啡果醋中分离出产酸能力高的醋酸菌，工艺流程大致如下。 下列叙述错误的是（    ） A．培养基N比培养基M中多了凝固剂 B．过程②可采用稀释涂布法进行接种 C．过程③挑取菌落与透明圈直径比值小的单菌落 D．培养基M、N均需要干热灭菌 10．（23-24高二下·吉林·期中）凯里红酸汤是贵州省凯里市特产，其颜色鲜红、气味清香、味道酸爽。凯里红酸汤的制作流程如图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．红酸汤中的酸味物质主要是乳酸菌产生的乳酸 B．食盐、大蒜、白酒等既可调味又可抑制杂菌生长 C．过期红酸汤表面产生的白膜通常与酵母菌增殖有关 D．装坛时要留1/3的空间，以创设利于发酵的有氧条件 考点02 细胞工程和胚胎工程 11．（2024·吉林长春·模拟预测）某研究小组为培育高产耐盐碱再生植株，利用甲植物细胞（细胞核基因具有耐盐碱效应）和乙植物细胞（细胞质基因具有高产效应）进行体细胞杂交，在原生质体融合前，对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合的原生质体分散固定在平板中，独立生长、分裂形成愈伤组织。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞的理由是（    ） ①甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 ②同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 ③培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 ④杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 A．①②③ B．①②④ C．①③④ D．②③④ 12．（2024·吉林·一模）请据图判断，下列说法正确的是（    ） A．由a和b形成c的过程必须依赖细胞膜的结构特点 B．若d是有性杂交后代，在体外进行时a和b均需获能处理 C．在细胞工程中，d最终都可以发育成个体 D．若d是杂交瘤细胞，其产生的单克隆抗体利用同位素或荧光标记技术可以治疗肿瘤、心血管畸形等疾病 13．（2024·吉林·一模）阿尔兹海默病是老年人常见的一种疾病，该病主要表现为患者逐渐丧失记忆和语言功能、情绪不稳定。研究发现该病是由患者大脑内某些区域的神经元中，β淀粉样蛋白异常加工，进而引起细胞大量死亡造成。下列关于其致病机理的说法不正确的是（    ） A．阿尔兹海默病与细胞内肽链的折叠错误有关 B．阿尔兹海默症患者记不住刚刚发生过的事情，可能与大脑中形状像海马的脑区神经元大量死亡有关 C．神经干细胞和iPS细胞在治疗阿尔兹海默病方面具有重要作用和前景 D．阿尔兹海默病与主导语言功能的大脑的右半球功能障碍有关 14．（2024·辽宁沈阳·模拟预测）人体细胞呼吸产生的CO2是机体生命活动的重要调节因子。以下相关说法错误的是（　　） A．人体内环境的稳态也包括体液中CO2含量的相对稳定 B．缺氧导致细胞质基质产生的CO2增多，引起呼吸频率增加，该过程属于体液调节 C．理论上，正常机体细胞内液中CO2的浓度始终高于细胞外液 D．临床上给病人输入O2时和动物细胞培养时都需加入5%的CO2，两者的目的不同 15．（2024·辽宁丹东·二模）自然情况下，牛的生育率很低，畜牧业生产上可通过下图两种途径实现良种牛的快速大量繁殖。下列相关叙述正确的是（    ） A．胚胎移植前需要用外源促性腺激素对雌性牛A与雌性牛B做同期发情处理 B．途径1和途径2过程中都有胚胎的形成，均为有性生殖 C．途径2获得的克隆牛的遗传性状完全由雌性牛C决定 D．两个途径中从雌性牛A卵巢内取得的卵母细胞都需要先体外培养至MⅡ再进行操作 16．（2024·辽宁沈阳·模拟预测）下图是一种“生物导弹”的作用原理示意图，没有与肿瘤细胞结合的“生物导弹”一段时间后被机体清除。阿霉素是一种抗肿瘤药物，可抑制DNA和RNA的合成，对正常细胞也有一定毒性。下列说法正确的是（　　） A．杂交瘤细胞释放单克隆抗体，体现了细胞膜具有一定的选择透过性 B．活化阿霉素不具有选择性杀伤肿瘤细胞的功能 C．仅注射图示“生物导弹”就能抑制肿瘤细胞内DNA和RNA的合成 D．使用图示“生物导弹”，可以大量增加阿霉素用量 17．（2024·辽宁大连·二模）毛花猕猴桃为二倍体，果实大，维生素C含量高。软枣猕猴桃为四倍体，极耐寒，在-40℃下可安全越冬。农科所想利用下图技术流程培育兼具这两种猕猴桃优点的新品种。下列叙述正确的是（    ） A．新品种是通过植物组织培养技术获得的 B．新品种的体细胞中含有三个染色体组 C．①处用相关酶的低渗溶液处理可获得原生质体 D．从愈伤组织到新品种的过程需要经历低温筛选 18．（2024·辽宁·二模）人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，常作为女性是否怀孕的检测指标。某科研人员将小鼠B细胞和骨髓瘤细胞融合后，经过筛选获得能稳定分泌抗 HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞。下列相关分析错误的是（    ） A．获取小鼠 B细胞之前需给小鼠多次间隔注射 HCG B．可采用灭活的病毒诱导B细胞与骨髓瘤细胞融合 C．应将抗体检测呈阴性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养 D．抗 HCG 单克隆抗体比普通抗 HCG 抗体检测女性怀孕的准确率更高 19．（2024·黑龙江·三模）下图是利用体细胞核移植来克隆高产奶牛的大致流程示意图。下列相关叙述错误的是（    ） A．体外培养至MⅡ期的卵母细胞要先经过获能处理才能用于后续操作 B．图中过程①常用显微操作法去除细胞中的纺锤体和染色体的复合物 C．图中过程③是将供体细胞整个注入去核卵母细胞中 D．图中的重构胚中含有卵母细胞和供体细胞的细胞质 20．（2024·黑龙江·模拟预测）视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是一种自身免疫性疾病，病因是机体产生了水通道蛋白4（AQP4）的抗体。NMOSD的诊断依赖对外周血的检测，检测过程如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．图示操作的目的是检测患者体内是否存在AQP4抗体 B．荧光标记的“二抗”会与结合在AQP4上的抗体结合 C．患者的检测结果应为在细胞质中观察到免疫荧光 D．这种检测方法保持了抗原结构，因此具有较高的特异性 考点03 基因工程 21．（2024·辽宁沈阳·三模）将荧光蛋白基因与目的基因连接后导入植物体细胞中、其表达产物既具有荧光蛋白的特性，又保持了目的基因表达产物的活性，因此可以通过检测荧光强度来检测目的基因的表达水平。下列有关该技术的说法、错误的是（    ） A．可使用同种限制酶切割荧光蛋白基因和目的基因以便连接 B．需要将荧光蛋白基因和目的基因分别连接在不同的启动子后面 C．荧光强度高的细胞，目的基因的表达水平一般也高 D．荧光蛋白还可用于检测目的基因表达产物的转移和分布情况 22．（2024·黑龙江·三模）中国科学家领衔的国际团队发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（    ） A．研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B．PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C．DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D．一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物 23．（2024·黑龙江大庆·模拟预测）常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B．环化阶段，可选E．coliDNA连接酶而不能选T4DNA连接酶 C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者不能互补配对 D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 24．（2024·辽宁沈阳·模拟预测）S基因与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。已知S基因转录的模板链位于b链，转录时mRNA自身的延伸方向为5’→3’。如下图，为使S基因按正确方向与质粒连接，酶切目的基因时选用的限制酶组合是（    ） A．BamHⅠ和HindⅢ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．MunI和BamHⅠ D．EcoRⅠ和HindⅢ 25．（2024·辽宁·模拟预测）病毒性疾病具有一定的传染性和危害性，临床诊断病毒的类型对于对症治疗具有重要意义。下列关于病毒诊断方法的原理及其适用范围的叙述，错误的是（　　） 选项 诊断方法 具体操作 原理 适用范围 A 病毒中和 固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，再比较病毒被中和后的感染力 抗原与抗体特异性结合 DNA病毒和RNA病毒 B 免疫PCR 用抗体来捕获抗原，提取核酸后，再用PCR扩增 抗原与抗体特异性结合 DNA病毒和RNA病毒 C 核酸杂交 先将待测核酸固定在膜上，然后用放射性同位素标记的单链核酸与其进行杂交，使杂交体带上标记而被显示出来 碱基互补配对原则 DNA病毒和RNA病毒 D 快速免疫滤纸测定 把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上，结合抗原后可以发生显色反应 抗原与抗体特异性结合 DNA病毒和RNA病毒 A．A B．B C．C D．D 26．（2024·辽宁大连·模拟预测）有一环状双链DNA，其中一条链的核苷酸片段序列为：CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA（共30个碱基，其中G+C=18个）限制酶EcoRⅠ在单链上的识别位点序列为GAATTC，下列叙述错误的是（    ） A．该单链片段中G+C占比为60%，其互补片段中A+T占比为40% B．用EcoRⅠ切该环状双链DNA，至少会产生2个片段 C．如果该环状DNA缺失了一个碱基对，用EcoRⅠ可能切不开该DNA D．若该DNA分子连续复制2次，共需要消耗36个腺嘌呤脱氧核苷酸 27．（2024·吉林·模拟预测）DNA受紫外线照射时，会使同一条DNA链上相邻的嘧啶通过共价键连接成二聚体，相邻的两个T或两个C或C与T间都可以环丁基环连成二聚体，其中最容易形成的是T—T二聚体，进而导致DNA受到破坏。如图是紫外线照射导致DNA受损后的修复过程。下列相关叙述错误的是（　　） A．紫外线会影响DNA的双螺旋结构从而使 DNA 分子复制受阻 B．图示紫外线损伤的DNA分子中嘌呤与嘧啶的比例会有所升高 C．外切酶可找到损伤位点并切开 DNA链，与酶的专一性有关 D．修复过程中以未损伤的DNA 链作为模板，用DNA连接酶封闭切口 28．（2024·吉林长春·模拟预测）科研人员将蜂毒肽（MEL）与石斑鱼c型溶菌酶（Ec-cLYZ）基因插入pPICZaA质粒上构建重组表达质粒，导入毕赤酵母以获得高效低毒的广谱抑菌融合蛋白，实验的主要流程如图所示，为获得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同时两端带有pPICZαA的同源序列，过程①PCR反应体系中应选择的引物是（    ） A．5′-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3′ B．5′-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3′ C．5′-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3′ D．5′-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3′ 29．（2024·吉林长春·模拟预测）DNA粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”，下列说法正确的是（    ） A．实验材料可以选择猪的成熟红细胞或肝细胞 B．将研磨液从冰箱中取出后取沉淀物继续进行实验 C．进行DNA鉴定时，对照组不需要加入DNA D．可以利用DNA溶于酒精的特性将DNA提取出来 30．（2024·吉林·模拟预测）基因工程、细胞工程都可以克服远缘杂交不亲和的障碍，在农作物新品选育等方面具有广阔的前景和较高的应用价值。为达到相应目的，必须通过分子检测的是（    ） A．筛选含有青霉素抗性基因的大肠杆菌 B．筛选产生新冠病毒抗体的杂交瘤细胞 C．转基因耐盐水稻植株耐盐效果的鉴定 D．检查卵母细胞受精状况和受精能力 31．（2024·吉林长春·模拟预测）防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子。β﹣防御素是一种由H基因编码的抗菌肽，获得了β﹣防御素。回答下列问题： (1)为获得β﹣防御素基因，研究者利用致病细菌的脂多糖（LPS）刺激结肠癌细胞株提高β﹣防御素的表达量，经过 后，作为模板进行PCR扩增。PCR产物常采用 来鉴定，鉴定后进行测序。测序结果与 数据库中的公开数据进行比较，进而得到正确的β﹣防御素基因。 (2)本实验选用毕赤酵母表达载体pPIC9K（如图），扩增目的基因时设计的1对引物为P1（5′ATCGAATTCATGGGAAGTCATAAACACATTAGA3′）和P2（5′TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT3′）。 ①本实验中引物的作用是 （答出2点即可）； ②部分限制酶识别序列及切点如下表，结合图中限制酶切点与引物，推测本实验酶切时 ，采用双酶切法的优势是 （答出2点即可）。 限制酶 识别序列及酶切位点 BglⅠ 5′…A↓GATCT…3′ EcoRⅠ 5′…G↓AATTC…3′ SnaBⅠ 5′…TAC↓GTA…3′ SacⅠ 5′…GAGAT↓C…3′ AurⅠ 5′…C↓CTAGC…3′ SalⅠ 5′…G↓TCGAC…3′ NotⅠ 5′…GC↓GGCCGC…3′ (3)毕赤酵母表达系统最大的优点是可对β﹣防御素 （答出2点即可），直接表达出具有生物活性的产品。 (4)毕赤酵母表达系统发酵结束后，采取适当的 措施来获得产品。 32．（2024·黑龙江哈尔滨·三模）抗凝血酶Ⅲ（AT—Ⅲ）是血浆中最重要的抗凝血成分，它主要由肝脏合成后进入血液。AT—Ⅲ水平降低可发生血栓或DIC（弥散性血管内凝血）。利用乳腺生物反应器可以让哺乳动物批量生产人的AT—Ⅲ用于治疗相关疾病，其过程如图所示。亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸，四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列相关问题： 注：质粒S中的Leu为亮氨酸合成酶基因，GFP为绿色荧光蛋白基因 限制酶 BamHI BgIⅡ Hindll Xbal 识别序列和切割位点 -G↓GATCC- -A↓GATCT- -A↓AGCTT- -T↓CTAGA- (1)为获取人的抗凝血酶Ⅲ基因，提取人肝细胞的mRNA，经 过程得到cDNA，经PCR扩增后对其产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与 等有关（答出两点）。如果电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因 （答出两条）。 (2)构建基因表达载体时，②过程为利用限制酶 切割得到产物B。为使AT—Ⅲ基因在乳腺细胞中特异性表达，应将AT—Ⅲ基因与 的启动子等调控元件重组在一起。为达到筛选目的，培养基的营养成分中不应含有 。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出 （选填“显示”或“不显示”）绿色荧光的细胞用于过程⑤。 (3)⑨过程是指胚胎移植，该过程的实质是 ，为筛选雌性胚胎，在胚胎移植前应从囊胚中 的取样做DNA分析，鉴定性别。 33．（2024·吉林·一模）紫杉醇是目前最好的抗肿瘤药物之一，但其药源植物红豆杉十分稀缺。大多数红豆杉细胞培养物的紫杉醇产量较低，研究人员通过构建紫杉醇合成关键酶（Bapt）基因表达载体来进一步提高红豆杉细胞紫杉醇产量，请回答下列问题：（MspI、BamHI、MboI、SmaI4种限制酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG） (1)紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内的一种 （填“初生”或“次生”）代谢物，具有高抗癌活性，与从红豆杉的树皮和树叶中提取紫杉醇相比，利用植物细胞培养技术获得紫杉醇的优点是 （答出1点即可）。 (2)图1表示Bapt基因（D基因）的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，用限制酶MspI完全切割图1中DNA片段，则产物中共有 种不同长度的DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，再用限制酶SmaI完全切割，其产物长度分别为 bp。 (3)图2表示所用质粒的结构和部分碱基序列。若用同种限制酶处理图1、图2中的两种分子，以便构建重组质粒，最好选用的限制性核酸内切酶是 。 (4)为了获得含重组质粒的单个大肠杆菌的菌落，一般需要用添加 的固体培养基进行筛选，常用的接种方法是 。 (5)能否通过Bapt基因探针来检测目的基因是否成功导入受体细胞?为什么? 。 34．（2024·辽宁鞍山·模拟预测）产脂肪酶酵母可用于处理含油废水，同时可获得蛋白质。有研究人员尝试从餐馆厨房污水排放沟取样，筛选产脂肪酶酵母菌株，初步流程如下图所示。据图回答下列问题： (1)Ⅰ号培养基中应选择 作为唯一的碳源。 (2)过程③的接种方式为 。要判断所制备的培养基是否具有筛选作用，同时还需将样本接种到牛肉膏和蛋白陈的完全培养基上，若 ，说明具有筛选作用。 (3)酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母菌的絮凝能力，有助于发酵结束时细胞和产物的分离，可大幅节约生产成本。科研人员发现酵母菌的R基因对絮凝能力有一定的抑制作用，下图表示科研人员利用同源重组（在两个DNA分子的同源序列之间直接交换的一种重组）基因敲除技术敲除R基因的过程。 ①研究人员将整合了lox序列的庆大霉素抗性基因导入酵母菌，lox-庆大霉素抗性基因通过同源重组的方式整合到酵母菌基因组中，重组片段上庆大霉素抗性基因的作用是 。利用PCR技术检测1ox-庆大霉素抗性基因是否替换R基因，扩增时引物应选择下图中的 。在PCR延伸阶段中 催化脱氧核苷酸连接到引物上。 ②将导入PC质粒的酵母菌，接种于添加 的马铃薯琼脂培养基中，获得敲除R基因且无庆大霉素抗性基因标记的酵母菌。Cre酶与基因工程中 （工具酶）作用类似，上述过程中其发挥作用时需断裂 个磷酸二酯键。 35．（2024·辽宁·模拟预测）图1为Ti质粒的部分结构示意图，①～⑥为部分限制酶识别位点，LB与RB为T－DNA左边界序列和右边界序列，tms与tmr为激素基因，Tetr为四环素抗性基因，Ori为复制原点，Pro为启动子。图2为部分限制酶及其识别序列与切割位点。回答下列问题： (1)研究人员分别将质粒A（结构如图1）、质粒B（去除了图1中tms与tmr的Ti质粒）、质粒C（去除了图1中LB或RB的Ti质粒）导入不含质粒的农杆菌中，将导入质粒的农杆菌与植物外植体分别共培养后，研究人员认为LB与RB是T－DNA进入植物细胞不可缺少的结构，与该结论相对应的实验结果是 。为获得胚状体或试管苗，研究人员用携带了质粒B的农杆菌侵染植物，而不用携带质粒A的农杆菌，原因最可能是 。 (2)在农杆菌侵染植物的过程中，农杆菌会产生酶甲，甲将T－DNA的一条核苷酸链切割下来，该单链进入植物细胞后形成双链，甲识别与切割的序列应为T－DNA中的 ，甲 （填“属于”或“不属于”）限制酶，理由是 。在利用质粒B构建表达载体时，需在目的基因的首尾两端添加限制酶的识别序列，在目的基因尾端最宜添加的序列是 ，理由是用该限制酶处理质粒与目的基因时 。 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