1.2 微生物的培养技术课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

你知道微生物是什么吗？ 微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。涵盖了有益跟有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保、体育等诸多领域。在我国教科书中，将微生物划分为以下8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体。 微生物的基本培养技术 从社会中来 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？ 4 目录 Contents 1 培养基的配制 2 无菌技术 3 微生物的纯培养 5 培养基的配制 1 【资料1】 培养基的配制 1 【资料2】 100g马铃薯中含有：水80g 蛋白质2g 碳水化合物16g 维生素 无机盐 培养基的配制 1 【任务一】 结合提供的资料和教材中“表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析培养微生物的培养基的种类和营养构成。 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素 蛋白胨 10g 氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000mL 水 培养基的配制 1 1.1培养基 (1)概念：人们按照微生物对____________的不同需求，配制出供其生长繁殖的____________。 营养物质 营养基质 培养基的配制 1 (2)基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐 ①碳源 无机碳源： 有机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、石油等 自养 异养 ②氮源 无机氮源： 有机氮源： NH4＋、NO3-、硝酸盐、铵盐 牛肉膏、蛋白胨、尿素等 ③水 ④无机盐 ⑤其他要求： PH、O2、特殊物质 （生长因子、氨基酸、维生素、碱基等） 培养基的配制 1 琼脂的作用 （3）培养基的种类 按培养基的物理性质分 液体培养基 固体培养基 加凝固剂 （如琼脂） 图1-6 盛有液体培养基的锥形瓶和长有酵母菌菌落的固体培养基 用于工业生产 用于微生物分离，鉴定以及活菌计数等 按功能分： 种类 制备方法 原理 用途 举例 选择培养基 加入某些化学物质 依据某些微生物对某些物质的特殊要求或抗性而设计 从众多微生物中分离 加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌 鉴别培养基 加入某种指示剂或化学药品 产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌 2 无菌技术 【任务二】 结合教材中有关无菌技术的内容，说出消毒和灭菌的原理、主要方法和所需要的设备，比较两者对微生物作用效果的差异。 比较项目 理化性质的作用强度 能否杀死所有微生物 能否杀死芽孢和孢子 消毒 灭菌 较为温和 比较强烈 能 能 否 否 2 无菌技术 类型 条件 结果 常用方法 应用范围 消 毒 灭 菌 1.2无菌技术：消毒和灭菌的比较 仅杀死物体表面或内部的部分微生物 较为温和的物理或化学方法 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒法 紫外线消毒法 灼烧灭菌法 干热灭菌法 （高压蒸汽灭菌法） 日常用品 不耐高温的液体 酒精——双手 氯气——水源 接种室（箱） 超净工作台 接种工具 玻璃器皿、金属工具 培养基 （关键是防止外来杂菌污染） 2 无菌技术 ②干热灭菌： 160-170℃ 加热1-2h。 ③高压蒸汽灭菌： 100kPa、121℃ 15-30min。 ①灼烧灭菌 2 无菌技术 无菌技术的方法、类型和对象[连一连] 【例】 (2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌 来避免杂菌的污染。回答下列问题： (1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以（填“可以”或“不可以”） 放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。 (2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这 两种方法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。 （二）无菌技术 (3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能破坏DNA结 构。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。 (4)水厂供应的自来水通常是经过氯气（填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”） 消毒的。 (5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达 到相应温度，最可能的原因是未将锅内冷空气排尽。 （二）无菌技术 练习与应用 5．“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防新冠病毒感染的有效措施之一、某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目。 (1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供_________________等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入_____。为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量_____的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～30min。 碳源、氮源、水、无机盐 琼脂 水 19 练习与应用 (2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的_____，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是 __________________________________。 (3)统计甲乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应进行__________________________________等处理（至少写出1种）。 (4)有同学认为乙中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确。_____。 接种 避免周围环境中的微生物污染培养基 酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套 再加一个不接种的相同培养基（空白培养基），与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，则猜想正确 20 （三）大肠杆菌的纯化培养 1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 （1）操作步骤 计算 称量 溶化 灭菌 倒平板 培养基的配制 （2）倒平板的方法及注意事项 ①酒精灯灭菌的方法是灼烧灭菌； ②冷却倒置的目的：即可使培养基表面的水分更好的挥 发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 （三）大肠杆菌的纯化培养 配置培养基 灭菌 倒平板 1、培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 2、为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 思考与讨论1 3、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 2.纯化培养的原理：在培养基上得到的由一个细胞繁殖 而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。 3.纯化大肠杆菌的关键步骤：接种 （三）大肠杆菌的纯化培养 4.接种方法 （1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面 连续划线的操作，将聚集的菌种逐步分散到培养 基的表面。 （用于菌种分离、纯化，最终获得单个菌落） （三）大肠杆菌的纯化培养 1 2 3 4 平板划线法 （三）大肠杆菌的纯化培养 接种方法： 平板划线法 ①每次划线的菌液均来自上次划线的末端，能使细菌数 目随划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细 菌繁殖而来的菌落。 ②最后一区不可与第一区相连； ③每次划线，均要灼烧并冷却接种环，冷却的目的是防 止温度太高杀死菌种。 注意事项 （三）大肠杆菌的纯化培养 1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么? （1）操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； （2）每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 （3）划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 思考与讨论2 2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 3、在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （2）注意事项 ④灼烧的目的 第一次划线 每次划线前 划线结束 目 的 杀死接种环上 原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数量减少 杀死接种环上残存的菌种，避免污染环境和感染操作者 （三）大肠杆菌的纯化培养 2.接种方法 （2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释， 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养 基的表面，进行培养。 （用于菌种分离、计算） （三）大肠杆菌的纯化培养 稀释涂布平板法 （三）大肠杆菌的纯化培养 1、涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。 思考与讨论3 四、结果分析与评价 1、培养基的制作是否合格？ 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 2、接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点， (在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐)则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，(在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。)则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 5.菌种的保存方法 临时保藏：4℃冰箱 长期保存：-20℃甘油冷冻管藏法 （三）大肠杆菌的纯化培养 【例】(2019·江苏，12)下列关于微生物实验操作的叙述， 错误的是（ A ） A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌 B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧 C.接种后的培养皿要倒置，以防培养污染 D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基 （三）大肠杆菌的纯化培养 【解析】培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工 具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错 误；接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生 物对实验结果造成干扰，接种后灼烧可以防止微生物扩散，污染接种室或者 超净台，影响整体接种环境，B正确；接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落 入培养基造成污染，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离 和菌落的计数可以使用固体培养基，D正确。 （三）大肠杆菌的纯化培养 【例】（2019全国卷III·37）回答下列与细菌培养相关的问题。 （1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是蛋白胨（填 “蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养 细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是不同细菌生长繁殖所需的最适pH 不同。硝化细菌在没有碳源的培养基上能够（填“能够”或“不能”）生长， 原因是硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源。 （三）大肠杆菌的纯化培养 （2）用平板培养细菌时一般需要将平板倒置（填“倒置”或“正置”）。 （3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大 小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是： 在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征。 （4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理，这种处理可以杀死 丢弃物中所有的微生物。 （三）大肠杆菌的纯化培养 【解析】葡萄糖只能为细菌提供碳源，硝酸钠为细菌提供无机盐，而蛋白胨 既可以为细菌碳源，也可以为细菌提供氮源；由于不同的细菌生长繁殖的最 适宜pH是不同的，因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养 基的pH；硝化细菌属于化能自养型微生物，其可以利用氨氧化释放的能量将 空气中的二氧化碳固定为有机物，因此硝化细菌可以在无碳培养基中生长。 （2）用平板培养细菌时，一般需要将平板倒置培养，以防止皿盖上的水珠 落入培养基，造成污染。 （3）由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也 各异，因此根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。 （4）有些使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 （三）大肠杆菌的纯化培养 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $$