3.2 基因工程的基本操作程序-第一步（第一课时)课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第三章 基因工程 3.2 基因工程的基本操作程序 1 2 基因表达 载体的构建 3 将目的基因 导入受体细胞 4 目的基因的 检测与鉴定 1 目的基因的 筛选与获取 基因工程培育抗虫棉的思路： 苏云金杆菌 提取 Bt抗虫蛋白基因 导入 棉花细胞 抗虫棉 Bt基因表达 2 1.概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因， 主要是指______________________。 编码蛋白质的基因 2.实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因等。 一、目的基因 3 3 二、筛选合适的目的基因 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 对Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白有了较深入的了解 Bt基因是培育 转基因抗虫棉 较为合适的 目的基因 4 Bt基因 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 相关信息： Bt抗虫蛋白的抗虫原理： 抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 5 5 序列数据库，如Genbank 序列比对工具，如BLAST （Basic Local Alignment Search Tool) 生物信息学数据库 二、筛选合适的目的基因 6 序列数据库，如Genbank 序列比对工具，如BLAST （Basic Local Alignment Search Tool) 生物信息学数据库 网址： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ 包括：所有已知的核苷酸及蛋白质序列、以及与之相关的生物学信息和参考文献 简介：美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇集并注释了所有公开的核酸序列 与日本DNA数据库（DDBJ）和欧洲分子生物学实验室核酸数据库（EMBL）构成国际核酸序列数据库合作，每天交换数据 检索方式：输入基因名称、物种名称 二、筛选合适的目的基因 7 序列数据库，如Genbank 序列比对工具，如BLAST （Basic Local Alignment Search Tool) 生物信息学数据库 网址：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 简介：可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。 二、筛选合适的目的基因 包括： 8 三、利用PCR获取和扩增目的基因 1. 概念：PCR（Polymerase Chain Reaction）全称为___________________，是一项在生物________复制___________________的核酸合成技术 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 9 2. PCR利用的原理： DNA半保留复制 ①模板：母链为模板 ②原料：四种脱氧核苷酸（A、T、G、C） ③能量：ATP ④酶：解旋酶和DNA聚合酶 步骤1：1956年，美国生物化学家康贝格在试管中，将大肠杆菌中提取出的解旋酶、DNA聚合酶等酶加入到具有四种丰富的脱氧核苷酸的人工合成体系中。 结果：不能合成DNA分子 步骤2：康贝格在上述试管中加入了少量DNA分子作为引子,并加入ATP，培养在适宜温度条件下，一段时间后，测定其中DNA的含量。 结果：试管中的DNA的含量增加。 推测，DNA的复制条件有： 10 2. PCR利用的原理： DNA半保留复制 11 2. PCR利用的原理： DNA半保留复制 先导链 后随链 RNA引物 冈崎片段 解旋方向 母链双螺旋结构 RNA引物(RNA primer)，是DNA复制时合成的一小段RNA，长度大约为10个（5~15个）核苷酸,作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制，由于DNA聚合酶不能直接在模板链上合成DNA链，只能从已有的核苷酸的3′—OH端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。 12 13 2. PCR利用的原理： DNA半保留复制 3.DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 RNA引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的 3’端开始连接脱氧核苷酸 引物是一小段能与____________的一段碱基序列__________的____________ DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 14 4. PCR所需的条件 DNA模板 耐高温的DNA聚合酶 （见P16) 一对引物 dNTPs 引物1 引物2 思考： ①需要解旋酶吗？ ②需要ATP吗？ ③需要能量吗？ 加Mg2+ 15 dATP dGTP dTTP dCTP dNTPs （三磷酸脱氧核糖核苷） DNA聚合酶催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3’—羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸α—磷原子发生亲核攻击，从而形成3’，5’—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi），形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解。 16 ①设计引物的依据是： ②使用的一对引物的序列相同吗？ 目的基因两端的核苷酸序列 不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列 *两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增 ③引物设计的要求（或引物失效的原因） ④每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因 ⑤两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因 ⑥两种引物都结合在DNA模板链的_____端。在DNA聚合酶作用下进行延申，4种脱氧核苷酸加到引物的_____端、 3’ 防止引物自身形成发夹结构 防止引物之间配对，形成引物二聚体， 导致引物不能同模板链结合 3’ 每种引物内部不能发生局部碱基互补配对 两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对 引物的设计 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 引物2 4. PCR所需的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 RNA引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的 3’端开始连接脱氧核苷酸 用高温代替 4种三磷酸脱氧核苷酸dNTPs 耐高温的DNA聚合酶 一对DNA引物(通常为20~30个核苷酸) 引物是一小段能与____________的一段碱基序列__________的____________ DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 18 5.PCR的过程 90 50 72 ℃ 延伸 90 50 72 ℃ 变性 90 50 72 ℃ 复性 （退火） 19 a、变性（超过90℃）：双链DNA模板在热作用下， 断裂，形成 。 b、复性（下降到50℃）：系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部 。 c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的的 在 的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板互补的 的新的DNA链。 氢键 单链DNA 双链 4种脱氧核苷酸 5′端→3′端 耐高温的DNA聚合酶 20 Lavf58.51.100 $$