专题18 基因工程-【好题汇编】2024年高考生物三模试题分类汇编（新高考通用）

专题18 基因工程 一、单选题 1、（2024·天津滨海新·三模）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 2、（2024届河北省保定市十校高三下学期三模）近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（    ） A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构 B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列 C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列 D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因 3、（辽宁省部分学校2024年高三临考押题考试（三模））为了提高构建基因表达载体的效率，通常会运用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，图1、图2表示含有目的基因的DNA片段和质粒上限制酶的识别位点，表中为各种限制酶的识别序列和切割位点。下列叙述错误的是（　　）    限制酶种类 BamH I Bcl I Hind III EcoR I 识别序列及切割位点          A．对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行切割以获取目的基因 B．BamHⅠ和Bcl Ⅰ是同尾酶，二者的切割位点不同 C．图中启动子的作用是作为DNA 聚合酶识别和结合部位 D．将该重组质粒导入动物细胞常用显微注射法 4、（2024届辽宁省高三联考三模）某种嗜热细菌，其栖息的热泉水温可达90℃左右，若该细菌DNA分子中含有胞嘧啶脱氧核苷酸M个，下列关于嗜热细菌的叙述错误的是（    ） A．该细菌DNA聚合酶可以应用于PCR技术 B．该细菌DNA分子中的每个磷酸基团都与2个脱氧核糖相连 C．该细菌DNA分子的碱基中A+T/G+C的比例可能较高 D．该细菌DNA分子第n次复制时需要游离的胞嘧啶脱氧核苷酸M×（2n-1）个 5、（2024届辽宁省高三·三模）通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身的细胞在体外诱导发育成特定的组织器官，然后再移植回患者体内。图1和图2 表示利用自身细胞进行器官移植的两种方法，其中诱导多能干细胞（iPS 细胞）类似于人类的胚胎干细胞。下列叙述正确的是（    ） A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中 B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者的完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥反应 C．可利用农杆菌转化法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox基因、c-Myc 基因和Klf基因导入成纤维细胞 D．图2中卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可整个注入去核的卵母细胞中 6、（2024·吉林长春·三模）基于AI（人工智能）的蛋白质设计方法可通过现有蛋白质数据库及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构和功能。下列叙述错误的是（    ） A．AI预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则 B．AI可帮助人们深入了解蛋白质分子结构和功能的关系 C．获得AI设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现 D．AI可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质 7、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（    ）    A．DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理 C．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 8、（2024·黑龙江大庆·三模）T4溶菌酶（Ao）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程将T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作 B．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质 C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中 D．A0和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因 9、（2024·浙江·三模）各类生物因子、生物技术误用滥用等会引起生物性危害。以下不会带来生物安全风险的是（    ） A．核污水排入海洋导致生物变异 B．转基因抗虫作物长期大规模种植 C．克隆技术用于器官移植和人体克隆 D．禁止生物武器及其技术、设备的扩散 10、（2024·福建宁德·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅰ）和“绿叶中色素的提取和分离”（实验Ⅱ）的相关叙述错误的是（    ） A．两个实验都使用酒精溶解物质 B．两个实验都需要将实验材料进行充分研磨 C．实验Ⅰ粗提取的DNA呈现蓝色，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色 D．实验IDNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同 11、（2024·湖北·三模）棉蚜体内有多种寄生蜂的卵。初级寄生蜂将卵产于棉蚜体内，幼虫取食棉蚜组织导致棉蚜死亡，形成低蚜。重寄生蜂的卵在初级寄生蜂的幼虫体内孵化并从中获得营养。现利用PCR技术对僵蚜及其体内寄生蜂种类进行检测，为了一次鉴定出多种目标昆虫，加入同一PCR体系的引物应满足（    ） ①每对引物扩增的序列对应一种昆虫 ②每对引物扩增的序列对应多种昆虫 ③每对引物扩增的产物长度不同 ④每对引物扩增的产物长度相同 ⑤所有引物之间不能相互配对 ⑥所有引物的长度相同 A．①③⑤ B．②④⑥ C．②③⑥ D．①④⑤ 12、（2024·湖南衡阳·三模）当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是（    ）   A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因 B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与 C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质 D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121质粒的植株作对照 13、（2024·湖南永州·三模）HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分 B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRI和HindⅢ的识别序列，拼接前载体用MfeI和HindⅢ切割 C．利用PCR扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压稳定 D．利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋白可以大规模用于禽流感疫苗制备 14、（2024·湖南衡阳市祁东县·三模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为（    ） A．引物1和引物4 B．引物2和引物6 C．引物2和引物4 D．引物3和引物5 15、（2024·广东茂名·三模）不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（    ） A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计 B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸 D．该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物 16、（2024·广东·三模）蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时代。如通过蛋白质工程，将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸，就可以使其保存半年，而活性不受影响。下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是（　　） A．蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相同 B．蛋白质工程需要改造或合成蛋白质的编码基因 C．对干扰素的改造无需考虑其空间结构 D．蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列 17、（2024·重庆渝中·三模）技术是基因工程中获取目的基因的重要手段，其原理与体内复制类似。图1、图2、图3是与有关的三幅图解，下列相关叙述正确的是（    ）   A．通过3次图1过程的循环即可从含目的基因的分子中分离出目的基因 B．图2中第1组引物适合进行，第2组引物不适合进行 C．图3可反映体系中热稳定性聚合酶的功能 D．体内复制和中的引物都是核糖核苷酸链 18、（2024·贵州·三模）细胞色素C是细胞中普遍含有的一种蛋白质。利用DNA分子杂交技术和测定DNA的热稳定性可以判断生物亲缘关系的远近。实验思路如图所示，下列有关说法错误的是（    ） A．DNA的提取利用了DNA与蛋白质等物质在物理和化学性质方面存在差异的特点 B．获得的杂合双链DNA分子，配对的碱基对越多，结构越稳定，变性温度越高 C．T甲-甲-T甲-丙大于0说明甲和丙的DNA序列不同，但甲与丙细胞色素C的结构可能相同 D．由上述结果可以推测，甲与乙的亲缘关系比甲与丙的亲缘关系近 19、（2024·甘肃白银·三模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为（    ） A．引物1和引物4 B．引物2和引物6 C．引物2和引物4 D．引物3和引物5 二、多选题 1、（2024届河北省保定市十校高三下学期三模）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒，该质粒的部分结构如图所示，其中J基因序列表达J蛋白，V5编码序列表达短肽V5。下列叙述错误的是（    ） A．作为基因表达载体，该重组质粒通常还需具有标记基因等结构 B．用F2、R2作引物进行PCR检测，可确定J基因插入方向是否正确 C．通过启动子的位置和引物的方向可判断该融合基因转录的模板是a链 D．该启动子高度甲基化对该基因在受体细胞中表达J-V5融合蛋白有利 2、（2024届辽宁省高三联考三模）终末期心脏病患者需要进行心脏移植，但移植过程中往往会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤，如图所示。下列说法正确的是（    ） A．供者与受者的主要组织相容性抗原一半以上相同，方可进行器官移植 B．重组质粒除了包含目的基因、标记基因外，还必须有启动子和终止子 C．细胞凋亡中会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8蛋白的过程 D．基因沉默复合物，抑制遗传信息的翻译过程，使Caspase8基因沉默 3、（2024·辽宁·三模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合不可能为（    ） A．引物1和引物4 B．引物2和引物6 C．引物2和引物4 D．引物3和引物5 4、（2024·辽宁抚顺·三模）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD—1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD—1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析正确的是（       ） A．敲除2、3、4片段引起的变异属于基因重组 B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNA C．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子 D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD—1 5、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析正确的是（    ） A．对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成 B．生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列 C．可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2 D．构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I 三、非选择题 1、（2024·天津北辰·三模）毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。 (1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入 和 。 (2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg基因两侧的A和B端分别添加的碱基序列是 、 。 (3)过程③需用一定浓度的 处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。 (4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是 ，获得的重组DNA的长度为 。 (5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是 。 2、（2024·天津滨海新·三模）抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。    (1)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆In-Fusion技术（图2），其中In-Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。    ①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In-Fusion反应。 如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段 。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过 处理的农杆菌中。 ②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物 扩增目的基因并电泳检测。请在图4中画出阳性菌落（成功转入目标重组DNA分子的菌落）的电泳结果 。 (2)农杆菌转化愈伤组织时，用含 的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基因GUS在 细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，假阳性的农杆菌 （出现/不出现）蓝色。 3、（2024·河北承德·三模）培育抗草甘膦转基因大豆时，首先需要构建UTR—CTP—EPSPS序列（UTR—前导序列；CTP—叶绿体定位信号肽序列；EPSPS—抗草甘膦基因）和pCAMBIA1300质粒的重组载体，构建过程如图所示。重组载体通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R中，经测序验证后导入农杆菌菌株EHA105中形成转化的工程菌株，再转染大豆。回答下列问题： (1)构建UTR—CTP—EPSPS序列与pCAMBIA1300质粒的重组载体过程中，进行PCR时需要在两种引物的 端连接限制酶 的识别序列，引物序列的确定应依据 ，PCR依据的原理是 。 (2)重组质粒PTWGM1接入的UTR—CTP—EPSPS序列中，EPSPS基因与CTP绑定的目的是 。利用质粒PTWGM1可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS片段，是因为其结构中含有 。 (3)质粒PTWGM1通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R的关键是利用电脉冲在 处打开通道，使得外源DNA能够顺利进入细胞内。要确定细胞电转化是否成功，需要在培养大肠杆菌的培养基中添加 进行筛选。 (4)若要回收EPSPS片段，可将扩增产物通过电泳进行分离后，割下凝胶以回收扩增的EPSPS基因。在凝胶中DNA分子的迁移速率与 （答出两点）有关。若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是 （答出一点）。 4、（2024·河北邯郸·三模）通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合1c1'-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。回答下列问题： 限制酶 EcoR I BamH I HindⅢ Xma I 识破序列和切割位点 5'—G↓AATTC—3' 5'—G↓GATCC—3' 5'—A↓AGCTT—3' 5'—C↓CCGGG—3' (1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是 。 (2)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，若目的基因扩增3代，则共用引物 个。PCR完成以后，常采用 法来鉴定PCR的产物。 (3)过程①中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加 、 限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加 基因两端的同源序列。 (4)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除 LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对 LacZ 基因进行回补，筛选 LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加 。 5、（2024·河北秦皇岛·三模）α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β和γ环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和89位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt 催化特异性提高了27倍。请回答下列问题。 (1)蛋白质工程的第一步通常是确定预期的 。重叠PCR是常用的DNA定点突变技术，其原理如图所示。与细胞内的DNA复制相比，PCR不需要用到 酶。要完成两处位点的突变，至少要设计 种引物。 (2)下图是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸（密码子：GAU、GAC）到赖氨酸（密码子：AAA、AAG）的引物FP2和RP1中三个连续碱基，分别为 、 。 (3)用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题。重组cgt位于双突变载体（简称Ｔ载体）上，研究人员将重组cgt基因与pET-20b（+）载体（简称p载体）上的pelB信号肽序列连接，构成重组载体cgt-p，该过程如图所示。应选用 、 对T载体酶切处理，用 、 对p载体进行酶切处理，并用 酶构建重组载体cgt-p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入 完成筛选。 6、（2024·河北邯郸·三模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。Wx基因模板链第226位碱基为G，此时胚乳中直链淀粉含量最高（表现为非糯性），记为品种G；若该位点突变成T，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低（表现为糯性），记为品种T。已知品种G和品种T杂交，后代均表现为非糯性，下图表示品种G和品种T中Wx基因的部分碱基序列，请回答下列问题：   (1)研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料进行PCR扩增，若引物1的核苷酸序列为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTC-3'，则引物2的核苷酸序列为5'- -3'。 (2)研究人员对PCR 扩增产物经AccⅠ酶（已知AccⅠ酶的识别位点为，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点）切割后进行 可以检测出该待测水稻属于哪种品种。若检测结果只观察到长度为 bp的DNA条带，则表明该水稻为品种T。 (3)将品种T的Wx基因与载体结合构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有 。若利用我国科学家独创的目的基因导入方法获得转基因水稻，此种方法 （填“需要”或“不需要”）进行植物组织培养，原因是 。 (4)若利用基因工程改造品种G，获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻，可以将Wx基因 （填“正向”或“反向”）接入质粒，导入品种G 的受体细胞进而获得转基因水稻，从 水平抑制Wx基因表达。 7、（2024·河北沧州·三模）龙牙槐木具有较高的药、食两用价值，其活性成分包括楤木皂苷。总三萜包括三萜皂苷等，三萜皂苷是楤木皂苷主要结构，其合成途径中的一个关键限速酶基因是Aeβ-AS基因。研究人员构建了含该基因的表达载体，并对烟草进行异源转化，以期提高楤木皂苷的产量，WT组为野生型烟草，L2、L21、L25、L30均为转基因株系，相关实验结果如图所示。回答下列问题 (1)在短时间内可通过 技术在龙牙槐木体外大量扩增Aeβ-AS基因，该过程通常需要人工合成长度为20～30个核苷酸的片段，该片段具有的特点是 （答出两点） (2)获得足量的Aep-AS基因后需构建基因表达载体，该载体上启动子的作用是 ，常用 法将重组载体导入烟草细胞。转基因烟草细胞需经 技术获得转基因烟草植株，该过程所需培养基中要加入的植物激素是 。 (3)检测Ae-AS基因是否表达可用 法。转基因株系中总三萜含量较WT组高，说明 。结合图1、2分析，能提取到较高含量楤木皂苷的株系及部位是 。 8、（辽宁省部分学校2024年高三临考押题考试（三模））In-Fusion 技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列，通常为15~20 bp），然后用In-Fusion酶（能识别双链线性化 DNA 片段：5'→3'末端任意16个碱基，使其降解）处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。回答下列问题： (1)通过PCR 扩增需要用到引物，引物的作用是 。在设计引物时最好在引物的 端添加限制酶的识别序列。引物 A 或引物 B要依据 的序列进行设计。若目的基因通过PCR 循环5次，需要消耗引物 个，经过程②扩增n次，得到符合要求的目的基因片段数量为 。 (2)PCR 过程包括变性、复性、 。其中复性时温度需要降低到50℃左右的目的是 。 (3)图中同源序列1、2 中的碱基序列一般不同，这样设计的原因是 。 (4)将同源序列1和2与线性化质粒连接成重组质粒需要 的作用，若将重组质粒导入植物细胞，则常用的方法为 。与传统构建重组质粒的方法相比， In-Fusion技术的优势之一是 。 9、（2024·辽宁沈阳·三模）腓骨肌萎缩症（CMT）是一种常见的遗传性疾病，患者常出现神经元肿胀、轴突变性及肌肉萎缩等症状。为探究突变的NEFH基因与CMT的关系，某科研团队利用生物工程技术，构建出多只含有突变的NEFH基因的转基因模型鼠。据图回答下列问题： (1)图1中基因的编码区是指基因中能够转录mRNA的区域，其上游、下游存在能调控转录过程的非编码区。该基因的启动子位于图1中 区段（填“非编码区1”、“编码区”或“非编码区2”）。 (2)构建基因表达载体前，需对该基因进行PCR扩增。PCR的原理是 。在不影响该基因编码功能前提下，应选图2中限制酶 对该基因进行切割，载体也需用相同的限制酶进行切割的原因是 。 (3)构建基因表达载体后导入小鼠体细胞，再结合生物工程中的 技术制备出转基因模型鼠（如图3）。4号鼠遗传物质与2号鼠 （填“完全”或“不完全”）相同，原因是 。若4号鼠表现为 ，说明突变的NEFH基因与CMT的发生有关，此项研究为CMT的靶向治疗提供了理论基础。 10、（2024届辽宁省高三联考三模）某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶：已知图中W基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图1中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题： 限制酶 BamH I EcoR I Mfe I KpmI Hind II 识别序列 及切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTC GCTAC↓C A↓AGCTT (1)限制酶主要是从 中分离纯化出来的。应使用限制酶 切割图1中质粒，使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 (2)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 启动子（选填“植物”、“真菌”或“放线菌”）。 (3)W基因转录的模板链是 （选填“甲链”或“乙链”）。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是 ，子链的延伸方向是 。 (4)研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAAC-CCUA…（中间序列）…GUCCACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为__________。 A．5'-TGAACGCTA… B．5'-CCAGTCGAC… C．5'-GAATTCTGA… D．5'-AACCTTCGA… 11、（2024·辽宁·三模）研究低温条件下番茄细胞WHY1基因对光合作用的影响，对于温度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的实践意义。回答下列问题： (1)研究人员利用重组DNA技术，将克隆的WHY1基因与外源高效启动子连接，导入番茄基因组中构建WHY1基因的过表达植株（），如图1所示。若限制酶切割WHY1基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端（即图中Ⅰ、Ⅱ处），则会出现 （答出2点）等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。 (2)PCR的产物一般通过电泳来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准，2号泳道为阳性对照（提纯的相关蛋白基因片段），3号泳道为实验组。1号泳道的条带实质为 ，若3号泳道有杂带（非目的DNA片段）出现，则原因可能是 （答出2点）。 (3)小干扰RNA（siRNA）能诱导特定基因转录出的mRNA降解，导致基因沉默。研究人员据此构建了WHY1基因的沉默植株（），siRNA因阻断了 过程而关闭了WHY1基因。进一步研究发现，番茄细胞WHY1基因影响光反应阶段D1蛋白（可捕捉光能）的含量，且与温度有关。研究人员用特定抗体检测D1蛋白在叶绿体内的含量，结果如表所示。该实验中的自变量为 ，对比三种番茄的D1蛋白含量可得到的结论是 。 温度 25℃ 4℃ 植株类型 W W D1蛋白含量 12、（2024届辽宁省高三·三模）诱变育种和基因工程育种均为实验室常用的生物育种手段。已知玉米的抗虫性状由一对等位基因调控，为了得到抗虫玉米植株，某实验室对野生型玉米种子进行了不同方法的处理后得到目的植株。回答下列问题： (1)该实验室对野生型玉米种子进行了诱变处理，进行培育、筛选后得到突变植株，该植株自交，后代中抗虫植株约占1/4，说明诱变引起的突变为 （填“隐性”或“显性”）突变。进一步研究发现，该突变是由野生型某个基因发生一个碱基由G到A 的替换导致的，则野生型基因和抗病基因的碱基序列长度 ，碱基序列 。（后两空填“相同”或“不同”） (2)该实验室利用农杆菌转化法将外源抗虫基因（cry）转入野生型玉米细胞得到转化细胞，并将其培育成植株X，过程如图1 所示，其中1、2代表染色体，抗氨苄青霉素基因（AmpR）为标记基因。已知该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换。 ①忽略抗虫基因和抗性基因的区别，仅根据两个基因在染色体上位置，除图1中的转化细胞种类外，请在图2中画出还可能得到的其他种类的转化细胞 。 ②研究表明，标记基因的产物对细胞具有一定的毒害作用，因此为了得到抗虫性状稳定遗传且不含标记基因产物的优良植株，可将植株X 进行自交从而获得预期目的的植株。为达到该目的，是否可以将cry基因和AmpR基因用同一个 Ti 质粒进行转运？ （填“可以”或“不可以”），原因是 。 13、（2024·吉林长春·三模）东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。 (1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。 (2)通过上述方法筛选得到6种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下表，应选择乳酸菌编号为 的菌株进行后续操作。 乳酸菌编号 Ll L2 L3 L4 L5 L6 抑菌率/% 28．57 19．48 58．44 14．28 6．49 36．36 (3)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。下面是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。 ①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 。PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。 ②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5＇端加入 （填“BamH I”或“Nde I”）的识别序列。 ③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。 1：DNA标准样 2：普通受体菌的DNA 3：转化操作后受体菌的DNA 4：无菌水 设置4号的目的是 （答出1点即可），电泳结果表明 。 14、（2024·吉林·三模）当蚊子叮咬时，它会将唾液中一种叫做anophelins 的蛋白质（一种抗凝血因子）注入宿主体内，让血液更自由地流动。长期以来，研究人员一直试图利用疟蚊创造人用新型血液稀释剂。回答下列问题： (1)蚊子产生的anophelins 蛋白对于人体来说是异物，免疫系统会对其进行攻击，发生免疫反应，这体现了免疫系统的 功能 (2)为获取anophelins 基因，需提取蚊子 的总RNA，再经逆转录过程得到DNA，将其作为PCR反应的模板。并设计一对特异性引物来扩增目的基因。    (3)构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins基因整合到质粒上， 如上图，应使用限制酶 切割如图中含anophelins基因的DNA片段，使用限制酶 切割图中质粒，以获得能正确表达的重组质粒。 (4)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA并用适当的限制酶（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度。这一操作的目的是 。 (5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产anophelins蛋白更具有优势。其理由是 。 15、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题：    限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau3AⅠ NotⅠ 识别序列及切割位点                  (1)要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 。基因工程技术中通常选择 种限制酶进行酶切。 (2)人乳铁蛋白基因可利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物 （在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择），连续扩增5次后至少需要引物 个。 (3)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有 （填“四环素”或“氨苄青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用 工程技术获得转基因小牛。 (4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用 技术，若 ，则表明目的基因已翻译形成蛋白质。 (5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是 。 16、（2024·黑龙江大庆·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，从而导致可溶性糖含量高，汁多质脆，研究发现这与甜玉米G蛋白含量较高有关。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、2所示。 (1)图1中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA片段。位于基因的 驱动基因持续转录，该转录过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。 (2)图2所示载体为农杆菌的Ti质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 。 (3)结合图1和图2，为使DNA片段能定向插入Ti质粒中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。 (4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti质粒）浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3个植株的G蛋白表达量和还原糖的含量进行测定，发现Y3植株的G蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是 。 (5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸（RNA剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切，而不是内含子1对应序列被单独剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋白质氨基酸的片段。） 为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。提取两组受精卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）： ①以cDNA为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩增产物及产物大小判断该假说是否成立。 ②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR反应成分的角度分析， 可能的原因是 （至少写出1点）。 17、（2024·黑龙江双鸭山·三模）某水稻品种含有基因Q，该基因在水稻体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中却因该基因不能与RNA聚合酶结合而无法表达。为了获得基因Q能够表达的卵细胞，研究人员进行了相关研究。回答下列问题： (1)水稻体细胞中RNA聚合酶可与基因Q的 结合开启转录。研究人员从水稻的体细胞中提取总RNA，经 过程获得基因Q中编码蛋白质的DNA片段。通过PCR技术扩增该DNA片段时需要根据 设计两种引物，扩增n轮需要消耗引物的数量为 。若直接从水稻体细胞中分离DNA，通过PCR技术扩增基因Q，则至少经过 轮循环才能得到只含基因Q的DNA片段。 (2)构建基因表达载体时，需要在基因Q的 （填“5′”或“3′”）端添加限制酶的识别序列，以保证目的基因和载体的正向连接。 (3)研究人员将基因Q与Luc基因（荧光素酶基因，荧光素酶能催化荧光素产生荧光）拼接成Q-Luc融合基因（融合基因中的Q和Luc基因都能独立表达），之后利用农杆菌转化法将融合基因转入水稻愈伤组织。经过 ，可获得转基因水稻。将转基因水稻培育成熟后，其卵细胞中的基因Q能够正常表达，推测可能的原因是 。在分离并培养转基因水稻卵细胞的过程中，可以筛选出能够表达基因Q的卵细胞，筛选的方法是 。 18、（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。下图表示研究人员扩增ASFV的CP530R 和 F317L基因，并导入含病毒载体1和pSC101质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。 (1)引物F的设计依据是 。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是 。 (2)ccdB基因编码的毒性蛋白CcdB抑制DNA促旋酶，导致细胞死亡。ccdA基因编码的蛋白CcdA 可保护细胞免受CcdB毒害。将大肠杆菌先接种在含 的培养基中，在 ℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含 的培养基中，在 ℃下继续培养，获得含病毒载体2的大肠杆菌。 (3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有 ，重组过程涉及 键的水解和形成。 (4)转化后的 Vero细胞，在37℃、含 （气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用 技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是 。 19、（2024·浙江·三模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题： Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种 (1)人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进行 、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的 ，完成杂交。 (2)胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或 消毒后，用 多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。 Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D基因的功能展开相关研究 (3)科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中，如下图所示。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的 组，此外还需额外添加 ，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ②实验结果表明抗寒相关D基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。 对照组1：酵母菌导入pG-GAL4重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。 对照组2：酵母菌导入 ，实验结果： 。 实验组：酵母菌导入 ，实验结果： 。 (4)将抗寒相关D基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用含 的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出 植株，72小时 诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。 20、（2024·安徽·三模）“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre-LoxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。 (1)当两个LoxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre重组酶在此过程中的作用类似于 酶。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个LoxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于 。 (2)图1中LoxP序列的方向取决于序号 对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre重组酶切割后，将在DNA序列的 （填5′或3′）端形成游离的磷酸基团。 (3)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP序列与脑组织特异表达启动子M相连接，构建图2所示的基因表达载体，再用 法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵中，进而得到仅含一个图2所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基因小鼠a（不含Cre酶）。 (4)图2所示序列的两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启动子N（由信号分子X开启）连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a和b杂交，得到F1。 a.若无X作用时，该小鼠脑组织的色彩为 色，其他组织细胞颜色为 色。 b.若有X作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理： 。 21、（2024·安徽·三模）利用金属硫蛋白启动子（PCUP1）和绿色荧光蛋白（CFP）基因等构建重组质粒PCUP9K-CFP，并通过氯化锂法转化毕赤酵母，获得工程菌株，工程菌细胞及其发酵液中可检出绿色荧光蛋白。发酵液中分别加入不同浓度的铜离子处理2h后，结果如图1；分别加入10μmmVL的铜、铬、镉和砷离子处理2h后，结果如图2（CK为对照组）。请回答下列问题：    (1)根据图1结果可知，GFP基因表达可以被一定浓度的铜离子促进，说明PCUPI属于 启动子，构建基因表达载体需要的工具酶有 ，重组质粒pCUP9K-GFP上不需要携带特殊抗性基因等充当标记基因，理由是 。 (2)培养工程菌的过程中，在接种环节要严格遵从无菌操作，如何确定接种操作达到无菌要求? 。 (3)含pCUP9K-GFP的毕赤酵母菌可以指示水体中铜离子的污染程度，理由是 。用铬、镉和砷离子处理该工程菌的目的是 。 22、（2024·安徽马鞍山·三模）干扰素在体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨酸替换为丝氨酸，则可延长保存时间。科研人员利用PCR技术对干扰素基因进行定点突变。他们通过实验先在试管A中得到产物1，接着在试管B中得到产物2（已定点突变的干扰素基因），整个流程如下图。回答下列问题。 (1)PCR技术利用了 原理。实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，目的是 。 (2)在PCR反应体系中加入引物的作用是 。试管A中要得到产物1至少经过 次循环。试管B中所需的下游大引物为产物1中的 链。 (3)为了使定点突变的干扰素基因能在哺乳动物乳腺细胞中特异性表达，在构建该基因表达载体时应将该基因与 等调控元件重组在一起，然后将该表达载体通过 法导入哺乳动物的受精卵中。 23、（2024·福建宁德·三模）猴痘是由猴痘病毒引起的一种人畜共患病。研究发现其F3L蛋白可抑制宿主天然免疫。科研人员通过转基因技术，利用大肠杆菌表达F3L蛋白，进行猴痘病毒相关研究。    注：kanr为抗卡那霉素抗性基因；EcoRI、XhoI为酶切位点 回答下列问题： (1)PCR扩增F3L基因时，反应体系中添加的引物作用是 。 (2)将PCR扩增得到的含F3L基因的DNA片段与质粒都经双酶切，再用 将两者连接，构建F3L基因表达载体。研究表明蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，推测其影响部位是图1中 （填字母）。 (3)大肠杆菌用 处理，然后将基因表达载体导入其中，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有 的固体培养基。 (4)重组大肠杆菌在0.6mM IPTG浓度下培养，探究不同的温度、培养时间的优化方案。将其提取的蛋白质进行电泳，结果如图2，已知F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，请用方框在图2-乙中标出其所在位置 ，从图中可推测出培养重组菌的最适条件为 。    注：M为已知相对分子质量标准；ku为蛋白质相对分子质量 24、（2024·福建福州·三模）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2所示。回答下列问题。    (1)图1中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经 催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，需要在引物的 端，加入限制酶 、 的识别序列。 (2)构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免 。 (3)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是 。 (4)将拟南芥的 直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将得到的种子接种在含有 （抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 (5)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测，如图4。若其中 号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 25、（2024·福建·三模）乳糖不耐受是机体乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻。科学家采用基因工程技术将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组中，获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量大大降低，用到的质粒和目的基因的部分结构如图1和图2所示，不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：    限制酶 识别序列及切割位点 Hind Ⅲ A↓AGCTT Sma I CCC↓GGG Kpn I GGTAC↓C Sal I G↓TCGAC Nhe I G↓CTAGC    (1)用Sma I切割图1质粒后，能不能用E.Coli DNA连接酶再将其连接起来？ 。在构建基因表达载体时，与用一种限制酶切割相比，用切割后可以形成不同末端的两种限制酶同时切割目的基因和质粒的优点是 。 (2)为了将图2中的目的基因准确插入到图1质粒中，需要在肠乳糖酶基因的两端分别添加 （填限制酶）的识别序列。为保证肠乳糖酶基因的正确复制和与质粒的正确连接，在设计PCR引物时，应在与β链结合的引物的 （填“”或“”）端添加 （填限制酶）的识别序列。 (3)在构建基因表达载体时，肠乳糖酶基因应插入 之间。将含有肠乳糖酶基因的表达载体导入受体细胞的常用方法是 ，受体细胞除了受精卵、胚胎干细胞外，还可以是 ，受体细胞所含的性染色体必须是 。 (4)利用胚胎工程技术将导入目的基因的受体细胞培育成个体，采用分子杂交技术检测肠乳糖酶基因在转基因奶牛中是否转录出mRNA的大致思路为 。 26、（2024·福建漳州·三模）类胡萝卜素因众多营养保健功能而具有很高的商业价值与应用前景。现研究人员通过构建含有β-胡萝卜素酮化酶基因bkt的表达载体，转化莱茵衣藻（一种真核绿藻）以提高其类胡萝卜素产量。请回答下列问题：    (1)为了同时保留衣藻内源性启动子H-R及终止子RBCS2，应选用限制酶 对质粒pUCBKT-P和pH105进行酶切，原因是 。再利用DNA连接酶将酶切下的基因片段连接成表达载体。 (2)可利用 （填技术）大量扩增bkt基因，该技术需要在添加 离子的缓冲液中扩增基因。若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是 。 (3)用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，所以要设计 的奇霉素进行实验，观察并确定 。 (4)以下是利用某两种限制酶进一步对提取的莱茵衣藻DNA进行单酶切和双酶切后的电泳结果。据此推测，提取的DNA总长度是 bp，两种限制酶切割位点之间的最短距离是 bp。    27、（2024·福建泉州·三模）洋桔梗是一种观赏价值高的花卉植物，易受真菌侵害而造成经济损失。几丁质为多数真菌细胞壁主要成分，研究人员将菜豆几丁质酶基因（Chi）转入洋桔梗中，以获得对抗真菌侵染的品种。请回答：    (1)获取目的基因。从序列数据库（GenBank）中查找Chi序列后，还需从菜豆中提取 ，根据 设计引物，通过PCR获得目的基因。 (2)PCR 产物鉴定。将 PCR 扩增产物的序列与GenBank中的 Chi 序列进行比较的目的是 。 (3)构建表达载体并导入农杆菌。利用 限制酶切割PCR 产物和质粒pB I 121，并连接成表达载体 pB I 121-Chi（如图1）。将 pB I 121-Chi转入农杆菌中，将转化产物涂于选择培养基中进行筛选、培养。 (4)农杆菌转化洋桔梗愈伤组织。将洋桔梗愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡 10min，再将愈伤组织放入含卡那霉素的培养基中筛选、培养。将得到的抗性无根苗转移到生根培养基中诱导生根，其中培养基中生长素用量和细胞分裂素用量的比值 （填“=”、“>”或“<”）1。 (5)目的基因的检测及鉴定。 ①选择pB I 121-Chi中的npt Ⅱ进行分子水平的检测，以判断Chi是否表达。原因是（Ⅰ）洋桔梗细胞中存在与 Chi 序列相似的同源基因；（Ⅱ）pB Ⅰ 121-Chi 中的 np t Ⅱ和 Chi 在表达上是 。 ②取未转化植株和能够正常生根的抗性转化植株新长出的幼嫩叶片，提取基因组 DNA，进行PCR检测，获得阳性植株。从 5 个生长良好的阳性植株提取 mRNA，进一步利用PCR 检测，结果如图2.则应选择植株 （填序号）进行个体生物学水平鉴定即对这些植株进行 ，以确定获得抗真菌洋桔梗植株。    28、（2024·江西南昌·三模）现有假单胞菌减毒活疫苗（Pp）和敲除了M基因的缺陷型假单胞菌减毒活疫苗（Pp－m），Pp只能预防白点病，研究者欲将外源抗原基因导入到Pp中表达，以构建能预防多种疾病的多联疫苗。已知含抗性基因的质粒存在安全性风险，现为获得无抗性基因但可通过其他方式达到筛选目的的质粒，并让该质粒携带抗原基因从而实现对多联疫苗的研制。 (1)图中是操作中使用的PBBR1质粒（kan⁺为卡那霉素抗性基因，该质粒上只有BamHI和SacⅠ限制酶识别位点）和M基因（M基因为假单胞菌在不含氨基酸的普通培养基上合成谷氨酸的必需基因），其中P1－P8为设计的引物；利用PCR技术扩增M基因，应选择 引物，利用PCR技术扩增不含卡那霉素抗性基因的PBBR1质粒并使其线性化时应选用 引物。 (2)图中右下方为供选择使用的限制酶及识别序列（箭头为限制酶的切割位点）。由于PBBR1质粒和M基因两端都没有相同的限制酶识别序列，应在设计上述两对引物时增加两种不同的限制酶识别序列，可选择 识别序列分别加在引物的5’端。 (3)利用上述PCR产物经相同的两种限制酶酶切和连接，将连接产物导入 （填Pp或Pp－m）中，将转化产物接种在 培养基上，挑选出能在培养基上生长的单菌落。 (4)提取上述菌落中的质粒，为防止抗原基因与质粒的反向连接，利用 限制酶处理质粒和抗原基因，将构建的重组质粒导入假单胞菌中以生产多联疫苗。 29、（2024·山东潍坊·三模）L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺（丙烯酰胺的前体），而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。   (1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是 。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是 。 (2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是 （只写出16个碱基即可）。 (3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若只使用限制酶EcoRI构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现 色，这些菌落 （填“能”、“不能”或“不一定能”）产生L-天冬酰胺酶，理由是 。 ②若使用（1）中的限制酶处理，则菌落呈 色的为符合要求的宿主菌，理由是 。 (4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是 。 30、（2024山东省齐鲁名校第三次联合检测）羟基酪醇具有抗癌、抗炎、保护软骨和抗骨质疏松的作用，主要从橄榄植物的叶子和果实中提取，但提取周期长、回收率低。乙醇脱氢酶 6（ADH6）是酿酒酵母利用甘油合成高产羟基酪醇过程中的关键酶。科研人员利用基因工程技术将酿酒酵母的 ADH6  基因导入大肠杆菌中，以期获得高产羟基酯醇的转基因大肠杆菌。 (1)科研人员利用 PCR 技术获得大量的酿酒酵母 ADH6 基因，用该技术扩增目的基因前需要根据 来设计引物。PCR 每次循环一般可以分为 三步。 (2)利用含 ADH6 基因的 DNA 片段和质粒构建基因表达载体的过程中，应使用的酶主要有 。与天然质粒相比，作为载体的质粒的独特之处在于 。 (3)研究人员将构建的基因表达载体导入大肠杆菌，经筛选获得 5 株转基因大肠杆菌（HJ17~HJ21）。导入基因表达载体前，需要用 Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 。 (4)为比较 5 株转基因大肠杆菌的羟基酪醇的产生情况，研究人员进行了相关实验，结果如图。 由图可知，为提高羟基酪醇的生产效率，可选用 作为发酵生产的菌种，依据是 。 31、（2024·湖北·三模）人溶菌酶（HLZ）是一种具有抑菌活性的蛋白质，在食品保鲜、抗菌消炎等方面广泛应用。为提高溶菌酶的产量，研究人员设计了利用基因工程高效生产溶菌酶的方案，流程如图所示。 回答下列问题： (1)溶菌酶能够破坏多种细菌的细胞壁，说明溶菌酶参与人体 （填“非特异性”或“特异性”）免疫，理由是 。 (2)提取出的HLZ基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对HLZ基因进行扩增时，应在所用两种引物的 端添加 识别序列，以实现HLZ基因与pPIC9K质粒的正向连接。过程①中将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。 (3)过程④中，每隔一段时间取1mL酵母发酵液，离心后取 （填“上清液”或“沉淀”）进行蛋白质凝胶电泳，得到结果如下图，已知HLZ的理论分子量约为16ku。结果显示本实验中HLZ酵母表达体系初步构建成功，判断依据是 。如需进一步确认该蛋白质为HLZ，可采取的措施为 。 注：M．蛋白Marker；1．空酵母培养48h；2．导入空质粒酵母培养48h；3～6．导入重组质粒酵母分别培养24h、48h、76h、96h。 32、（2024·湖北襄阳·三模）丙肝病毒（HCV）是一种致病性强的单链RNA病毒，主要侵染肝细胞，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，也是肝硬化和肝癌的元凶之一。为研制丙肝病毒的单克隆抗体，研究者以小鼠为实验材料设计了以下实验。回答下列问题。 (1)在HCV感染的急性期，会引发机体的特异性免疫应答。在体液免疫过程中，B细胞活化、增殖分化过程需要两次信号刺激，一是抗原的直接刺激，二是 。B细胞受到两个信号的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，浆细胞产生和分泌大量抗体发挥免疫效应。抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是 。 (2)为使单细胞悬液中的B淋巴细胞产生的抗体中一定含有能与丙肝病毒结合的抗体，需要进行的操作是 ,图中筛选1所采用的培养基从用途上分类，属于 培养基，使用该培养基进行细胞培养的结果是 。 (3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，α-干扰素在丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。科学家们采用基因工程技术将干扰素基因导入大肠杆菌生产干扰素。图1、图2分别表示干扰素基因相关限制酶切割位点、质粒结构示意图。 ①为确保成功获得基因工程菌，图1和图2最好用 （填限制酶）切割。 ②PCR过程中延伸阶段选用72℃而非95℃，是综合考虑了两个因素，这两个因素分别是 。 ③生产干扰素的工程菌可选用大肠杆菌或酵母菌，选用酵母菌作为受体细胞的优势是 。 33、（2024·湖南永州·三模）镰刀菌、立枯丝核菌引起的水稻（2n=24）立枯病和褐飞虱引起的水稻虫害，常常造成水稻减产。某科研团队为培育抗褐飞虱、抗立枯病的水稻新品种，以对褐飞虱不具有抗性的连粳11号、龙粳39号、荃优822号三个纯合水稻品种为实验材料，进行了相关实验。回答下列问题： (1)为建立水稻基因组数据库，科学家须完成水稻 条染色体的DNA测序。 (2)连粳11号对镰刀菌表现为易感病，对立枯丝核菌表现为抗病，而龙粳39号则相反。水稻对镰刀菌和立枯丝核菌的抗性分别受非同源染色体上的A/a、B/b基因控制。连粳11号和龙粳39号杂交得到F1，F1自交得到F2，统计F2结果如下图所示。据图可知，连粳11号和龙粳39号的基因型分别为 ，F2中对两种菌均具有抗性的个体占 。请简要写出简便获得对两种菌均具有抗性的纯合子（标记为甲）方案 。 (3)该团队利用X射线对荃优822号水稻进行处理后，发现少数水稻（标记为乙）对褐飞虱产生了较高抗性。其5号染色体上某DNA区段与高抗虫性相关，对荃优822号的该区段设计重叠引物，提取乙和荃优822号的5号染色体DNA进行扩增，扩增产物的电泳结果如下图所示： 据图推测5号染色体上第 对引物对应区间的基因（标记为N基因）发生了碱基的 （填“增添”、“缺失”或“替换”）。 (4)研究者对N基因进行分离和克隆，以其作为目的基因与Ti质粒的 进行拼接，并运用农杆菌转化的方法导入到水稻甲的叶肉细胞中，经 获得转基因植株（标记为丙）， (5)对丙进行扩大培养，发现有部分丙植株体细胞中含有2个N基因，让其自交后得到可以稳定遗传的抗褐飞虱新品种丁。请参照图例在作答区域内标出丁植株细胞内N基因在染色体上可能的相对位置 （圆圈表示细胞，竖线表示染色体，圆点表示基因位点，字母表示基因）。 34、（2024·湖南永州·三模）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，部分结构如下图。在人体特定部位进行42℃处理后，p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达。据此回答下列问题：    (1)推测p7应为 （填“启动子”或“终止子”），其功能是 。 (2)Tel42为来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac可以使Tel42持续性表达，当温度 （填“低于”、“等于”或“大于”）42℃时，Tcl42蛋白会抑制启动子pRL。 (3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特定基因。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型aPD-L1蛋白基因（该蛋白可用于免疫治疗）等。请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路”→ →重组酶Bxb1基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→ →解除Tcl42蛋白对启动子pRL的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。将下列选项代号填入上述横线，将“基因电路”补充完整。 A．受体菌37℃时 B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性 C．荧光蛋白GFP基因、aPD-L1基因的转录 D．重组酶Bxb1基因表达，进而引起p7两侧发生重组 (4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是 。导入后的菌体用 方法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。 (5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。请以成瘤建模后的小鼠为材料，设计一个实验方案 。 35、（2024·湖南衡阳市祁东县·三模）动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有效的细胞培养。该系统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表达载体，然后将该重组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白，相关过程如图所示。回答下列问题：    (1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。 ①实验人员提取了相关mRNA，通过逆转录获取cDNA，再通过PCR技术扩增人乳铁蛋白基因。在整个过程中，需要用到的原料是 。 ②实验人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA聚合酶，而不能使用普通的DNA聚合酶，其原因是 。 (2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是 ，同时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。 (3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。 (4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C三头转基因牛的乳汁，从中提取了蛋白质，结果发现A、C两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B转基因牛提取的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。该检测方法的原理是 。进一步提取A、C两头转基因牛的基因组DNA和mRNA进行检测，A转基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C转基因牛则都不能检测到。以上两次检测结果说明了 。 36、（2024·广东茂名·三模）在DNA体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322质粒构建基因表达载体，然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题：   (1)已知限制酶PstI和BamHI识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，图1中，若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶 （填“PstI或”“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是 。 (2)在某次实际操作中，实验人员将外源DNA片段插入pBR322的BamHI切割位点处，构建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2所示的实验。   ①结合图2阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是 。该培养基中添加了氨苄青霉素（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒，这是由于 。 ②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2阶段二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含 （填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是 。 37、（2024·广东·三模）某两性花植物花小不易进行杂交育种工作。已知雄性可育基因对雄性不育基因为显性。某科研团队利用基因工程将育性恢复基因A、花粉致死基因B、绿色荧光蛋白基因C连锁成为一个A-B-C基因并导入雄性不育个体的一条染色体上，获得育性恢复植株甲。雄性不育植株雄蕊发育不正常，但雌蕊正常。使用无缝克隆技术可将A、B、C基因连接成DNA片段，其机理如图。回答下列问题： (1)基因工程需要使用的工具酶有 ，后者主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键。与用单酶切割目的基因与载体相比，双酶切割法的优点是 。 (2)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，其目的是 。与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有 （写出2点即可）。 (3)甲植株自交得F1，F1中雄性不育植株所占比例为 。 (4)假设雄性可育植株与育性恢复植株、不育植株可区分。请利用雄性可育纯合植株、甲植株和荧光检测仪，设计杂交实验，探究导入的A-B-C基因是否与雄性不育基因在同一条染色体上（不考虑互换，不用具体描述荧光检测过程）。实验设计方案：甲植株作为母本与雄性可育纯合植株杂交，F1中通过荧光检测仪检测并选取有荧光的雄性可育植株进行自交，观察并统计F2中的表型及比例。预期结果：①若有荧光雄性可育植株：有荧光育性恢复植株：无荧光雄性可育植株：无荧光雄性不育植株的比例为3：1：3：1，则 ；②若 。 38、（2024·海南·琼海市嘉积中学高三三模）研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①~⑥为不同过程，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知识，回答下列问题： (1)不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是 。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择SmaⅠ和PstⅠ比只选择PstⅠ的优点是 （答出两点）。 (2)研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb的DNA片段，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb的DNA片段；SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb的DNA片段（注意：DNA片段大小与图中所画比例一致），则抗盐碱基因的长度为 。 (3)利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，对两种引物的设计要求之一是 ；除引物外，PCR反应体系中还需要加入 （答出两点）。 (4)将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti质粒中。利用Ti质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是 。 (5)为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基中需要加入的物质是 。诱导组织细胞脱分化的是 号培养基。图中④⑤⑥过程，所利用的生物技术的理论基础是 。 39、（2024·广西玉林·三模）Ti质粒上有vir区和T-DNA区，vir区决定T-DNA的转移。研究人员将vir区和T-DNA区分离，开发了包括微型Ti质粒和辅助Ti质粒的双元载体系统。利用该系统，将抗草甘膦基因（cp）导入大豆中，培育抗除草剂（草甘膦）的转基因大豆。回答下列问题： (1)双酶切可将cp基因以正确方向插入微型Ti质粒。已知cp基因的a链为转录的模板链，则引物1和引物2的5'端应分别加入 酶和 酶的酶切位点。 (2)目的基因表达载体过大时难以操作，转化效率较低。研究人员在构建微型Ti质粒时删除了生长素基因和细胞分裂素基因，这样做的优点是 （答出2点）。T-DNA从农杆菌转移到植物细胞中时始于右边界止于左边界，在T-DNA的转移过程中会出现不完整转移现象，若以绿色荧光蛋白基因（GFP）作报告基因研究T-DNA的转移，则GFP应构建在紧临 （填“左”或“右”）边界的位置。 (3)将微型Ti质粒上重组了cp基因的农杆菌与含辅助Ti质粒的农杆菌混合，一定温度下保温一段时间，得到含双元载体的农杆菌。在含双元载体的农杆菌中，辅助Ti质粒的作用是 。 (4)用含有cp基因表达载体的农杆菌侵染大豆愈伤组织，筛选出转cp基因的愈伤组织。诱导愈伤组织形成试管苗的过程，在植物组织培养中叫 阶段。此阶段需要更换新的培养基，是因为 。 40、（2024·广西柳州·三模）γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA的工程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。请回答下列问题：    (1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是 。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA，表明基因与性状的关系是 。 (2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是 ，这在实践中的优势是 。 (3)在进行步骤②之前，需对gadB基因进行扩增以提高获得重组质粒的概率。现在常用的快速扩增技术是PCR，扩增过程使用的DNA聚合酶具有的特点是 ，扩增过程中的使用的引物 （填“可”或“不可”）重复利用。 (4)为筛选出含重组质粒的大肠杆菌，应在添加 的选择培养基上培养；培养后获得的菌落却不能判定是否含有重组质粒，理由是 。进一步检测成功转化的GABA高产大肠杆菌，可通过检测 获得（写出2个检测指标）。 41、（2024·贵州毕节·三模）二十碳五烯酸（EPA）能促进体内饱和脂肪酸代谢，是人体自身不能直接从头合成但又不可缺少的营养物质。研究人员利用转基因技术从海洋细菌中提取了EPA合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增pfaB基因时，需要选用图1中的引物 （填序号），引物的作用是 。 (2)图2所示的两种引物中，引物 设计不合理。若将pfaB基因扩增n次，共需要引物 个。 (3)构建基因表达载体时，为使pfaB基因成功表达，应将其插入载体的 之间。 42、（2024·贵州·三模）在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生产植物疫苗时存在的问题之一。研究表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人员拟构建含有两个35s启动子（35s启动子是花椰菜花叶病毒的一种强启动子）串联的转基因苜蓿。一个35s启动子包括1个A区和2个B区。图甲表示35s启动子及其附近区域分布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待转入第二个35s启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。 (1)利用PCR技术可以扩增35s启动子，PCR技术的原理是 ，此技术设计引物很关键，引物是 。利用此技术扩增的35s启动子可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物。 (2)根据限制酶识别位点，为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择 限制酶切割图甲的DNA片段。 (3)为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是 、 ，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能 。 平板类型 ① ② ③ 甲：无抗生素 + + + 乙：卡那霉素 - - + 丙：？ - + + 丁：？ - - + 43、（2024·甘肃张掖·三模）γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA的工程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。回答下列问题。    (1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是 。 (2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是 ，这在实践中的优势是 。 (3)在进行步骤②之前，需对gadB基因进行PCR扩增以提高获得重组质粒的概率，需加入 种引物和 酶，扩增过程中使用的引物 （填“可”或“不可”）重复利用。 (4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛选出转基因工程菌。 (5)将成功转化的大肠杆菌进行发酵培养，发酵罐内的原料应富含 ，酸碱度要求是调至 。一段时间后，检测GABA的含量。 44、（2024·甘肃白银·三模）随着抗生素需求的增加，利用基因工程从微生物中获得抗生素已成为生产抗生素的一种重要途径。某实验室欲利用大肠杆菌获得抗体，图1表示该抗体基因及部分碱基序列，图2表示质粒及限制酶的切割位点，图3表示不同限制酶的识别序列，其中AmpR、KanR分别为氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。回答下列问题： (1)限制酶作用于DNA分子的 键，其切割DNA后可产生 和平末端。 (2)将图1中抗体基因与图2中质粒结合的过程称为 ，结合过程中使用的限制酶是 。将目的基因导入受体细胞后，可在培养基中加入 （填“氨苄青霉素”或“卡那霉素”）对目的细胞进行筛选。 (3)与从实验室常用小鼠中获得的抗体不同，从大肠杆菌中获得的抗体在结构上较为简单，原因最可能是 。 ( 2 )原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！ 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题18 基因工程 一、单选题 1、（2024·天津滨海新·三模）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。 故选B。 2、（2024届河北省保定市十校高三下学期三模）近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（    ） A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构 B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列 C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列 D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因 【答案】A 【分析】蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。 【详解】根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。其中根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构是最难实现的。A正确，BCD错误。 故选A。 3、（辽宁省部分学校2024年高三临考押题考试（三模））为了提高构建基因表达载体的效率，通常会运用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，图1、图2表示含有目的基因的DNA片段和质粒上限制酶的识别位点，表中为各种限制酶的识别序列和切割位点。下列叙述错误的是（　　）    限制酶种类 BamH I Bcl I Hind III EcoR I 识别序列及切割位点          A．对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行切割以获取目的基因 B．BamHⅠ和Bcl Ⅰ是同尾酶，二者的切割位点不同 C．图中启动子的作用是作为DNA 聚合酶识别和结合部位 D．将该重组质粒导入动物细胞常用显微注射法 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】A、由图1可知，目的基因的内部有Bcl Ⅰ和EcoRI这两种限制酶的切割位点，对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行切割以获取目的基因，A正确； B、同尾酶是一类限制性内切酶，它们能够切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端，由表格可知，BamHⅠ和Bcl Ⅰ切割形成的黏性末端相同，BamHⅠ和Bcl Ⅰ是同尾酶，二者的切割位点不同，BamHⅠ识别的序列为-GGATCC-，切割位点在GG之间，Bcl Ⅰ识别序列为TGATCA-，切割位点在TG之间，B正确； C、启动子的作用是作为RNA 聚合酶识别和结合部位，是转录的起点，C错误； D、将重组质粒导入动物细胞常用的方法为显微注射法，D正确。 故选C。 4、（2024届辽宁省高三联考三模）某种嗜热细菌，其栖息的热泉水温可达90℃左右，若该细菌DNA分子中含有胞嘧啶脱氧核苷酸M个，下列关于嗜热细菌的叙述错误的是（    ） A．该细菌DNA聚合酶可以应用于PCR技术 B．该细菌DNA分子中的每个磷酸基团都与2个脱氧核糖相连 C．该细菌DNA分子的碱基中A+T/G+C的比例可能较高 D．该细菌DNA分子第n次复制时需要游离的胞嘧啶脱氧核苷酸M×（2n-1）个 【答案】C 【分析】PCR技术： 1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、嗜热细菌细胞内的酶比一般细菌更耐高温，因此将其DNA聚合酶应用于PCR技术有明显优势，A正确； B、细菌细胞内的DNA分子为环状，因此DNA分子中的每个磷酸基团都与2个脱氧核糖相连，B正确 C、由于C、G碱基对间的氢键数量多，所以该嗜热菌DNA分子的A+T/G+C的比例可能较低，C错误； D、若该细菌DNA分子中含有胞嘧啶脱氧核苷酸M个，则第n次复制时需要游离的胞嘧啶脱氧核苷酸M×（2n-1）个，D正确。 故选C。 5、（2024届辽宁省高三·三模）通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身的细胞在体外诱导发育成特定的组织器官，然后再移植回患者体内。图1和图2 表示利用自身细胞进行器官移植的两种方法，其中诱导多能干细胞（iPS 细胞）类似于人类的胚胎干细胞。下列叙述正确的是（    ） A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中 B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者的完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥反应 C．可利用农杆菌转化法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox基因、c-Myc 基因和Klf基因导入成纤维细胞 D．图2中卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可整个注入去核的卵母细胞中 【答案】D 【分析】1、细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养； 2、基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品； 3、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。 【详解】A、两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有 95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中，A错误； B、图1所示方法导入了 Oct3/4 基因、Sox基因、c-Myc 基因和Klf 基因，图2中提供质遗传物质的卵母细胞的来源未知，因此两种方法所获得的组织器官的遗传物质均可能和患者的不完全相同，B错误； C、将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，C错误； D、核移植的过程中，卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可将整个供体细胞注入去核的卵母细胞中，D正确。 故选D。 6、（2024·吉林长春·三模）基于AI（人工智能）的蛋白质设计方法可通过现有蛋白质数据库及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构和功能。下列叙述错误的是（    ） A．AI预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是中心法则 B．AI可帮助人们深入了解蛋白质分子结构和功能的关系 C．获得AI设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现 D．AI可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质 【答案】A 【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，蛋白质工程能对现有的蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质；而基因工程原则上能生产自然界已有的蛋白质。 2、蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 【详解】A、AI预测新型蛋白质的结构和功能依据的原理是蛋白质的结构决定其功能，A错误； B、基于AI（人工智能）的蛋白质设计方法可通过现有蛋白质数据库及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构和功能，故获得AI设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现，B正确； CD、蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，蛋白质工程能对现有的蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质；而基因工程原则上能生产自然界已有的蛋白质，获得AI设计的蛋白质，可通过改造或合成基因来实现，AI可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质，CD正确。 故选A。 7、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（    ）    A．DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理 C．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、和构象等有关。电泳技术可以根据相对分子质量大小把不同的DNA分开，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖凝胶电泳中移动速率越慢。 【详解】A、DNA不溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA，A错误； B、DNA带负电，DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，B错误； C、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，C错误； D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，电泳结果中的这些条带通常需要在紫外线下观察和照射才能显示出来，因此需要紫外灯照射，D正确。 故选D。 8、（2024·黑龙江大庆·三模）T4溶菌酶（Ao）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程将T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（　　） A．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作 B．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质 C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中 D．A0和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【详解】A、蛋白质工程需要在分子水平上对基因进行操作，A错误； B、蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径，故蛋白质工程与中心法则的流程方向相反，B错误； C、检测A1活性时应先将A1与底物分别置于高温环境，保温一段时间再混合，C错误； D、分析题意可知，和AO相比，A1不仅仅是氨基酸的序列不同，同时还增加了一个二硫键，导致空间结构也有差异，是二者热稳定性不同的直接原因，D正确。 故选D。 9、（2024·浙江·三模）各类生物因子、生物技术误用滥用等会引起生物性危害。以下不会带来生物安全风险的是（    ） A．核污水排入海洋导致生物变异 B．转基因抗虫作物长期大规模种植 C．克隆技术用于器官移植和人体克隆 D．禁止生物武器及其技术、设备的扩散 【答案】D 【分析】转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是趋利避害，不能因噎废食。 【详解】A、核污水排入海洋导致生物变异属于生物安全风险，A不符合题意； B、转基因抗虫作物长期大规模种植可能导致基因污染，造成生物性危害，B不符合题意； C、克隆技术存在伦理问题，可能会带来安全风险，我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，C不符合题意； D、生物武器危害大，禁止生物武器及其技术、设备的扩散不会带来生物安全风险，D符合题意。 故选D。 10、（2024·福建宁德·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅰ）和“绿叶中色素的提取和分离”（实验Ⅱ）的相关叙述错误的是（    ） A．两个实验都使用酒精溶解物质 B．两个实验都需要将实验材料进行充分研磨 C．实验Ⅰ粗提取的DNA呈现蓝色，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色 D．实验IDNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同 【答案】C 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理： ①DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的，当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出； ②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液，·利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA； ③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、实验Ⅰ中利用酒精溶解蛋白质的特征，实验Ⅱ中利用色素能溶解到无水乙醇中的特性，A正确； B、实验Ⅰ中将切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，实验Ⅱ充分研磨的目的是使色素溶解到酒精中，B正确； C、实验Ⅰ粗提取的DNA呈现白色丝状，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色，C错误； D、实验I中DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，据此可将DNA析出，而实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同，因而在滤纸条上扩散的速度不同，因此能分离色素，D正确。 故选C。 11、（2024·湖北·三模）棉蚜体内有多种寄生蜂的卵。初级寄生蜂将卵产于棉蚜体内，幼虫取食棉蚜组织导致棉蚜死亡，形成低蚜。重寄生蜂的卵在初级寄生蜂的幼虫体内孵化并从中获得营养。现利用PCR技术对僵蚜及其体内寄生蜂种类进行检测，为了一次鉴定出多种目标昆虫，加入同一PCR体系的引物应满足（    ） ①每对引物扩增的序列对应一种昆虫 ②每对引物扩增的序列对应多种昆虫 ③每对引物扩增的产物长度不同 ④每对引物扩增的产物长度相同 ⑤所有引物之间不能相互配对 ⑥所有引物的长度相同 A．①③⑤ B．②④⑥ C．②③⑥ D．①④⑤ 【答案】A 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，且引物之间不能发生碱基互补配对。 【详解】要用多对引物一次鉴定出多种生物，那么每种生物要有对应的引物与其DNA特有的碱基序列配对，引物之间不能互补配对，扩增的产物长度要有所不同，以便在电泳时可以区分出不同生物的片段，即①③⑤符合题意，A正确，BCD错误。 故选A。 12、（2024·湖南衡阳·三模）当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是（    ）   A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因 B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与 C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质 D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121质粒的植株作对照 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物生成黄色所致，故要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确； B、步骤①是目的基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误； C、步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确； D、为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含 目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。 故选B。 13、（2024·湖南永州·三模）HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列叙述正确的是（　　） A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分 B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRI和HindⅢ的识别序列，拼接前载体用MfeI和HindⅢ切割 C．利用PCR扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压稳定 D．利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋白可以大规模用于禽流感疫苗制备 【答案】D 【分析】基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等；启动子是一段有着特殊序列结构的DNA片段，位于目的基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质；终止子位于目的基因的下游，作用是终止转录，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 【详解】A、图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A错误； B、要使目的基因能够与启动子结合，目的基因应连接在启动子下游，并借助启动子启动转录过程，按照图中启动子上的箭头方向推测，目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子右侧拼接，拼接前应先在目的基因两端分别引入BamHI和HindⅢ的识别序列，拼接前载体用MfeI和HindⅢ切割，B错误； C、利用PCR扩增目的基因时，反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是激活耐高温的DNA聚合酶，C错误； D、HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原，利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋白可以大规模用于禽流感疫苗制备，D正确。 故选D。 14、（2024·湖南衡阳市祁东县·三模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为（    ） A．引物1和引物4 B．引物2和引物6 C．引物2和引物4 D．引物3和引物5 【答案】B 【分析】据多聚酶链式反应扩增DNA片段：1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】题图可知，利用重叠延伸PCR 技术对 DNA 分子进行定点突变的过程中，通过 PCR2 获得产物 CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3'端结合，因此引物 d 的序列为5'GTCACGTG，引物 2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将 mRNA上的第 154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为 A．因此引物c的碱基序列为5'CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B项符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 15、（2024·广东茂名·三模）不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（    ） A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计 B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸 D．该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物 【答案】C 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确； B、当限制性引物的浓度降低，甚至基本耗尽，双链 DNA 的合成速率显著下降，此时非限制性引物将继续引导单链 DNA 的合成，非限制性引物是与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初始 DNA 中一条链的拷贝（非限制性引物引导合成的单链），最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B正确； C、扩增时耐高温DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3'端，C错误； D、PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要（26-1）a个限制性引物，D正确。 故选C。 16、（2024·广东·三模）蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时代。如通过蛋白质工程，将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸，就可以使其保存半年，而活性不受影响。下列关于蛋白质工程的叙述，正确的是（　　） A．蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相同 B．蛋白质工程需要改造或合成蛋白质的编码基因 C．对干扰素的改造无需考虑其空间结构 D．蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【详解】A、蛋白质工程的操作流程与中心法则的方向相反，A错误； B、蛋白质工程是对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，最终通过基因改造或合成新基因来完成，B正确； C、对干扰素进行改造需要从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，C错误； D、蛋白质工程不需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列，如通过蛋白质工程，将干扰素结构上的两个半胱氨酸改为丝氨酸，就可以使其保存半年，而活性不受影响，D错误。 故选B。 17、（2024·重庆渝中·三模）技术是基因工程中获取目的基因的重要手段，其原理与体内复制类似。图1、图2、图3是与有关的三幅图解，下列相关叙述正确的是（    ）   A．通过3次图1过程的循环即可从含目的基因的分子中分离出目的基因 B．图2中第1组引物适合进行，第2组引物不适合进行 C．图3可反映体系中热稳定性聚合酶的功能 D．体内复制和中的引物都是核糖核苷酸链 【答案】A 【分析】PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸。 【详解】A、据图分析，通过3次图1过程的循环即可从含目的基因的DNA分子中分离出目的基因，A正确； B、图2中第1组引物中引物Ⅰ会和引物Ⅱ发生局部碱基互补配对而失效，第2组引物中引物I'自身折叠（形成发夹结构）后会出现局部碱基互补配对而失效，B错误； C、热稳定性DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到引物链上而不能将两个单独的核苷酸相连，C错误； D、体内DNA复制时所需引物是短单链RNA，图1中的引物是短单链DNA，D错误。 故选A。 18、（2024·贵州·三模）细胞色素C是细胞中普遍含有的一种蛋白质。利用DNA分子杂交技术和测定DNA的热稳定性可以判断生物亲缘关系的远近。实验思路如图所示，下列有关说法错误的是（    ） A．DNA的提取利用了DNA与蛋白质等物质在物理和化学性质方面存在差异的特点 B．获得的杂合双链DNA分子，配对的碱基对越多，结构越稳定，变性温度越高 C．T甲-甲-T甲-丙大于0说明甲和丙的DNA序列不同，但甲与丙细胞色素C的结构可能相同 D．由上述结果可以推测，甲与乙的亲缘关系比甲与丙的亲缘关系近 【答案】D 【分析】在基因工程中，DNA分子杂交技术可以用于判断目的基因是否进入受体细胞，不能判断是否表达成功，通过DNA分子杂交技术获得杂交双链分子，两种生物的亲缘关系越近，配对的碱基对越多，结构越稳定，变性温度越高。 【详解】A、DNA的提取利用了DNA与蛋白质等物质在物理和化学性质方面存在差异的特点，如DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精，A正确； B、获得的杂合双链DNA分子，配对的碱基对越多，形成的氢键就越多，结构越稳定，变性温度越高，B正确； C、T甲-甲-T甲-丙大于0说明甲和丙的DNA序列不同，由于密码子的简并性，甲与丙细胞色素C的结构可能相同，C正确； D、根据实验结果可得T甲−乙＜T甲−丙，说明甲与丙配对的碱基多，二者亲缘关系近，故乙和甲的亲缘关系更远，D错误。 故选D。 19、（2024·甘肃白银·三模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为 CCA）替换成苏氨酸（密码子为 ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为（    ） A．引物1和引物4 B．引物2和引物6 C．引物2和引物4 D．引物3和引物5 【答案】B 【分析】据多聚酶链式反应扩增DNA片段：1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】题图可知，利用重叠延伸PCR 技术对 DNA 分子进行定点突变的过程中，通过 PCR2 获得产物 CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3'端结合，因此引物 d 的序列为5'GTCACGTG，引物 2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将 mRNA上的第 154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为 A．因此引物c的碱基序列为5'CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B项符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 二、多选题 1、（2024届河北省保定市十校高三下学期三模）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒，该质粒的部分结构如图所示，其中J基因序列表达J蛋白，V5编码序列表达短肽V5。下列叙述错误的是（    ） A．作为基因表达载体，该重组质粒通常还需具有标记基因等结构 B．用F2、R2作引物进行PCR检测，可确定J基因插入方向是否正确 C．通过启动子的位置和引物的方向可判断该融合基因转录的模板是a链 D．该启动子高度甲基化对该基因在受体细胞中表达J-V5融合蛋白有利 【答案】BD 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】A、基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确； B、据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2，B错误； C、根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5’，因此为a链，C正确； D、该启动子高度甲基化使得该基因无法被转录，因此对该基因在受体细胞中表达J-V5融合蛋白不利，D错误。 故选BD。 2、（2024届辽宁省高三联考三模）终末期心脏病患者需要进行心脏移植，但移植过程中往往会发生缺血再灌注损伤（IRI），导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官坏死。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤，如图所示。下列说法正确的是（    ） A．供者与受者的主要组织相容性抗原一半以上相同，方可进行器官移植 B．重组质粒除了包含目的基因、标记基因外，还必须有启动子和终止子 C．细胞凋亡中会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8蛋白的过程 D．基因沉默复合物，抑制遗传信息的翻译过程，使Caspase8基因沉默 【答案】ABD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、研究表明，只要供者与受者的主要HLA有一半以上相同就可进器官移植，A正确； B、重组质粒包含目的基因，标记基因，启动子和终止子，B正确； C、Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以与Caspase8基因转录成的mRNA结合，使Caspase8基因沉默，因此不会发生Caspase8DNA→siRNA→Caspase8蛋白的过程，C错误； C、基因沉默复合物作用于Casepase8mRNA，影响基因表达的翻译过程，D正确。 D、故选ABD。 3、（2024·辽宁·三模）研究发现，若将第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA），则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合不可能为（    ） A．引物1和引物4 B．引物2和引物6 C．引物2和引物4 D．引物3和引物5 【答案】ACD 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】据题图可知，利用重叠延伸PCR技术对DNA分子进行定点突变的过程中，通过PCR2获得产物CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3'端结合，因此引物d的序列为5'GTCACGTG，引物2符合该序列。现要利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将mRNA上的第154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C替换为A。因此引物c的碱基序列为5'CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B正确，ACD错误。 故选ACD。 4、（2024·辽宁抚顺·三模）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD—1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD—1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析正确的是（       ） A．敲除2、3、4片段引起的变异属于基因重组 B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNA C．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子 D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD—1 【答案】CD 【分析】电泳是指带电粒子在电场的作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度的影响，在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。 【详解】A、据图分析，通过删除编码PD-1蛋白功能区的2、3、4片段造成蛋白的功能性缺失，指的是将野生型基因内部的部分碱基对剪切，改变的是基因内部的碱基序列，属于可遗传变异中的基因突变，A错误； B、分析图1可知，需要将基因的2、3、4共3个片段切除，需要设计片段2和片段4的2个sgRNA，B错误； C、基因敲除后，其核苷酸数量减少，电泳时移动速度快，距离点样孔远，4、7 和12个体均为敲除纯合子，C正确； D、3个体的基因未敲除，5个体和9个体为基因敲除杂合子，体内均能检测到PD—1，D正确。 故选CD。 5、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析正确的是（    ） A．对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成 B．生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列 C．可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2 D．构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I 【答案】ABC 【分析】1、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA)→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA)。 2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与表达。 【详解】A、对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A正确； B、α—淀粉酶（AmyS1）的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，正确； C、将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C，可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C正确； D、若用BamH I酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择Nde I和EcoR I，既不会破坏目的基因，也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是Mlu I和Eco 52Ⅰ，D错误。 故选ABC。 三、非选择题 1、（2024·天津北辰·三模）毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。 (1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入 和 。 (2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg基因两侧的A和B端分别添加的碱基序列是 、 。 (3)过程③需用一定浓度的 处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。 (4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是 ，获得的重组DNA的长度为 。 (5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是 。 【答案】(1) 模板 引物 (2) TACGTA CCTAGG (3) CaCl2（Ca2+溶液） 使重组质粒在大肠杆菌中复制得以扩增 (4) Bg1Ⅱ 136kb (5)诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量 【分析】据图分析：①为PCR扩增获得目的基因；②为重组DNA分子的构建；③将重组DNA分子导入受体细胞；④利用大肠杆菌扩增重组质粒；⑤酶切获得重组DNA分子。 【详解】（1）过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入模板和引物。 （2）题干信息“5'AOX1为AOX1基因启动子，3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一）”，分析可知HBsAg基因应该插入到5'AOX1和3'AOX1之间。结合质粒分析5'AOX1和3'AOX1之间存在SnaBI和AyrⅡ两种限制酶酶切位点，且HBsAg基因转录方向是由A到B，因此为了保证PCR扩增产物定向插入质粒，应选择在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是TACGTA和CCTAGG。 （3）过程③是将重组质粒导入大肠杆菌，因此需要一定浓度的CaCl2（Ca2+溶液）处理大肠杆菌，增大其细胞膜的通透性，使其成为感受态细胞，有利于重组质粒的导入。据图分析，④大肠杆菌扩增后产生了大量的重组质粒，因此将重组质粒导入大肠杆菌的目的是使重组质粒在大肠杆菌中复制得以扩增。 （4）据图中的重组DNA分析（5'AOX1端是黑色标注，3'AOX1为斜线标注），3'AOX1即AOX1基因终止子是位于卡拉霉素抗性基因后，因此过程⑤应选用的限制酶是BglⅡ。结合题干信息和质粒上的酶切位点分析：以顺时针方向统计，BglⅡ和SnaBI之间的长度为27Kb，SnaBI和AyrⅡ之间的长度为23Kb，AyrⅡ和BglⅡ之间的长度为54Kb，BglⅡ和BglⅡ之间的长度为38Kb。已知HBsAg基因长度是55kb，因此获得的重组DNA的长度为27+54+55=136Kb。 （5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量。 2、（2024·天津滨海新·三模）抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1为抗除草剂转基因玉米的技术流程。    (1)为了减少限制酶识别序列的影响，科研人员研发了新的DNA重组方法：无缝克隆In-Fusion技术（图2），其中In-Fusion酶可以将任何具有相同15bp末端序列的线性DNA分子进行连接，类似同源重组。    ①科研人员希望应用以上方法构建含有A和GUS基因的重组DNA分子，首先获得了3种DNA分子如图3，然后混合进行In-Fusion反应。 如果引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段 。完成重组反应后，将产物表达载体加入经过 处理的农杆菌中。 ②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物 扩增目的基因并电泳检测。请在图4中画出阳性菌落（成功转入目标重组DNA分子的菌落）的电泳结果 。 (2)农杆菌转化愈伤组织时，用含 的选择培养基筛选转化的愈伤组织。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。已知报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，则排除假阳性的原理是：报告基因GUS在 细胞中表达，而在农杆菌中不表达，因此用无色物质K处理上述能正常生长的愈伤组织，假阳性的农杆菌 （出现/不出现）蓝色。 【答案】(1) a和d Ca2+ 1和4 (2) 除草剂 真核 不出现 【分析】在构建基因表达载体时，需用限制酶将载体切开，以便目的基因的插入,需要DNA连接酶将目的基因与载体进行重组。载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列不能出现在目的基因内部，要保持目的基因的完整性，否则目的基因会被破坏。若目的基因两侧缺少相应的限制酶识别序列，可通过PCR技术在目的基因两侧添加相应限制酶识别序列。 【详解】（1）①结合图3分析，引物2上额外添加的片段对应于GUS基因中加粗的e片段，那么进行ln-Fusion反应时，A基因的右侧序列、GUS基因的左侧序列会连接在一起。还需要将A基因、GUS基因连接到载体上，根据质粒两条核苷酸链的方向(5'→3')判断，引物1和引物4上额外增加的片段分别对应载体中的片段a、d，才能确保A基因的左侧序列、GUS基因的右侧序列分别与质粒连接。经钙离子处理成为感受态细胞的细胞，吸收外源DNA的能力强。 ②为筛选成功转入目标重组DNA分子的菌落，可以选取引物1和4扩增目的基因并电泳检测，若成功导入目的基因，则会存在基因合A和GUS发生融合的基因，若检测阳性，则说明转基因成功。则图4中画出的阳性菌落的电泳结果，由于阳性菌中含有融合基因，结合图示可知，其长度应该大于或等于600+800=1400，如图所示： （2）农杆菌转化愈伤组织时，需要用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织，能在该培养基上正常生长的愈伤组织为具有对除草剂的抗性；愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织（假阳性）也可能在选择培养基上生长。由于成功实现转化的愈伤组织中具有抗除草剂的基因，也有GUS基因，而报告基因GUS表达产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此用无色物质K分别处理上述的愈伤组织，出现蓝色的是无农杆菌附着的转化愈伤组织和不出现蓝色的是假阳性的农杆菌，这里依据的原理是GUS基因在真核细胞中表达，而在农杆菌中不表达。 3、（2024·河北承德·三模）培育抗草甘膦转基因大豆时，首先需要构建UTR—CTP—EPSPS序列（UTR—前导序列；CTP—叶绿体定位信号肽序列；EPSPS—抗草甘膦基因）和pCAMBIA1300质粒的重组载体，构建过程如图所示。重组载体通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R中，经测序验证后导入农杆菌菌株EHA105中形成转化的工程菌株，再转染大豆。回答下列问题： (1)构建UTR—CTP—EPSPS序列与pCAMBIA1300质粒的重组载体过程中，进行PCR时需要在两种引物的 端连接限制酶 的识别序列，引物序列的确定应依据 ，PCR依据的原理是 。 (2)重组质粒PTWGM1接入的UTR—CTP—EPSPS序列中，EPSPS基因与CTP绑定的目的是 。利用质粒PTWGM1可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS片段，是因为其结构中含有 。 (3)质粒PTWGM1通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R的关键是利用电脉冲在 处打开通道，使得外源DNA能够顺利进入细胞内。要确定细胞电转化是否成功，需要在培养大肠杆菌的培养基中添加 进行筛选。 (4)若要回收EPSPS片段，可将扩增产物通过电泳进行分离后，割下凝胶以回收扩增的EPSPS基因。在凝胶中DNA分子的迁移速率与 （答出两点）有关。若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是 （答出一点）。 【答案】(1) 5' hpt 目的基因的碱基序列 DNA复制 (2) 将EPSPS基因表达的产物引导到叶绿体 复制原点 (3) 细胞膜 卡那霉素 (4) 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高等 【分析】1、PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由图可知，构建UTR—CTP—EPSPS序列与pCAMBIA1300质粒的重组载体过程中，在限制酶hpt处切开将UTR—CTP—EPSPS序列插入，进行PCR时会从引物的3'端延伸，所以需要在两种引物的5'端连接限制酶hpt的识别序列，由于引物的碱基序列序列要与目的基因碱基序列互补，其引物序列的确定应依据目的基因碱基序列，PCR依据的原理是DNA复制。 （2）由题干知，CTP—叶绿体定位信号肽序列，EPSPS基因与CTP绑定的目的是将EPSPS基因表达的产物引导到叶绿体，复制原点是DNA复制时特定的起始位点，因此用质粒PTWGM1可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS片段，是因为其结构中含有复制原点。 （3）质粒PTWGM1通过电转化方式导入大肠杆菌DH5R，是利用电脉冲在细胞膜处打开通道，这样可以使外源DNA容易进入细胞；由于重组载体中含有卡那霉素抗性基因，所以在筛选时可以在培养基中加入卡那霉素。 （4）琼脂糖凝胶电泳时，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关；琼脂糖凝胶电泳结果中，若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，说明在PCR过程中可能出现了异常，根据PCR技术特点，可能是引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、退火温度偏低、酶的量偏高等原因。 4、（2024·河北邯郸·三模）通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合1c1'-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tet'是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。回答下列问题： 限制酶 EcoR I BamH I HindⅢ Xma I 识破序列和切割位点 5'—G↓AATTC—3' 5'—G↓GATCC—3' 5'—A↓AGCTT—3' 5'—C↓CCGGG—3' (1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是 。 (2)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，若目的基因扩增3代，则共用引物 个。PCR完成以后，常采用 法来鉴定PCR的产物。 (3)过程①中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加 、 限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5'端分别添加 基因两端的同源序列。 (4)过程⑦中，在含有 的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除 LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对 LacZ 基因进行回补，筛选 LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加 。 【答案】(1)无需使用限制酶和DNA连接酶 (2) 使 DNA聚合酶能够从引物3'端连接脱氧核苷酸 14 琼脂糖凝胶电泳 (3) EcoRI BamH I LacZ (4) 四环素和X-gal 蔗糖和X-gal 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）体内同源重组在活细胞内完成，不需要使用限制酶和DNA连接酶，就可实现靶基因的敲除或替换，而限制性内切酶的酶切位点有限，会限制体外重组的实现。 （2）采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，若目的基因扩增3代，DNA有23=8个，DNA单链有8×2=16个，去除两条模板链，则共用引物14个。PCR完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定PCR的产物。 （3）选择限制酶时，不能破坏目的基因、标记基因、复制原点，所以可选择BamHⅠ和EcoRⅠ对载体进行切割，由于目的基因两端没有相应的酶切位点，则设计引物时在引物5＇端分别添加的碱基序列是GGATCC和GAATTC，作为BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列。过程⑤中，设计两种引物时需在引物5＇端分别添加上LacZ基因两端的同源序列，利用同源重组技术将LacZ基因与载体相连。 （4）由于LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，若培养基中出现白色菌落，则说明成功导入重组质粒，LacZ基因成功敲除，由于重组质粒上有四环素标记基因，故含有四环素和X-gal的培养基中出现白色菌落。过程⑧通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，由于sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，则添加X-gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X-gal可筛选LacZ基因回补菌株。 5、（2024·河北秦皇岛·三模）α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β和γ环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和89位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt 催化特异性提高了27倍。请回答下列问题。 (1)蛋白质工程的第一步通常是确定预期的 。重叠PCR是常用的DNA定点突变技术，其原理如图所示。与细胞内的DNA复制相比，PCR不需要用到 酶。要完成两处位点的突变，至少要设计 种引物。 (2)下图是该酶编码链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸（密码子：GAU、GAC）到赖氨酸（密码子：AAA、AAG）的引物FP2和RP1中三个连续碱基，分别为 、 。 (3)用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题。重组cgt位于双突变载体（简称Ｔ载体）上，研究人员将重组cgt基因与pET-20b（+）载体（简称p载体）上的pelB信号肽序列连接，构成重组载体cgt-p，该过程如图所示。应选用 、 对T载体酶切处理，用 、 对p载体进行酶切处理，并用 酶构建重组载体cgt-p，导入目的工程菌。培养基中除基本营养外，还需加入 完成筛选。 【答案】(1) 蛋白质功能 解旋 6 (2) AAA TTT (3) XmaI BamHI XmaI BclI DNA连接 氨苄青霉素 【分析】1、PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）蛋白质工程的基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。因此蛋白质工程的第一步通常是确定预期的蛋白质功能。 与细胞内的DNA复制相比，PCR技术用的原理是DNA的体外复制，其中双链分开靠的是加热，不需要解旋酶。要完成两处位点的突变，由图可知，完成一处突变需要两种通用引物和两种突变引物，如果要完成两种突变，则需要两种通用引物，和四种突变引物，至少要设计6种引物。 （2）将372位天冬氨酸（GAC）替换为赖氨酸（AAA、AAG），为了改变最少的碱基序列，可将天冬氨酸（GAC）替换为赖氨酸（AAA），赖氨酸的密码子为AAA，目的基因的碱基序列为TTT，根据碱基互补配对原则，引物FP2三个连续碱基为AAA，引物RP1三个连续碱基为TTT。 （3）为了不破坏重组cgt的完整性，应选用XmaI、BamHI对T载体酶切处理。由重组载体cgt-p上的顺序可知，需要保持pelB的完整性，所以只能选用BclI切一端，（XmaI、SmaI的识别序列相同），由图可知，为了保证重组cgt的反向连接，用XmaI、BclI对p载体进行酶切处理，并用DNA连接酶构建重组载体cgt-p，导入目的工程菌。重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（标记基因），因此，培养基中除基本营养外，还需加入氨苄青霉素完成筛选。 6、（2024·河北邯郸·三模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。Wx基因模板链第226位碱基为G，此时胚乳中直链淀粉含量最高（表现为非糯性），记为品种G；若该位点突变成T，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低（表现为糯性），记为品种T。已知品种G和品种T杂交，后代均表现为非糯性，下图表示品种G和品种T中Wx基因的部分碱基序列，请回答下列问题：   (1)研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料进行PCR扩增，若引物1的核苷酸序列为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTC-3'，则引物2的核苷酸序列为5'- -3'。 (2)研究人员对PCR 扩增产物经AccⅠ酶（已知AccⅠ酶的识别位点为，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点）切割后进行 可以检测出该待测水稻属于哪种品种。若检测结果只观察到长度为 bp的DNA条带，则表明该水稻为品种T。 (3)将品种T的Wx基因与载体结合构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有 。若利用我国科学家独创的目的基因导入方法获得转基因水稻，此种方法 （填“需要”或“不需要”）进行植物组织培养，原因是 。 (4)若利用基因工程改造品种G，获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻，可以将Wx基因 （填“正向”或“反向”）接入质粒，导入品种G 的受体细胞进而获得转基因水稻，从 水平抑制Wx基因表达。 【答案】(1)ATGATTTAACGAGAGTTGAA (2) 琼脂糖凝胶电泳 460 (3) 限制酶和DNA连接酶（或限制性内切核酸酶和DNA连接酶） 不需要 受体细胞是受精卵，受精卵能直接发育成新个体 (4) 反向 翻译 【分析】用PCR扩增DNA片段的过程中，脱氧核苷酸只能加在引物3'端，子链延长方向是5'→3'，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氧核苷酸单链片段作引物。 【详解】（1）引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同；而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3'。 （2）常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。引物1设计区碱基序列为71位到90位，引物2设计区碱基序列为511位到530位，故若酶切产物只能观察到460bp的DNA条带，则表明第226位碱基是T，该位点所在序列不能被正常剪接，该水稻为T品种。 （3）构建基因表达载体的过程中用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。花粉管通道法是我国独创的一种将目的基因导入受体细胞的方法。其过程是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。因此不需要进行植物组织培养。 （4）若利用基因工程改造品种G，获得胚乳直链淀粉含量低的新品种水稻，需要破坏Wx基因或者抑制Wx基因表达。将Wx基因“反向”接入质粒，导入品种G的受体细胞，可以从翻译水平抑制 Wx基因表达。 7、（2024·河北沧州·三模）龙牙槐木具有较高的药、食两用价值，其活性成分包括楤木皂苷。总三萜包括三萜皂苷等，三萜皂苷是楤木皂苷主要结构，其合成途径中的一个关键限速酶基因是Aeβ-AS基因。研究人员构建了含该基因的表达载体，并对烟草进行异源转化，以期提高楤木皂苷的产量，WT组为野生型烟草，L2、L21、L25、L30均为转基因株系，相关实验结果如图所示。回答下列问题 (1)在短时间内可通过 技术在龙牙槐木体外大量扩增Aeβ-AS基因，该过程通常需要人工合成长度为20～30个核苷酸的片段，该片段具有的特点是 （答出两点） (2)获得足量的Aep-AS基因后需构建基因表达载体，该载体上启动子的作用是 ，常用 法将重组载体导入烟草细胞。转基因烟草细胞需经 技术获得转基因烟草植株，该过程所需培养基中要加入的植物激素是 。 (3)检测Ae-AS基因是否表达可用 法。转基因株系中总三萜含量较WT组高，说明 。结合图1、2分析，能提取到较高含量楤木皂苷的株系及部位是 。 【答案】(1) PCR 不同片段之间不能互补、与目的（Aeβ-AS）基因两端的序列互补 (2) RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动目的（Aeβ-AS）基因转录 农杆菌转化（或花粉管通道） 植物组织培养 生长素和细胞分裂素 (3) 抗原—抗体杂交 转基因烟草中的Aeβ-AS基因表达，使总三萜含量升高 L30株系的叶片 【分析】1、基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶、载体； 2、基因工程的基本操作步骤：目的基因的获取、构建基因表达载体（基因工程的核心步骤）、把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法、目的基因的检测和鉴定（分子水平、个体水平）。 【详解】（1）在短时间内可通过PCR技术在龙牙槐木体外大量扩增Aeβ-AS基因，该过程通常需要人工合成长度为20～30个核苷酸的片段，该片段具有的特点是不同片段之间不能互补、与目的基因两端的序列互补； （2）获得足量的Aeβ-AS基因后需构建基因表达载体，该载体上启动子的作用是RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动目的基因转录。常用农杆菌转化或花粉管通道法将重组载体导入烟草细胞。转基因烟草细胞需经植物组织培养技术获得转基因烟草植株，该过程所需培养基中要加入的植物激素是生长素和细胞分裂素； （3）检测Aeβ-AS基因是否表达可用抗原—抗体杂交法。转基因株系中总三萜含量较WT组高，说明转基因烟草中的Aeβ-AS基因表达，使总三萜含量升高。结合图1、2分析，能提取到较高含量楤木皂苷的部位是L30株系的叶。 8、（辽宁省部分学校2024年高三临考押题考试（三模））In-Fusion 技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即同源序列，通常为15~20 bp），然后用In-Fusion酶（能识别双链线性化 DNA 片段：5'→3'末端任意16个碱基，使其降解）处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。回答下列问题： (1)通过PCR 扩增需要用到引物，引物的作用是 。在设计引物时最好在引物的 端添加限制酶的识别序列。引物 A 或引物 B要依据 的序列进行设计。若目的基因通过PCR 循环5次，需要消耗引物 个，经过程②扩增n次，得到符合要求的目的基因片段数量为 。 (2)PCR 过程包括变性、复性、 。其中复性时温度需要降低到50℃左右的目的是 。 (3)图中同源序列1、2 中的碱基序列一般不同，这样设计的原因是 。 (4)将同源序列1和2与线性化质粒连接成重组质粒需要 的作用，若将重组质粒导入植物细胞，则常用的方法为 。与传统构建重组质粒的方法相比， In-Fusion技术的优势之一是 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸 5， 质粒（或引物1、2）与目的基因碱基（或脱氧核苷酸） 62 2n-2n (2) 延伸 使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 (3)防止目的基因反向连接以及防止线性化质粒或目的基因自身环化 (4) DNA连接酶 农杆菌转化法 不受限制酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等 【分析】PCR技术： (1) 概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 (2) 原理：DNA双链复制。 (3) 前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 (4) 条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶。 (5) 过程：变性→复性→延伸。 【详解】（1）通过PCR 扩增需要用到引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸。在设计引物时最好在引物的5，端添加限制酶的识别序列（因为3，需要连接脱氧核苷酸）。据图分析，目的基因经引物A和引物B扩增后需要与线性化质粒连接，故为保证扩增出所需的目的基因，引物A和引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计。若目的基因通过PCR 循环5次，得到25即32个DNA分子，共64条链，只有模板DNA的两条链不含有引物，其他单链均含有引物，故若目的基因通过PCR 循环5次，需要消耗引物62个，PCR过程中，每增加一轮循环，中链就增加2条，循环n次后，产生2n条中链，进而形成2n个不等长DNA分子。即等长DNA分子（目的基因）数目=总DNA分子数-不等长DNA分子数=(2n-2n)个。 （2）PCR 过程包括变性、复性、延伸。其中复性时温度需要降低到50℃左右的目的是使得两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）图中同源序列1、2 中的碱基序列一般不同，这样设计的原因是防止目的基因反向连接以及防止线性化质粒或目的基因自身环化。 （4）将同源序列1和2与线性化质粒连接成重组质粒需要DNA连接酶（催化DNA片段之间磷酸二酯键的形成）的作用，若将重组质粒导入植物细胞，则常用的方法为农杆菌转化法。与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion术的优点有：不受限制酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 9、（2024·辽宁沈阳·三模）腓骨肌萎缩症（CMT）是一种常见的遗传性疾病，患者常出现神经元肿胀、轴突变性及肌肉萎缩等症状。为探究突变的NEFH基因与CMT的关系，某科研团队利用生物工程技术，构建出多只含有突变的NEFH基因的转基因模型鼠。据图回答下列问题： (1)图1中基因的编码区是指基因中能够转录mRNA的区域，其上游、下游存在能调控转录过程的非编码区。该基因的启动子位于图1中 区段（填“非编码区1”、“编码区”或“非编码区2”）。 (2)构建基因表达载体前，需对该基因进行PCR扩增。PCR的原理是 。在不影响该基因编码功能前提下，应选图2中限制酶 对该基因进行切割，载体也需用相同的限制酶进行切割的原因是 。 (3)构建基因表达载体后导入小鼠体细胞，再结合生物工程中的 技术制备出转基因模型鼠（如图3）。4号鼠遗传物质与2号鼠 （填“完全”或“不完全”）相同，原因是 。若4号鼠表现为 ，说明突变的NEFH基因与CMT的发生有关，此项研究为CMT的靶向治疗提供了理论基础。 【答案】(1)非编码区1 (2) DNA半保留复制 XhoI、XbaI 产生相同的末端，以便能用DNA连接酶将载体和目的基因连接 (3) 细胞核移植、早期胚胎的培育、胚胎移植 不完全 4号鼠的遗传物质还有来自1号鼠的细胞质基因，以及人为导入的“突变的 NEFH 基因” 腓骨肌萎缩 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 2、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。 【详解】（1）在真核细胞的基因结构中，包括编码区和非编码区，其中编码区又分为外显子和内含子，基因的非编码区存在启动子和终止子，启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列，属于基因的非编码区，分别位于编码区的上游和下游，所以该基因的启动子应该位于图1的非编码区1。 （2）PCR的原理是DNA半保留复制。加入限制酶后要不影响该基因编码功能，则酶切处理后的片段连接到运载体之后不影响编码区的序列。BamH I、Pst I的酶切位点都处于编码区中间，经酶切处理后的片段连接至运载体后序列发生了变化。XhoI、XbaI的酶切位点也在编码区，但与相同切口的运载体连接后，编码序列未发生变化，因此在不影响该基因编码功能的前提下，应选择的限制酶是XhoI、XbaI。载体也需用相同的限制酶进行切割的原因是使其产生相同的末端，以便能用DNA连接酶将载体和目的基因连接。 （3）根据图3可以看出，培育出转基因模型鼠除了基因工程技术，还有细胞核移植、早期胚胎的培育、胚胎移植等技术。4号鼠遗传物质与2号鼠不完全，原因是4号鼠的遗传物质还有来自1号鼠的细胞质基因，以及人为导入的突变的 NEFH 基因。若4号鼠表现为腓骨肌萎缩(症)(或CMT、神经元肿胀、轴突变性、肌肉萎缩均可)，说明突变的NEFH基因与CMT的发生有关，此项研究为CMT的靶向治疗提供了理论基础。 10、（2024届辽宁省高三联考三模）某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶：已知图中W基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图1中质粒为载体，进行转基因。不同限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。请回答下列问题： 限制酶 BamH I EcoR I Mfe I KpmI Hind II 识别序列 及切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTC GCTAC↓C A↓AGCTT (1)限制酶主要是从 中分离纯化出来的。应使用限制酶 切割图1中质粒，使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 (2)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 启动子（选填“植物”、“真菌”或“放线菌”）。 (3)W基因转录的模板链是 （选填“甲链”或“乙链”）。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理是 ，子链的延伸方向是 。 (4)研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAAC-CCUA…（中间序列）…GUCCACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为__________。 A．5'-TGAACGCTA… B．5'-CCAGTCGAC… C．5'-GAATTCTGA… D．5'-AACCTTCGA… 【答案】(1) 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ (2) RNA聚合酶 放线菌 (3) 乙链 DNA复制 5，→3， (4)A 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）限制酶主要是从原核生物分离纯化出来的。根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI（切割出的黏性末端与MfeI相同）、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒，因为限制酶MfeI和限制酶EcoRI切割露出相同的粘性末端。 （2）启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA聚合酶；根据题干信息“启动子通常具有物种特异性”，目标是使放线菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择放线菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择放线菌启动子。 （3） W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链。利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，子链延伸方向为5'→3'。 （4）引物与模板链的3，端结合，mRNA也与模板链结合，因此引物与mRNA序列相似，不同的是引物是一段DNA，因此将mRNA中的U替换成T即是引物序列，即5'-UGAAC-CCUA…（中间序列）…GUCCACUCG-3'→5'-TGAAC-CCTA…（中间序列）…GTCCACTCG-3'，与A相同。故选A。 11、（2024·辽宁·三模）研究低温条件下番茄细胞WHY1基因对光合作用的影响，对于温度敏感型蔬菜作物的栽培具有重要的实践意义。回答下列问题： (1)研究人员利用重组DNA技术，将克隆的WHY1基因与外源高效启动子连接，导入番茄基因组中构建WHY1基因的过表达植株（），如图1所示。若限制酶切割WHY1基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端（即图中Ⅰ、Ⅱ处），则会出现 （答出2点）等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。 (2)PCR的产物一般通过电泳来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准，2号泳道为阳性对照（提纯的相关蛋白基因片段），3号泳道为实验组。1号泳道的条带实质为 ，若3号泳道有杂带（非目的DNA片段）出现，则原因可能是 （答出2点）。 (3)小干扰RNA（siRNA）能诱导特定基因转录出的mRNA降解，导致基因沉默。研究人员据此构建了WHY1基因的沉默植株（），siRNA因阻断了 过程而关闭了WHY1基因。进一步研究发现，番茄细胞WHY1基因影响光反应阶段D1蛋白（可捕捉光能）的含量，且与温度有关。研究人员用特定抗体检测D1蛋白在叶绿体内的含量，结果如表所示。该实验中的自变量为 ，对比三种番茄的D1蛋白含量可得到的结论是 。 温度 25℃ 4℃ 植株类型 W W D1蛋白含量 【答案】(1)WHY1基因自身环化、WHY1基因与番茄基因组反向连接等情况 (2) 不同已知长度的DNA片段 作为模板的DNA受到污染、引物的特异性不强，使模板与多个引物结合 (3) 翻译 温度、WHYI基因的表达程度 在 25℃条件下，WHYI基因对 D1蛋白的合成无影响；在4℃条件下，WHYI 基因能促进D1蛋白的合成，且D1蛋白的含量与WHYI基因的表达程度有关 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）若限制酶切割WHY1基因和番茄基因组后形成相同的黏性末端，则会出现WHY1基因自身环化、WHY1基因与番茄基因组反向连接等情况，从而导致构建过表达植株的成功率下降。 （2）电泳鉴定DNA片段的实质是根据不同DNA分子的迁移速率、DNA分子的大小和构象不同而将DNA片段分离开来，因此作为电泳道的标准，其本质就是不同已知长度的DNA片段。PCR过程中，作为模板的DNA受到污染，或引物的特异性不强，使模板与多个引物结合，均会扩增出多条不同长度或构象的DNA片段，从而在电泳过程中出现多条电泳带。 （3）小干扰RNA（siRNA）能诱导特定基因转录出的mRNA降解，导致基因沉默，故siRNA因阻断了翻译过程而关闭了WHY1基因。 自变量是指人为控制不同的量，由表格可知，本实验的自变量是温度、WHYI基因的表达程度。 由题可知，在25℃条件下，W+、W、W-的D1蛋白含量相同，说明在25℃条件下，WHY1基因对D1蛋白合成无影响。在4℃条件下，W+、W、W-的D1蛋白含量从大到小为W+>W>W-，说明在4℃条件下，WHY1基因能促进D1蛋白的合成，且WHY1基因的表达程度越高，D1蛋白的含量越多。 12、（2024届辽宁省高三·三模）诱变育种和基因工程育种均为实验室常用的生物育种手段。已知玉米的抗虫性状由一对等位基因调控，为了得到抗虫玉米植株，某实验室对野生型玉米种子进行了不同方法的处理后得到目的植株。回答下列问题： (1)该实验室对野生型玉米种子进行了诱变处理，进行培育、筛选后得到突变植株，该植株自交，后代中抗虫植株约占1/4，说明诱变引起的突变为 （填“隐性”或“显性”）突变。进一步研究发现，该突变是由野生型某个基因发生一个碱基由G到A 的替换导致的，则野生型基因和抗病基因的碱基序列长度 ，碱基序列 。（后两空填“相同”或“不同”） (2)该实验室利用农杆菌转化法将外源抗虫基因（cry）转入野生型玉米细胞得到转化细胞，并将其培育成植株X，过程如图1 所示，其中1、2代表染色体，抗氨苄青霉素基因（AmpR）为标记基因。已知该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换。 ①忽略抗虫基因和抗性基因的区别，仅根据两个基因在染色体上位置，除图1中的转化细胞种类外，请在图2中画出还可能得到的其他种类的转化细胞 。 ②研究表明，标记基因的产物对细胞具有一定的毒害作用，因此为了得到抗虫性状稳定遗传且不含标记基因产物的优良植株，可将植株X 进行自交从而获得预期目的的植株。为达到该目的，是否可以将cry基因和AmpR基因用同一个 Ti 质粒进行转运？ （填“可以”或“不可以”），原因是 。 【答案】(1) 隐性 相同 不同 (2) 不可以 若将cry和AmpR 用同一个 Ti质粒进行转运，则cry基因和AmpR基因会位于同一条染色体上，由题意可知，该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换，因此无法获得不含标记基因，只含目的基因的优良植株 【分析】基因突变是指DNA分子上发生碱基对的增添、缺失或替换，导致基因结构发生改变的过程。 【详解】（1）植株自交，后代中抗虫植株约占1/4，说明抗虫为隐性性状，即说明诱变引起的突变为　　　　　　　　　隐性突变。研究发现该突变是由野生型某个基因发生一个碱基由G到A的替换导致的，说明该突变的实质是发生了碱基对的替换，因此野生型基因和抗病基因的碱基序列长度相同，碱基序列不同。 （2）①cry基因和AmpR基因可能均位于1号（或2号）染色体的同一条染色体上，也可能分别位于1号染色体的两条染色体上，或者分别位于1号和2号染色体上，故其他种类的转化细胞下图：。 ②抗虫性状稳定遗传且不含标记基因产物的优良植株的细胞中，两个cry基因应该分别位于1号（或2号）染色体的两条染色体上。若将cry基因和AmpR基因用同一个Ti质粒进行转运，则cry基因和AmpR基因会位于同一条染色体上，由题意可知，该品种玉米染色体结构较为稳定，不会发生染色体互换，因此无法获得不含标记基因，只含目的基因的优良植株，所以不可以将cry基因和AmpR基因用同一个 Ti 质粒进行转运。 13、（2024·吉林长春·三模）东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。 (1)乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。 (2)通过上述方法筛选得到6种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下表，应选择乳酸菌编号为 的菌株进行后续操作。 乳酸菌编号 Ll L2 L3 L4 L5 L6 抑菌率/% 28．57 19．48 58．44 14．28 6．49 36．36 (3)研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。下面是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。 ①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 。PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。 ②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5＇端加入 （填“BamH I”或“Nde I”）的识别序列。 ③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。 1：DNA标准样 2：普通受体菌的DNA 3：转化操作后受体菌的DNA 4：无菌水 设置4号的目的是 （答出1点即可），电泳结果表明 。 【答案】(1) 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 平板划线法（稀释涂布平板法） (2)L3 (3) 引物2和引物3 30 BamH I 判断PCR反应体系是否受到污染 目的基因已成功导入受体细胞 【分析】1、筛选和分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法。 ①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。 ②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸。引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。 【详解】（1）常用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）对培养基进行灭菌。分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，即可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。 （2）由表格内容可知，乳酸菌编号为L3的菌株对霉菌的抑菌率最高，因此应选择乳酸菌编号为L3的菌株进行后续操作。　　　　　 （3）①PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，因此利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是引物2和引物3。PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是2×24-2=30。 ②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动子位于右端，终止子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在引物2的5＇端加入BamH I的识别序列。 ③4号为无菌水组，设置4号的目的是判断PCR反应体系是否受到污染。3号为转化操作后受体菌的DNA，提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，3号中出现500bp的DNA片段，已知细菌素基因为500bp，由此可知目的基因已成功导入受体细胞。 14、（2024·吉林·三模）当蚊子叮咬时，它会将唾液中一种叫做anophelins 的蛋白质（一种抗凝血因子）注入宿主体内，让血液更自由地流动。长期以来，研究人员一直试图利用疟蚊创造人用新型血液稀释剂。回答下列问题： (1)蚊子产生的anophelins 蛋白对于人体来说是异物，免疫系统会对其进行攻击，发生免疫反应，这体现了免疫系统的 功能 (2)为获取anophelins 基因，需提取蚊子 的总RNA，再经逆转录过程得到DNA，将其作为PCR反应的模板。并设计一对特异性引物来扩增目的基因。    (3)构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins基因整合到质粒上， 如上图，应使用限制酶 切割如图中含anophelins基因的DNA片段，使用限制酶 切割图中质粒，以获得能正确表达的重组质粒。 (4)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA并用适当的限制酶（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度。这一操作的目的是 。 (5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产anophelins蛋白更具有优势。其理由是 。 【答案】(1)免疫防御 (2)唾液腺 (3) EcoRI、HindIII MfeI、HindIII (4)筛选出导入目的基因的大肠杆菌或检测大肠杆菌是否含有目的基因 (5)动物细胞比大肠杆菌多了复杂的生物膜系统（内质网和高尔基体）， 可对anophelins基因的表达产物进行正确地加工与折叠，产生具有生物活性的蛋白质 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 【详解】（1）免疫系统会对蚊子的anophelins 蛋白质进行攻击，发生免疫反应，这体现了免疫系统的免疫防御功能。 （2）anophelins 的蛋白质位于蚊子的唾液中，因此为获取anophelins 基因，需提取蚊子的总RNA。 （3） 构建基因表达载体时、若科研人员需将anophelins基因整合到质粒上， 如上图，anophelins基因两侧，有多个酶切位点，获取含目的基因最短的DNA片段，应使用限制酶EcoRI、HindIII进行目的基因的切割，而图中的质粒切除的端口应与目的基因被切除的一致，且不切割启动子和标记基因和抗性基因，因此选择MfeI、HindIII切割质粒，获得正确表达的重组质粒。 （4）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌，提取来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA并用适当的限制酶（如BamHI） 切割， 经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段长度，与目的基因的长度进行对比，如果有目的基因大小的片段出现，可以筛选出导入目的基因的大肠杆菌或检测大肠杆菌是否含有目的基因。 （5）由于动物细胞比大肠杆菌多了复杂的生物膜系统（内质网和高尔基体）， 可对anophelins基因的表达产物进行正确地加工与折叠，产生具有生物活性的蛋白质，因此转基因动物作为生物反应器生产anophelins蛋白更具有优势。 15、（2024·黑龙江齐齐哈尔·三模）人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题：    限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau3AⅠ NotⅠ 识别序列及切割位点                  (1)要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是 。基因工程技术中通常选择 种限制酶进行酶切。 (2)人乳铁蛋白基因可利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物 （在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择），连续扩增5次后至少需要引物 个。 (3)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有 （填“四环素”或“氨苄青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用 工程技术获得转基因小牛。 (4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用 技术，若 ，则表明目的基因已翻译形成蛋白质。 (5)对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是 。 【答案】(1) BamHⅠ 2/两 (2) Ⅱ、Ⅲ 62 (3) 氨苄青霉素 胚胎 (4) 抗原-抗体杂交 检测结果呈阳性 (5)转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物活性 【分析】基因表达载体的构建使基因工程的核心步骤，表达载体元件包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点。 【详解】（1）要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白两端的识别序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切除相同的黏性末端，结合质粒上的识别序列可知，只用一种酶且切除相同的黏性末端，则应选择的限制酶是BamHⅠ。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。 （2）引物的作用是使耐高温DNA聚合酶从引物的3'端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5'端应该于模板链的3'端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ，连续扩增5次后至少需要引物为（25-1）×2=62个。 （3）据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。 （4）检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原-抗体杂交技术，若检测结果呈阳性，则表明目的基因已翻译形成蛋白质。 （5）对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物活性。 16、（2024·黑龙江大庆·三模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢，从而导致可溶性糖含量高，汁多质脆，研究发现这与甜玉米G蛋白含量较高有关。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、2所示。 (1)图1中，强启动子是一段在特殊序列结构的DNA片段。位于基因的 驱动基因持续转录，该转录过程中模板链的5’端位于 （填“M”或“N”）端。 (2)图2所示载体为农杆菌的Ti质粒，当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 。 (3)结合图1和图2，为使DNA片段能定向插入Ti质粒中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列分别是限制酶 的识别序列。 (4)外植体经脱分化过程形成的愈伤组织放入农杆菌液（含重组Ti质粒）浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入 进行筛选，最终获得玉米植株Y1、Y2、Y3.通过对3个植株的G蛋白表达量和还原糖的含量进行测定，发现Y3植株的G蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，原因可能是 。 (5)下图为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸（RNA剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制提出一种假说：吗啉反义寡核苷酸可能导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切，而不是内含子1对应序列被单独剪切。（外显子：基因中编码蛋白质氨基酸的片段。内含子：基因中不编码蛋白质氨基酸的片段。） 为证明该假说，设置两组实验，一组玉米受精卵中导入吗啉反义寡核苷酸，另一组不导入。提取两组受精卵中的RNA，逆转录合成DNA（即cDNA）： ①以cDNA为模板，选择图示引物 进行PCR，产物进行电泳鉴定，根据是否有扩增产物及产物大小判断该假说是否成立。 ②若某次电泳结果发现实验组和对照组均没有出现任何条带，从PCR反应成分的角度分析， 可能的原因是 （至少写出1点）。 【答案】(1) 上游 M (2) T-DNA 该细胞的染色体DNA上 (3)NotⅠ和SacⅠ(顺序不能颠倒） (4) 卡那霉素 Y3植株玉米中G蛋白活性较低（合理即可） (5) 2和5 漏加了PCR反应成分（或反应成分用量不当；或引物设计不合理；合理即可） 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）强启动子是一段在特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游；在基因表达载体的构建时，G基因位于启动子的下游，转录时RNA聚合酶和启动子结合，N端是DNA链的3’端，子链延伸的方向是5’端到3’端，因此模板链的5’端位于M端。 （2）当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 （3）为使G基因在玉米植株中超量表达，应确保强启动子和G基因不被破坏，故应优先选用EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切割质粒，为保证强启动子和G基因能连在质粒上，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotⅠ和SacⅠ酶，然后再用DNA连接酶将强启动子和G基因与质粒连接。 （4）由图2可知，卡那霉素抗性基因位于T质粒的T-DNA中，随T-DNA整合到该细胞的染色体DNA上，所以进行植物组织培养时培养基中需加入卡那霉素进行筛选。筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。发现Y3植株的G蛋白表达量最多，但却不是还原糖含量最多的植株，可能Y3植株玉米中G蛋白活性较低。 （5）①若要证明假说成立，即RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去，则可以选择图示2和5进行PCR，观察是否有杂交带出现，如果RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去，PCR后电泳不会出现杂交带。 ②从PCR反应成分的角度分析，漏加了PCR反应成分（或反应成分用量不当；或引物设计不合理）均会导致电泳后的实验组和对照组没有任何条带出现。 17、（2024·黑龙江双鸭山·三模）某水稻品种含有基因Q，该基因在水稻体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中却因该基因不能与RNA聚合酶结合而无法表达。为了获得基因Q能够表达的卵细胞，研究人员进行了相关研究。回答下列问题： (1)水稻体细胞中RNA聚合酶可与基因Q的 结合开启转录。研究人员从水稻的体细胞中提取总RNA，经 过程获得基因Q中编码蛋白质的DNA片段。通过PCR技术扩增该DNA片段时需要根据 设计两种引物，扩增n轮需要消耗引物的数量为 。若直接从水稻体细胞中分离DNA，通过PCR技术扩增基因Q，则至少经过 轮循环才能得到只含基因Q的DNA片段。 (2)构建基因表达载体时，需要在基因Q的 （填“5′”或“3′”）端添加限制酶的识别序列，以保证目的基因和载体的正向连接。 (3)研究人员将基因Q与Luc基因（荧光素酶基因，荧光素酶能催化荧光素产生荧光）拼接成Q-Luc融合基因（融合基因中的Q和Luc基因都能独立表达），之后利用农杆菌转化法将融合基因转入水稻愈伤组织。经过 ，可获得转基因水稻。将转基因水稻培育成熟后，其卵细胞中的基因Q能够正常表达，推测可能的原因是 。在分离并培养转基因水稻卵细胞的过程中，可以筛选出能够表达基因Q的卵细胞，筛选的方法是 。 【答案】(1) 启动子 逆（反）转录 基因Q中编码蛋白质的DNA片段两端的碱基序列 3 (2)5′ (3) 植物组织培养 卵细胞的RNA聚合酶可与T-DNA的启动子结合 向培养基中加入荧光素，筛选出能产生荧光的细胞 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）RNA聚合酶可与基因Q的启动子结合后，开始启动目的基因的转录。目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。比如，体细胞中提取总RNA，经逆转录过程获得基因Q中编码蛋白质的DNA片段，然后再根据PCR进行扩增。进行PCR时需要用到一组引物，根据基因Q中编码蛋白质的DNA片段两端的碱基序列设计两种引物，每合成一个子链就需要一个引物，扩增n轮需要消耗引物的数量=2n×2-2=2n+1−2。通过PCR技术扩增基因Q，根据DNA半保留复制的特点，由于引物的不同，第一轮和第二轮扩增出现的4个DNA片段虽然都包含目的基因，但是这4条DNA片段的两条链不等长，在第三轮扩增结束后，才会出现2个双链等长的目的基因片段。因此经过3轮循环即可初步得到符合要求的只含基因Q的DNA片段。 （2）PCR进行扩增时子链从5，端向3，端延伸，故需要在引物的5，端添加相应的酶切位点。 （3）题干中指出利用农杆菌转化法将融合基因转入水稻愈伤组织，然后再分化成完整植物个体，因此经过植物组织培养，最终可以获得转基因个体。将转基因水稻培育成熟后，其卵细胞中的基因Q能够正常表达，即卵细胞的基因Q通过转录和翻译形成了蛋白质，推测可能的原因卵细胞的RNA聚合酶可与T-DNA的启动子结合。可以利用Q-Luc融合基因，Q-Luc融合蛋白表达，Luc基因荧光素酶基因，荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此向培养基中加入荧光素，筛选出能产生荧光的细胞。 18、（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。下图表示研究人员扩增ASFV的CP530R 和 F317L基因，并导入含病毒载体1和pSC101质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。 (1)引物F的设计依据是 。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是 。 (2)ccdB基因编码的毒性蛋白CcdB抑制DNA促旋酶，导致细胞死亡。ccdA基因编码的蛋白CcdA 可保护细胞免受CcdB毒害。将大肠杆菌先接种在含 的培养基中，在 ℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含 的培养基中，在 ℃下继续培养，获得含病毒载体2的大肠杆菌。 (3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有 ，重组过程涉及 键的水解和形成。 (4)转化后的 Vero细胞，在37℃、含 （气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用 技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是 。 【答案】(1) TK1 序列、CMV启动子序列 使子链充分延伸 (2) 鼠李糖、阿拉伯糖 30 氯霉素 37 (3) 与单链结合，保持单链稳定、介导单链入侵 磷酸二酯 (4) 5%CO2和95%空气 抗原-抗体杂交 能增殖，较长时间刺激免疫系统 【分析】PCR是一项根据DNA半保留复制原理进行的体外DNA复制技术，包括变性、复性和延伸三步。 【详解】（1）由图可知，使用引物F和引物R的目的是扩增出目的基因，同时便于扩增后的DNA片段进行同源重组，故引物F的设计依据是TK1 序列、CMV启动子序列。72℃属于延伸过程，故最后72℃3min的目的是保证延伸时间，使子链充分延伸。 （2）recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导，故先将大肠杆菌先接种在含鼠李糖、阿拉伯糖的培养基中，pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒，在30℃下能复制、在37℃下不能复制，先在30℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；由于大肠杆菌中含有氯霉素抗性基因，故一段时间后将大肠杆菌接种在含氯霉素的培养基中，在37℃下继续培养，阻止质粒pSC101复制，从而获得含病毒载体2的大肠杆菌。 （3）由图可知，据重组原理可知重组蛋白 RecT 能够与单链结合，保持单链的稳定，介导单链入侵，重组过程涉及到DNA片段的替换，故该过程涉及磷酸二酯键的水解和形成。 （4）转化后的 Vero细胞，在37℃、含5%CO2和95%空气的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用抗原-抗体杂交技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是能增殖，较长时间刺激免疫系统。 19、（2024·浙江·三模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题： Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种 (1)人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进行 、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的 ，完成杂交。 (2)胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或 消毒后，用 多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。 Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D基因的功能展开相关研究 (3)科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中，如下图所示。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。 ①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的 组，此外还需额外添加 ，通过显色反应做进一步验证。 A组：加色氨酸和组氨酸 B组：不加色氨酸和组氨酸 C组：加组氨酸，不加色氨酸 D组：加色氨酸，不加组氨酸 ②实验结果表明抗寒相关D基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。 对照组1：酵母菌导入pG-GAL4重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。 对照组2：酵母菌导入 ，实验结果： 。 实验组：酵母菌导入 ，实验结果： 。 (4)将抗寒相关D基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用含 的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出 植株，72小时 诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。 【答案】(1) 去雄 成熟花粉 (2) 次氯酸钠或氧化汞 无菌水 (3) B X-a-gal pG载体 无菌落，不变蓝 pG-D重组载体 有菌落，变蓝 (4) 除草剂 含D基因阳性 低温 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建： 是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞： 根据受体细胞不同，导入的方法也不—样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）葡萄植株在开花前进行去雄、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的成熟花粉，完成杂交。 （2）胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或次氯酸钠或氧化汞消毒后，用无菌水多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。 （3）①依据题干信息，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，为了能够筛选得到重组酵母，重组的载体中含有编码色氨酸合成酶的基因和具有转录激活功能的Va基因，AH109菌株的基因中含有HIS3基因可以编码组氨酸合成酶，所以若重组成功，就可以合成色氨酸和组氨酸，所以培养基配方中无需添加色氨酸和组氨酸，即B组；若用显色反应进行验证，依据题干信息，MEL1基因可以编码α-半乳糖苷酶，可分解X-α-gal产生蓝色物质，所以培养基中需额外添加X-α-gal。②依据图示信息，实验分为三组：对照组1是导入pG-GAL4重组载体，对照组2是只导入PG载体，实验组是导入pG-Va重组载体，对照组1导入pG-GAL4重组载体，含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落；对照组2只导入PG载体，无菌落接种，且不含有MEL1基因，所以不会出现蓝色物质，也无菌落生长；实验组导入pG-Va重组载体，也含有MEL1基因、HIS3基因及编码色氨酸的基因，所以实验结果出现蓝色，有菌落。 （4）构建了含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用农杆菌转化法进行转染。后续的实验操作（即目的基因的检测与鉴定）为：用含除草剂的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出含D基因阳性植株，72小时低温诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。 20、（2024·安徽·三模）“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre-LoxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。 (1)当两个LoxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre重组酶在此过程中的作用类似于 酶。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个LoxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于 。 (2)图1中LoxP序列的方向取决于序号 对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre重组酶切割后，将在DNA序列的 （填5′或3′）端形成游离的磷酸基团。 (3)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP序列与脑组织特异表达启动子M相连接，构建图2所示的基因表达载体，再用 法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵中，进而得到仅含一个图2所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基因小鼠a（不含Cre酶）。 (4)图2所示序列的两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启动子N（由信号分子X开启）连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a和b杂交，得到F1。 a.若无X作用时，该小鼠脑组织的色彩为 色，其他组织细胞颜色为 色。 b.若有X作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理： 。 【答案】(1) 限制酶和 DNA 连接 染色体结构变异 (2) ② 5′ (3)显微注射法 (4) 黄色 无色 F1为杂合子，有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、loxP1、loxP2 及Cre 酶基因；有信号分子 X时，启动 Cre酶表达，不同脑细胞中 Cre酶表达情况不同，Cre酶识别的 loxP不同，因而不同细胞会差异表达黄色、红色或蓝色荧光蛋白基因 【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。据此可知，Cre重组酶在此过程中的作用类似于限制酶和DNA连接酶。Cre重组酶使两个loxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于染色体结构变异。 （2）根据图示可知，LoxP序列①和③是反向重复序列，因此图1中LoxP序列的方向取决于序号②对应的区域。一个LoxP序列内部经过切割后会增加两个游离的磷酸基团，位于DNA序列的5′端。 （3）将基因表达载体导入动物细胞的方法为显微注射法。 （4） F1为杂合子，脑组织细胞中有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、loxP1、loxP2及Cre酶基因；无信号分子X时，Cre酶不表达，仅表达与启动子相邻的荧光蛋白的基因即黄色荧光蛋白基因，使脑组织细胞呈黄色。通过题干信息可知，“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，而其他组织细胞不是神经元，这些基因不表达，表现为无色。F1为杂合子，有编码黄、红、蓝荧光蛋白的基因、loxP1、loxP2及Cre酶基因。有信号分子X时，启动Cre酶表达，不同脑细胞中Cre酶表达情况不同，Cre酶识别的loxP不同，因而不同脑细胞会差异表达黄色、红色或蓝色荧光蛋白基因，使F1出现“脑彩虹”。 21、（2024·安徽·三模）利用金属硫蛋白启动子（PCUP1）和绿色荧光蛋白（CFP）基因等构建重组质粒PCUP9K-CFP，并通过氯化锂法转化毕赤酵母，获得工程菌株，工程菌细胞及其发酵液中可检出绿色荧光蛋白。发酵液中分别加入不同浓度的铜离子处理2h后，结果如图1；分别加入10μmmVL的铜、铬、镉和砷离子处理2h后，结果如图2（CK为对照组）。请回答下列问题：    (1)根据图1结果可知，GFP基因表达可以被一定浓度的铜离子促进，说明PCUPI属于 启动子，构建基因表达载体需要的工具酶有 ，重组质粒pCUP9K-GFP上不需要携带特殊抗性基因等充当标记基因，理由是 。 (2)培养工程菌的过程中，在接种环节要严格遵从无菌操作，如何确定接种操作达到无菌要求? 。 (3)含pCUP9K-GFP的毕赤酵母菌可以指示水体中铜离子的污染程度，理由是 。用铬、镉和砷离子处理该工程菌的目的是 。 【答案】(1) 诱导型 限制酶、DNA连接酶 （利用标记基因可以初步确定受体菌中是否含有目的基因，而）GFP基因表达出的绿色荧光蛋白可用于确定受体菌中是否含有目的基因 (2)用符合要求的培养基在相同接种环境中，加入无菌水模拟接种操作，将这些培养基和接种菌种的培养基一起置于恒温培养箱中培养，看是否有菌落长出（答“将未接种的培养基与接种的培养基置于相同条件下培养，看是否长出菌落”不给分） (3) 一定范围内，含pCUP9K-GFP的毕赤酵母菌发酵液中相对荧光量随铜离子浓度的增加而增加 排除铬、镉和砷等离子也能促进工程菌中的GFP基因表达的可能性（或检测含pCUP9K-GFP的毕赤酵母菌对重金属离子污染的指示是否具有专一性等） 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因−−DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA−−分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）导入金属硫蛋白启动子（PCUPI）之后，GFP基因表达可以被一定浓度的铜离子促进，说明该启动子是诱导型启动子。构建基因表达载体需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶；标记基因一般是用于初步筛选含有目的基因的受体细胞，GFP基因表达出的绿色荧光蛋白可用于确定受体菌中是否含有目的基因，因而不需要其他标记基因。 （2）确定接种操作过程是否符合无菌要求的方法一般是在接种过程中用一些灭菌合格的培养基平板，用等量无菌水代替菌种来模拟接种操作，观察这些培养基在培养的过程中是否会长出菌落。 （3）一定范围内，含pCUP9K-GFP的毕赤酵母菌发酵液中相对荧光量随铜离子浓度的增加而增加，可以用于指示水体中铜离子的污染程度。用铬、镉和砷离子处理这一工程菌，结果和对照组相似，可以排除环境中铬、镉和砷离子等对该工程菌产生绿色荧光蛋白的影响。 22、（2024·安徽马鞍山·三模）干扰素在体外保存相当困难，若将其分子上的一个半胱氨酸替换为丝氨酸，则可延长保存时间。科研人员利用PCR技术对干扰素基因进行定点突变。他们通过实验先在试管A中得到产物1，接着在试管B中得到产物2（已定点突变的干扰素基因），整个流程如下图。回答下列问题。 (1)PCR技术利用了 原理。实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，目的是 。 (2)在PCR反应体系中加入引物的作用是 。试管A中要得到产物1至少经过 次循环。试管B中所需的下游大引物为产物1中的 链。 (3)为了使定点突变的干扰素基因能在哺乳动物乳腺细胞中特异性表达，在构建该基因表达载体时应将该基因与 等调控元件重组在一起，然后将该表达载体通过 法导入哺乳动物的受精卵中。 【答案】(1) DNA半保留复制 避免外源DNA等因素的污染 (2) 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 2 β (3) 乳腺中特异表达的基因的启动子 显微注射 【分析】1、PCR技术： ①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术； ②原理：DNA半保留复制； ③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）； ④方式：以指数的方式扩增，即约2n； ⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。导入植物细胞一般采用农杆菌转化法，导入动物细胞采用显微注射法，导入细菌细胞采用钙离子转化法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR技术利用了DNA半保留复制的原理。实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，目的是避免外源DNA等因素的污染。 （2）在PCR反应体系中需要加入2种引物，引物的作用是在DNA复制过程中使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。识图分析可知，图中经过第1轮循环后得到1个含有突变上游引物的DNA片段，该DNA片段中含有一条模板链，一条含有突变上游引物的子链，然后以该DNA片段为模板进行第2轮复制后就可以形成产物1。识图分析可知，试管B中所需的下游大引物为产物1中的β链。 （3）基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。启动子是驱动目的基因转录的，为了使定点突变的干扰素基因能在哺乳动物乳腺细胞中特异性表达，在构建该基因表达载体时应将该基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，然后将该表达载体通过显微注射法导入哺乳动物的受精卵中。 23、（2024·福建宁德·三模）猴痘是由猴痘病毒引起的一种人畜共患病。研究发现其F3L蛋白可抑制宿主天然免疫。科研人员通过转基因技术，利用大肠杆菌表达F3L蛋白，进行猴痘病毒相关研究。    注：kanr为抗卡那霉素抗性基因；EcoRI、XhoI为酶切位点 回答下列问题： (1)PCR扩增F3L基因时，反应体系中添加的引物作用是 。 (2)将PCR扩增得到的含F3L基因的DNA片段与质粒都经双酶切，再用 将两者连接，构建F3L基因表达载体。研究表明蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，推测其影响部位是图1中 （填字母）。 (3)大肠杆菌用 处理，然后将基因表达载体导入其中，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有 的固体培养基。 (4)重组大肠杆菌在0.6mM IPTG浓度下培养，探究不同的温度、培养时间的优化方案。将其提取的蛋白质进行电泳，结果如图2，已知F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，请用方框在图2-乙中标出其所在位置 ，从图中可推测出培养重组菌的最适条件为 。    注：M为已知相对分子质量标准；ku为蛋白质相对分子质量 【答案】(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2) DNA连接酶（T4DNA连接酶、Ecoli DNA连接酶） P (3) Ca2+（CaCl2） 卡那霉素 (4)    12h、42℃ 【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。 2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，反应体系中添加的引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 （2）构建基因表达载体时，要先用限制酶切割含F3L基因的DNA片段及起载体作用的质粒，使它们有可以相互连接的相同末端，然后再用DNA连接酶（或T4DNA连接酶、Ecoli DNA连接酶）把两者连接起来。据图可知，在基因表达载体中，F3L基因由P侧顺时针向T侧表达。依题意，蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，因此推测，其影响部位是图1中P。 （3）用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。依题意，基因表达载体中含有抗卡那霉素抗性基因，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有卡那霉素的固体培养基养基。 （4）依题意，F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，则其在电泳图谱中的位置如图示：  。据图2甲图可知，12h培养时长对应的电泳条带最明显，推测培养重组菌的最适时长为 12h。据图2乙图可知，42℃的培养温度对应的电泳条带最明显，推测培养重组菌的最适温度为42℃。 24、（2024·福建福州·三模）为研究编码铁运输相关蛋白的基因A（约963bp）在拟南芥缺铁胁迫响应中的作用，需要构建超量表达A的拟南芥转基因株系。质粒的结构如图2所示。回答下列问题。    (1)图1中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经 催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，需要在引物的 端，加入限制酶 、 的识别序列。 (2)构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免 。 (3)将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是 。 (4)将拟南芥的 直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并将得到的种子接种在含有 （抗生素）的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 (5)提取转基因及野生型植株的蛋白质进行电泳检测，如图4。若其中 号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 【答案】(1) 逆转录酶 5’ BamHI Sa1I (2)目标片段与无关片段重新连接（目的基因自连以及质粒自连） (3)图3结果显示1、2的PCR产物长度与A基因相符。但无法确定pcr产物的碱基序列是否与A基因相同 (4) 花序 潮霉素 (5)① 【分析】基因工程的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）图1中，过程①指的是从拟南芥中提取RNA，经逆转录酶催化，合成cDNA；过程②指的是以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，防止限制酶识别序列在基因内部而导致目的基因被切割，需要在引物的5’端，由于KpnI会切割目的基因，再结合质粒上限制酶识别位点与T-DNA的位置关系可知，应加入限制酶BamHI、Sa1I的识别序列。 （2）构建表达载体时，将PCR产物与质粒分别双酶切后，先进行琼脂糖凝胶电泳，将目标片段与无关片段分离，从琼脂糖凝胶中只回收目标片段，再用DNA连接酶进行连接，以避免目标片段与无关片段重新连接（目的基因自连以及质粒自连）。 （3）将转化后得到的单克隆农杆菌进行PCR鉴定，如图3所示，选择“1、2”号菌进行测序的原因是图3结果显示1、2的PCR产物长度与A基因相符，但无法确定pcr产物的碱基序列是否与A基因相同。 （4）将拟南芥的花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，由于T-DNA上有潮霉素抗性基因，所以宿主细胞能够抗潮霉素，然后培养植株并将得到的种子接种在含有潮霉素的固体培养基上培养，以筛选出成功导入目的基因的阳性植株。 （5）由图4可知，①的目的蛋白含量明显多于②，若①号为转基因植株的蛋白质电泳结果，则说明成功构建超量表达A的拟南芥转基因株系。 25、（2024·福建·三模）乳糖不耐受是机体乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻。科学家采用基因工程技术将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组中，获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量大大降低，用到的质粒和目的基因的部分结构如图1和图2所示，不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：    限制酶 识别序列及切割位点 Hind Ⅲ A↓AGCTT Sma I CCC↓GGG Kpn I GGTAC↓C Sal I G↓TCGAC Nhe I G↓CTAGC    (1)用Sma I切割图1质粒后，能不能用E.Coli DNA连接酶再将其连接起来？ 。在构建基因表达载体时，与用一种限制酶切割相比，用切割后可以形成不同末端的两种限制酶同时切割目的基因和质粒的优点是 。 (2)为了将图2中的目的基因准确插入到图1质粒中，需要在肠乳糖酶基因的两端分别添加 （填限制酶）的识别序列。为保证肠乳糖酶基因的正确复制和与质粒的正确连接，在设计PCR引物时，应在与β链结合的引物的 （填“”或“”）端添加 （填限制酶）的识别序列。 (3)在构建基因表达载体时，肠乳糖酶基因应插入 之间。将含有肠乳糖酶基因的表达载体导入受体细胞的常用方法是 ，受体细胞除了受精卵、胚胎干细胞外，还可以是 ，受体细胞所含的性染色体必须是 。 (4)利用胚胎工程技术将导入目的基因的受体细胞培育成个体，采用分子杂交技术检测肠乳糖酶基因在转基因奶牛中是否转录出mRNA的大致思路为 。 【答案】(1) 不能 能够避免酶切后 的目的基因和质粒发生自身环化或错误连接 (2) KpnI、SmaI 5， Kpnl (3) 启动子和终止子 显微注射法 卵裂期的细胞 XX (4)用放射性同位素标记的肠乳糖酶基因片段作探针，与从转基因个体的乳腺细胞中提取的mRNA杂交，观察是否出现杂交带 【分析】引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】（1）据题表可知，SmaI切割后产生的是平末端，而E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，故用Sma I切割图1质粒后，不能用E.Coli DNA连接酶再将其连接起来。在构建基因表达载体时，与用一种限制酶切割相比，用酶切后可以形成不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因的优点是能避免酶切后的目的基因和质粒发生白身环化或错误连接。 （2）分析题图，选用HindⅢ会破坏质粒上的标记基因，选用SalI、NheI会破坏目的基因，因此只能选用KpnI、SmaI切割质粒，则需要在目的基因的两端分别添加KpnI、SmaI的识别序列。为保证目的基因的正确复制和与载体的正确连接，应在肠乳糖酶基因的左侧添加KpnI的识别序列，右侧添加Smal的识别序列，据此推导，应在与β链结合的引物的5'端添加Kpnl的识别序列，便于能从引物的3，端连接脱氧核苷酸。 （3）在构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是转录起始和终止的调控序列，在构建基因表达载体时，肠乳糖酶基因应插入启动子和终止子之间。将含有肠乳糖酶基因的表达载体导入受体细胞的常用方法是显微注射法，受体细胞除了受精卵、胚胎干细胞外，还可以是卵裂期的细胞，具有发育的全能性，受体细胞所含的性染色体必须是XX（雌性个体分泌乳汁）。 （4）检测目的基因是否在转基因个体的细胞中转录，可用放射性同位素标记的目的基因（肠乳糖酶基因）片段作探针，与从乳腺细胞中提取的mRNA进行杂交，若出现杂交带，则说明目的基因在转基因个体细胞中转录出了mRNA。 26、（2024·福建漳州·三模）类胡萝卜素因众多营养保健功能而具有很高的商业价值与应用前景。现研究人员通过构建含有β-胡萝卜素酮化酶基因bkt的表达载体，转化莱茵衣藻（一种真核绿藻）以提高其类胡萝卜素产量。请回答下列问题：    (1)为了同时保留衣藻内源性启动子H-R及终止子RBCS2，应选用限制酶 对质粒pUCBKT-P和pH105进行酶切，原因是 。再利用DNA连接酶将酶切下的基因片段连接成表达载体。 (2)可利用 （填技术）大量扩增bkt基因，该技术需要在添加 离子的缓冲液中扩增基因。若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是 。 (3)用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，所以要设计 的奇霉素进行实验，观察并确定 。 (4)以下是利用某两种限制酶进一步对提取的莱茵衣藻DNA进行单酶切和双酶切后的电泳结果。据此推测，提取的DNA总长度是 bp，两种限制酶切割位点之间的最短距离是 bp。    【答案】(1) Pamc Ⅰ和Xba Ⅰ 双酶切在保证目的基因的插入时还能避免目的基因自身环化和随意连接 (2) PCR 镁 引物较小，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段 (3) 不同浓度 菌落大小及透明圈大小 (4) 800 200 【分析】基因工程的基本工具包括限制酶、DNA连接酶和分子运输车。选择限制酶应不破坏目的基因和标记基因，尽可能保证目的基因正向插入，提高成功率。 【详解】（1）由图可知，为了同时保留衣藻内源性启动子H-R及终止子RBCS2，选择的限制酶切割位点应在启动子和终止子之间，同时双酶切在保证目的基因的插入时还能避免目的基因自身环化和随意连接，故限制酶选择为Pamc Ⅰ和Xba Ⅰ。 （2）可利用PCR大量扩增bkt基因，该技术需要在缓冲液中添加镁离子。若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是引物较小，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段。 （3）用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，需要设计不同浓度的奇霉素进行实验，观察并确定菌落大小及透明圈大小，以筛选出抗奇霉素的绿藻。 （4）用不同酶对DNA进行单酶切时，得到一条DNA片段，说明原DNA是环状DNA，且总长度为800bp，用酶Ⅰ和酶Ⅱ联合切割时，获得的DNA片段长度分别为600bp和200bp，故两种限制酶切割位点之间的最短距离是200bp。 27、（2024·福建泉州·三模）洋桔梗是一种观赏价值高的花卉植物，易受真菌侵害而造成经济损失。几丁质为多数真菌细胞壁主要成分，研究人员将菜豆几丁质酶基因（Chi）转入洋桔梗中，以获得对抗真菌侵染的品种。请回答：    (1)获取目的基因。从序列数据库（GenBank）中查找Chi序列后，还需从菜豆中提取 ，根据 设计引物，通过PCR获得目的基因。 (2)PCR 产物鉴定。将 PCR 扩增产物的序列与GenBank中的 Chi 序列进行比较的目的是 。 (3)构建表达载体并导入农杆菌。利用 限制酶切割PCR 产物和质粒pB I 121，并连接成表达载体 pB I 121-Chi（如图1）。将 pB I 121-Chi转入农杆菌中，将转化产物涂于选择培养基中进行筛选、培养。 (4)农杆菌转化洋桔梗愈伤组织。将洋桔梗愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡 10min，再将愈伤组织放入含卡那霉素的培养基中筛选、培养。将得到的抗性无根苗转移到生根培养基中诱导生根，其中培养基中生长素用量和细胞分裂素用量的比值 （填“=”、“>”或“<”）1。 (5)目的基因的检测及鉴定。 ①选择pB I 121-Chi中的npt Ⅱ进行分子水平的检测，以判断Chi是否表达。原因是（Ⅰ）洋桔梗细胞中存在与 Chi 序列相似的同源基因；（Ⅱ）pB Ⅰ 121-Chi 中的 np t Ⅱ和 Chi 在表达上是 。 ②取未转化植株和能够正常生根的抗性转化植株新长出的幼嫩叶片，提取基因组 DNA，进行PCR检测，获得阳性植株。从 5 个生长良好的阳性植株提取 mRNA，进一步利用PCR 检测，结果如图2.则应选择植株 （填序号）进行个体生物学水平鉴定即对这些植株进行 ，以确定获得抗真菌洋桔梗植株。    【答案】(1) CHi的RNA 目的基因（Chi）两端的碱基序列 (2)检测目的基因是否扩增成功 (3)BamHⅠ和XbaⅠ (4)＞ (5) 相互独立 1、2、5 用真菌感染这些植株，观察其是否患病 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）获取目的基因需要从菜豆中提取CHi的RNA，逆转录形成DNA，根据目的基因（Chi）两端的碱基序列设计引物，通过PCR获得目的基因。 （2）将 PCR 扩增产物的序列与GenBank中的 Chi 序列进行比较的目的是检测目的基因是否扩增成功。 （3）从图1看出，在表达载体 pB I 121-Chi中，Chi基因两端有限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的位点，所以应该是利用BamHⅠ和XbaⅠ限制酶切割PCR 产物和质粒pB I 121。 （4）生根培养基中生长素含量比细胞分裂素高，所以生长素用量和细胞分裂素用量的比值＞1。 （5）① np t Ⅱ具有卡拉霉素抗性，和 Chi 在表达上是相互独立的，所以即使该植株具有卡拉霉素抗性，但不一定含有Chi基因，因此需要进行分子水平鉴定。 ②从电泳图中看出，图中1、2和5植株检测到了相应的DNA片段，为转化植株，因此需要对这些植株进行个体水平上的鉴定，即用真菌感染这些植株，观察其是否患病。 28、（2024·江西南昌·三模）现有假单胞菌减毒活疫苗（Pp）和敲除了M基因的缺陷型假单胞菌减毒活疫苗（Pp－m），Pp只能预防白点病，研究者欲将外源抗原基因导入到Pp中表达，以构建能预防多种疾病的多联疫苗。已知含抗性基因的质粒存在安全性风险，现为获得无抗性基因但可通过其他方式达到筛选目的的质粒，并让该质粒携带抗原基因从而实现对多联疫苗的研制。 (1)图中是操作中使用的PBBR1质粒（kan⁺为卡那霉素抗性基因，该质粒上只有BamHI和SacⅠ限制酶识别位点）和M基因（M基因为假单胞菌在不含氨基酸的普通培养基上合成谷氨酸的必需基因），其中P1－P8为设计的引物；利用PCR技术扩增M基因，应选择 引物，利用PCR技术扩增不含卡那霉素抗性基因的PBBR1质粒并使其线性化时应选用 引物。 (2)图中右下方为供选择使用的限制酶及识别序列（箭头为限制酶的切割位点）。由于PBBR1质粒和M基因两端都没有相同的限制酶识别序列，应在设计上述两对引物时增加两种不同的限制酶识别序列，可选择 识别序列分别加在引物的5’端。 (3)利用上述PCR产物经相同的两种限制酶酶切和连接，将连接产物导入 （填Pp或Pp－m）中，将转化产物接种在 培养基上，挑选出能在培养基上生长的单菌落。 (4)提取上述菌落中的质粒，为防止抗原基因与质粒的反向连接，利用 限制酶处理质粒和抗原基因，将构建的重组质粒导入假单胞菌中以生产多联疫苗。 【答案】(1) P2、P3 P5、P8 (2)HIndⅢ和Kpn Ⅰ (3) Pp－m 不含氨基酸的普通 (4)Sac Ⅰ和BamH Ⅰ（或Sac Ⅰ和Sau3A Ⅰ） 【分析】构建基因表达载体时，需要先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同样的限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。选择限制酶时应注意：限制酶不能破坏目的基因的完整性；限制酶不能破坏载体上的启动子、终止子、复制原点等组件；若标记基因不止一个，至少保留一个标记基因不被破坏；常用两种产生不同末端的限制酶同时切割目的基因和载体，可以防止目的基因和载体自身环化或反向连接。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，与模板链的3'端结合，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，所以应选择P2、P3两种引物扩增M基因，扩增不含卡那霉素抗性基因的PBBR1质粒并使其线性化时应选用P5、P8两种引物。 （2）由于PBBR1质粒和M基因两端都没有相同的限制酶识别序列，应在设计上述两对引物时在引物的5'端加入限制酶识别序列，增加两种不同的限制酶识别序列，可选择HIndⅢ和Kpn Ⅰ。不能选择Sac Ⅰ和BamH Ⅰ，因为会破坏线性化的、不含卡那霉素抗性基因的PBBR1质粒；不能选择Sau3A Ⅰ，Sau3A Ⅰ能识别并切割BamH Ⅰ识别位点，所以也会破坏线性化的、不含卡那霉素抗性基因的PBBR1质粒。 （3）M基因为假单胞菌在不含氨基酸的普通培养基上合成谷氨酸的必需基因，Pp－m为敲除了M基因的缺陷型假单胞菌，所以Pp－m不能在不含氨基酸的培养基上生存。利用上述PCR产物经相同的两种限制酶酶切和连接，将连接产物导入Pp－m中，将转化产物接种在不含氨基酸的普通培养基上，未成功转化的Pp－m不能合成谷氨酸，无法生存；转化成功的Pp－m可以利用转入的M基因，在不含氨基酸的普通培养基上合成谷氨酸，能够正常生长，所以挑选出能在培养基上生长的单菌落即为转化成功的假单胞菌。 （4）提取上述菌落中的质粒，为防止抗原基因与质粒的反向连接，可以利用能产生两种不同黏性末端的限制酶同时切割抗原基因和质粒。可以利用Sac Ⅰ和BamH Ⅰ限制酶处理质粒和抗原基因，将构建的重组质粒导入假单胞菌中以生产多联疫苗。由于Sau3A Ⅰ能识别并切割BamH Ⅰ限制酶识别的序列，也可以选择Sac Ⅰ和Sau3A Ⅰ限制酶处理质粒和抗原基因。 29、（2024·山东潍坊·三模）L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺（丙烯酰胺的前体），而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。   (1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是 。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是 。 (2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是 （只写出16个碱基即可）。 (3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若只使用限制酶EcoRI构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现 色，这些菌落 （填“能”、“不能”或“不一定能”）产生L-天冬酰胺酶，理由是 。 ②若使用（1）中的限制酶处理，则菌落呈 色的为符合要求的宿主菌，理由是 。 (4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 EcoRI、KpnI (2)3′—TAAGTTGTCTCTTAAG—5′ (3) 白 不一定能 EcoRI切割目的基因和质粒两端的黏性末端相同，构建的重组质粒可能目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达 白 重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落呈白色 (4)大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对多肽链进行加工 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）引 物 是 一 小 段 能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于 PCR 的引物长度通常为20-30个核苷酸。引物的作用是：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。若用Pst Ⅰ或Bgl Ⅱ会破坏目的基因，若用BamH Ⅰ会破坏氨苄青霉素抗性基因。 若用EcoR Ⅰ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。 （2）获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′互补配对，同时，要在引物的5′添加EcoR Ⅰ的识别序列，因此B端的引物序列是3′—TAAGTTGTCTCTTAAG—5′。 （3）若用EcoR Ⅰ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落周围呈白色，但重组质粒可能目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此周围呈白色的菌落不一定能产生L-天冬酰胺酶。用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落周围呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。 （4）能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对多肽链进行加工，形成空间结构，因此，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶。 30、（2024山东省齐鲁名校第三次联合检测）羟基酪醇具有抗癌、抗炎、保护软骨和抗骨质疏松的作用，主要从橄榄植物的叶子和果实中提取，但提取周期长、回收率低。乙醇脱氢酶 6（ADH6）是酿酒酵母利用甘油合成高产羟基酪醇过程中的关键酶。科研人员利用基因工程技术将酿酒酵母的 ADH6  基因导入大肠杆菌中，以期获得高产羟基酯醇的转基因大肠杆菌。 (1)科研人员利用 PCR 技术获得大量的酿酒酵母 ADH6 基因，用该技术扩增目的基因前需要根据 来设计引物。PCR 每次循环一般可以分为 三步。 (2)利用含 ADH6 基因的 DNA 片段和质粒构建基因表达载体的过程中，应使用的酶主要有 。与天然质粒相比，作为载体的质粒的独特之处在于 。 (3)研究人员将构建的基因表达载体导入大肠杆菌，经筛选获得 5 株转基因大肠杆菌（HJ17~HJ21）。导入基因表达载体前，需要用 Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 。 (4)为比较 5 株转基因大肠杆菌的羟基酪醇的产生情况，研究人员进行了相关实验，结果如图。 由图可知，为提高羟基酪醇的生产效率，可选用 作为发酵生产的菌种，依据是 。 【答案】(1) 目的基因两端的核苷酸序列 变性、复性、延伸 (2) 限制酶和DNA连接酶 有特殊的标记基因 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 (4) HJ19 HJ19在24 h、 48 h、.72 h时羟基酪醇的产量均高于其他菌株 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）科研人员利用PCR技术获得大量的酿酒酵母ADH6基因，用该技术扩增目 的基因前需要根据目的基因两端的核苷酸序 列来制备一小段能与其互补配对的引物； PCR 每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 （2）利用限制酶（切割目的基因和运载体）和 DNA 连接酶（连接切割后的目的基因和运载体）将含ADH6基因的DNA片段 和质粒构建成基因表达载体；与天然质粒相 比，作为载体的质粒有特殊的标记基因，便于 重组 DNA分子的筛选。 （3）将构建的基因表达载体导入大肠杆菌前， 一般需要用Ca²+处理，使其处于一种能吸收 周围环境中DNA分子的生理状态。 （4）由图可知，5株转基因大肠杆菌中，HJ19 在 24 h、48 h、72h时羟基酪醇的产量均高于其他菌株，因此为提高羟基酪醇的生产效率， 可选用HJ19作为发酵生产的菌种。 31、（2024·湖北·三模）人溶菌酶（HLZ）是一种具有抑菌活性的蛋白质，在食品保鲜、抗菌消炎等方面广泛应用。为提高溶菌酶的产量，研究人员设计了利用基因工程高效生产溶菌酶的方案，流程如图所示。 回答下列问题： (1)溶菌酶能够破坏多种细菌的细胞壁，说明溶菌酶参与人体 （填“非特异性”或“特异性”）免疫，理由是 。 (2)提取出的HLZ基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对HLZ基因进行扩增时，应在所用两种引物的 端添加 识别序列，以实现HLZ基因与pPIC9K质粒的正向连接。过程①中将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。 (3)过程④中，每隔一段时间取1mL酵母发酵液，离心后取 （填“上清液”或“沉淀”）进行蛋白质凝胶电泳，得到结果如下图，已知HLZ的理论分子量约为16ku。结果显示本实验中HLZ酵母表达体系初步构建成功，判断依据是 。如需进一步确认该蛋白质为HLZ，可采取的措施为 。 注：M．蛋白Marker；1．空酵母培养48h；2．导入空质粒酵母培养48h；3～6．导入重组质粒酵母分别培养24h、48h、76h、96h。 【答案】(1) 非特异性 能够破坏多种细菌 (2) 5， Xho Ⅰ、Not Ⅰ 使重组质粒复制，得到大量重组质粒 (3) 上清液 出现目标条带 测定蛋白质的氨基酸序列或进行抗原-抗体杂交 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）溶菌酶能够破坏多种细菌的细胞壁，多种细菌说明是非特异性免疫。 （2）引物与模板链的3，端结合，游离的脱氧核苷酸加在引物的3，端进行子链的延伸，因此限制酶的序列加在5，端；为了防止自连及目的基因反接，常用两种酶进行酶切，两种酶的序列为Xho Ⅰ、Not Ⅰ；过程①中将重组质粒导入大肠杆菌，使其在大肠杆菌中快速复制，得到大量的重组质粒。 （3）蛋白质存在于上清液中，沉淀中为酵母菌；已知HLZ的理论分子量约为16ku，在图示中能看到16ku左右的条带，说明有蛋白质表达，表明HLZ酵母表达体系初步构建成功；如需进一步确认该蛋白质为HLZ，需要对蛋白质的氨基酸序列进行检测，或进行抗原-抗体杂交。 32、（2024·湖北襄阳·三模）丙肝病毒（HCV）是一种致病性强的单链RNA病毒，主要侵染肝细胞，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，也是肝硬化和肝癌的元凶之一。为研制丙肝病毒的单克隆抗体，研究者以小鼠为实验材料设计了以下实验。回答下列问题。 (1)在HCV感染的急性期，会引发机体的特异性免疫应答。在体液免疫过程中，B细胞活化、增殖分化过程需要两次信号刺激，一是抗原的直接刺激，二是 。B细胞受到两个信号的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，浆细胞产生和分泌大量抗体发挥免疫效应。抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是 。 (2)为使单细胞悬液中的B淋巴细胞产生的抗体中一定含有能与丙肝病毒结合的抗体，需要进行的操作是 ,图中筛选1所采用的培养基从用途上分类，属于 培养基，使用该培养基进行细胞培养的结果是 。 (3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，α-干扰素在丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。科学家们采用基因工程技术将干扰素基因导入大肠杆菌生产干扰素。图1、图2分别表示干扰素基因相关限制酶切割位点、质粒结构示意图。 ①为确保成功获得基因工程菌，图1和图2最好用 （填限制酶）切割。 ②PCR过程中延伸阶段选用72℃而非95℃，是综合考虑了两个因素，这两个因素分别是 。 ③生产干扰素的工程菌可选用大肠杆菌或酵母菌，选用酵母菌作为受体细胞的优势是 。 【答案】(1) 辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合 核糖体→内质网→囊泡→高尔基体→囊泡→细胞膜 (2) 给小鼠注射丙肝病毒使小鼠产生免疫反应 选择 只有杂交瘤细胞能正常生长，其他的细胞均不能生长 (3) BamHI和EcoRI 防止DNA变性和为保持耐高温的DNA聚合酶所需温度条件 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞，诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，进行克隆化培养和抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，注入小鼠腹腔中培养或者体外培养，最后从小鼠腹水或者培养液中获取单克隆抗体。单克隆抗体制备过程中至少涉及两次筛选，第一次是利用选择性培养基进行初步筛选出杂交瘤细胞，第二次是利用克隆化培养和抗体检测的方法筛选出既能大量增殖，又能产生所需抗体的杂交瘤细胞。 【详解】（1）病原体侵入机体后，一是抗原直接刺激B细胞，这为激活B细胞提供了第一个信号，其次抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞，辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这为激活B细胞提供了第二个信号。抗体属于分泌蛋白，分泌蛋白的合成、运输和分泌过程为：核糖体上合成蛋白质→内质网进行粗加工→内质网“出芽”形成囊泡→高尔基体进行再加工形成成熟的蛋白质→高尔基体“出芽”形成囊泡细胞膜，整个过程还需要线粒体提供能量。因此抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是：核糖体→内质网→囊泡→高尔基体→囊泡→细胞膜。 （2）用丙肝病毒（作为抗原）对小鼠进行免疫后，小鼠的B淋巴细胞能产生抗丙肝病毒的抗体，从该小鼠的脾细胞中能获得产生该抗体的B淋巴细胞。图中筛选1是用选择培养基筛选出经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞，因此筛选过程所采用的培养基属于选择培养基，在该培养基上只有杂交瘤细胞能正常生长，其他的细胞均不能生长。 （3）①干扰素基因和质粒上都有BamHI和EcoRI的酶切位点，为了防止反向连接和自身环化，故切割时两种限制酶一起使用，产生两种不同的黏性末端，确保成功获得基因工程菌。 ②DNA在高温条件下会解旋变性，且酶活性的发挥需要适宜条件，故延伸阶段选用72°C，主要是防止DNA变性和为保持TagDNA聚合酶所需温度条件。 ③基因工程利用大肠杆菌作为受体菌的优点是：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。 33、（2024·湖南永州·三模）镰刀菌、立枯丝核菌引起的水稻（2n=24）立枯病和褐飞虱引起的水稻虫害，常常造成水稻减产。某科研团队为培育抗褐飞虱、抗立枯病的水稻新品种，以对褐飞虱不具有抗性的连粳11号、龙粳39号、荃优822号三个纯合水稻品种为实验材料，进行了相关实验。回答下列问题： (1)为建立水稻基因组数据库，科学家须完成水稻 条染色体的DNA测序。 (2)连粳11号对镰刀菌表现为易感病，对立枯丝核菌表现为抗病，而龙粳39号则相反。水稻对镰刀菌和立枯丝核菌的抗性分别受非同源染色体上的A/a、B/b基因控制。连粳11号和龙粳39号杂交得到F1，F1自交得到F2，统计F2结果如下图所示。据图可知，连粳11号和龙粳39号的基因型分别为 ，F2中对两种菌均具有抗性的个体占 。请简要写出简便获得对两种菌均具有抗性的纯合子（标记为甲）方案 。 (3)该团队利用X射线对荃优822号水稻进行处理后，发现少数水稻（标记为乙）对褐飞虱产生了较高抗性。其5号染色体上某DNA区段与高抗虫性相关，对荃优822号的该区段设计重叠引物，提取乙和荃优822号的5号染色体DNA进行扩增，扩增产物的电泳结果如下图所示： 据图推测5号染色体上第 对引物对应区间的基因（标记为N基因）发生了碱基的 （填“增添”、“缺失”或“替换”）。 (4)研究者对N基因进行分离和克隆，以其作为目的基因与Ti质粒的 进行拼接，并运用农杆菌转化的方法导入到水稻甲的叶肉细胞中，经 获得转基因植株（标记为丙）， (5)对丙进行扩大培养，发现有部分丙植株体细胞中含有2个N基因，让其自交后得到可以稳定遗传的抗褐飞虱新品种丁。请参照图例在作答区域内标出丁植株细胞内N基因在染色体上可能的相对位置 （圆圈表示细胞，竖线表示染色体，圆点表示基因位点，字母表示基因）。 【答案】(1)12 (2) aabb、AABB 3/16 取F2中对两种菌均具有抗性的植株自交，选择子代不发生性状分离的植株即为纯合子 (3) 3 缺失 (4) T-DNA 植物组织培养 (5) 【分析】由组合定律的实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。适用范围：①适用两对或两对以上相对性状的遗传，并且非等位基因均位于不同对的同源染色体上。②非同源染色体上的非等位基因自由组合，发生在减数第一次分裂过程中，因此只有进行有性生殖的生物，才能出现基因的自由组合。③按遗传基本定律遗传的基因，均位于细胞核中的染色体上。 【详解】（1）为建立水稻基因组数据库，需要测序一个染色体组的全部染色体，因此科学家须完成水稻12条染色体的DNA测序。 （2）依据题干信息，水稻对镰刀菌和立枯丝核菌的抗性分别受非同源染色体上的A/a、B/b基因控制，且图示中显示镰刀菌抗性株：易感株3:1，说明抗性A对感性a为显性，立枯丝核菌抗性株：易感株1:3，说明易感株B对抗性株b为显性，由此可推知，连粳11号和龙粳39号的基因型分别为aabb、AABB，在F2中对两种菌均有抗性的基因型为A-bb，其中AAbb、Aabb，这些个体占比例为3/16。获得对两种菌均具有抗性的纯合子最简便的方法是直接取F2中对两种菌均具有抗性的植株自交， 选择子代不发生性状分离的植株即为纯合子AAbb。 （3）乙和荃优822号第3对引物对应区间的基因电泳条带位置不同并且突变体条带距点样孔更远，因此据图推测5号染色体上第3对引物对应区间的基因（标记为N基因）发生了碱基的增添。 （4）农杆菌细胞内含有Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，因此目的基因与Ti质粒的与T-DNA进行拼接，并运用农杆菌转化的方法导入到水稻甲的叶肉细胞中，再要得到个体需进行植物组织培养。 （5）丙植株体细胞中含有2个N基因，这2个N基因的位置可能位于同源染色体的非等位基因处、位于同源染色体的等位基因处、位于同一条染色体、位于非同源染色体上，因此丁植株细胞内N基因在染色体上可能的相对位置即如答案所示                                      34、（2024·湖南永州·三模）大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，部分结构如下图。在人体特定部位进行42℃处理后，p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达。据此回答下列问题：    (1)推测p7应为 （填“启动子”或“终止子”），其功能是 。 (2)Tel42为来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子，在大肠杆菌中具强活性的启动子pLac可以使Tel42持续性表达，当温度 （填“低于”、“等于”或“大于”）42℃时，Tcl42蛋白会抑制启动子pRL。 (3)质粒系统就像“基因电路”，其中的Tcl42基因就像“开关”，能在加热时瞬时激活特定基因。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型aPD-L1蛋白基因（该蛋白可用于免疫治疗）等。请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路”→ →重组酶Bxb1基因不表达→免疫元件无功能（不表达aPD-L1）→ →解除Tcl42蛋白对启动子pRL的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量aPD-L1。将下列选项代号填入上述横线，将“基因电路”补充完整。 A．受体菌37℃时 B．菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性 C．荧光蛋白GFP基因、aPD-L1基因的转录 D．重组酶Bxb1基因表达，进而引起p7两侧发生重组 (4)将“基因电路”质粒导入菌体前，科研人员用Ca2+处理大肠杆菌的作用是 。导入后的菌体用 方法接种于含四环素的培养基上，由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌。 (5)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌可被FUS处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。请以成瘤建模后的小鼠为材料，设计一个实验方案 。 【答案】(1) 启动子 RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因的转录 (2)低于 (3) A B D C (4) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 稀释涂布平板 (5)将成瘤建模后的小鼠随机均分为三组，甲组注射生理盐水，乙组、丙组注射温控工程菌。一段时间后甲、乙两组用FUS处理，丙组不做FUS处理，检测小鼠体内（肿瘤组织是否发出绿色荥光），并记录肿瘤体积变化 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）根据题意“p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达”，说明p7为启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因的转录。 （2）已知在人体特定部位进行42℃处理后，p7可在重组酶Bxb1作用下翻转，免疫元件中的GFP和aPD-L1两种基因可以成功表达，因此当温度低于42℃时，Tcl42蛋白会抑制启动子pRL。 （3）“基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题意，当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一个表达单位的重组酶Bxb1基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1基因不表达，则αPD-L1不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制，重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组，启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录。从而使细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，构建“基因电路” → A、受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL →重组酶Bxb1基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →B、菌体升温至42℃时，蛋白Tcl42失去活性→ 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→D、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组→C、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。 （4）科研人员用Ca2+处理大肠杆菌是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将“基因电路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可用稀释涂布平板法将导入后的菌体接种在含有四环素的培养基来筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落。 （5）依题意，该实验的目的是验证上述温控工程菌可被FUS处理激活，并具有肿瘤免疫治疗效果。因此可将成瘤建模后的小鼠随机均分为三组，甲组注射生理盐水，乙组、丙组注射温控工程菌。一段时间后甲、乙两组用FUS处理，丙组不做FUS处理，检测小鼠体内（肿瘤组织是否发出绿色荥光），并记录肿瘤体积变化。 35、（2024·湖南衡阳市祁东县·三模）动物细胞生物反应器旨在复现动物体内的生理条件，以便在实验室环境中进行有效的细胞培养。该系统特别适用于生产特定蛋白质，例如人乳铁蛋白。实验人员构建了人乳铁蛋白基因表达载体，然后将该重组载体导入奶牛体内以生产人乳铁蛋白，相关过程如图所示。回答下列问题：    (1)获取人乳铁蛋白基因是实施人乳铁蛋白动物细胞生物反应器工程的第一步。 ①实验人员提取了相关mRNA，通过逆转录获取cDNA，再通过PCR技术扩增人乳铁蛋白基因。在整个过程中，需要用到的原料是 。 ②实验人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因过程中，需要使用TaqDNA聚合酶，而不能使用普通的DNA聚合酶，其原因是 。 (2)图中标注了三种限制酶BamHI、HindⅢ、SmaI及其酶切位点，TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。据图分析，构建人乳铁蛋白基因表达载体时，应选择的两种限制酶是 ，同时，要将人乳铁蛋白基因导入启动子和 之间。 (3)将人乳铁蛋白基因表达载体导入供体牛受精卵后培养至早期胚胎，然后将早期胚胎移植到代孕牛体内。此过程中，一般不需要对代孕牛注射免疫抑制剂，这是因为 。 (4)为检测人乳铁蛋白基因是否在雌性转基因牛中表达，研究人员提取了A、B、C三头转基因牛的乳汁，从中提取了蛋白质，结果发现A、C两头转基因牛提取的乳汁中未检测到人乳铁蛋白，而B转基因牛提取的乳汁中检测到了人乳铁蛋白。该检测方法的原理是 。进一步提取A、C两头转基因牛的基因组DNA和mRNA进行检测，A转基因牛能检测到人乳铁蛋白基因，但不能检测到相关mRNA，C转基因牛则都不能检测到。以上两次检测结果说明了 。 【答案】(1) 四种脱氧核糖核苷酸 TaqDNA聚合酶耐高温 (2) BamHI、HindⅢ 终止子 (3)代孕牛和供体牛处于相同的生理状况，不会发生免疫排斥 (4) 抗原-抗体杂交 目的基因在不同的个体中基因的表达状况不同 【分析】根据题意和图示分析可知：图中质粒包括四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、启动子、复制原点，以及两个限制酶切点，并且两个限制酶切点的位置均在四环素抗性基因上；目的基因上有三个限制酶切点，与质粒对照，共有的是BamHⅠ、HindⅢ。图中①表示目的基因导入受体细胞，②表示通过胚胎移植的方式将早期胚胎移植到代孕母牛体内。 【详解】（1）①mRNA通过逆转录获取cDNA，通过PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，这两个过程都需要用到原料四种脱氧核糖核苷酸单体。 ②TaqDNA聚合酶，与普通的DNA聚合酶相比较，耐高温，PCR技术需要经过变性（90℃）、复性（50℃）和延伸（70℃）三个过程，所需要的温度条件均高于普通的DNA聚合酶的耐受温度，所以使用TaqDNA聚合酶。 （2）由于SmaI会破坏人乳铁蛋白基因，所以应使用BamHI、HindⅢ两种限制酶，构建基因表达载体，同时将人乳铁蛋白基因导入启动子和终止子之间。 （3）在胚胎移植过程中，通常使用孕激素对供体和受体牛进行同期发情处理，所以代孕牛和供体牛处于相同的生理状况，不会发生免疫排斥，所以一般不使用免疫抑制剂对代孕牛进行注射。 （4）对人乳铁蛋白的检测方法的原理是抗原抗体杂交，进一步检测A、C牛，根据其检测结果与B牛相比较，可知，导入的目的基因在不同的个体中基因的表达状况不同。 36、（2024·广东茂名·三模）在DNA体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322质粒构建基因表达载体，然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题：   (1)已知限制酶PstI和BamHI识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，图1中，若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶 （填“PstI或”“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是 。 (2)在某次实际操作中，实验人员将外源DNA片段插入pBR322的BamHI切割位点处，构建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2所示的实验。   ①结合图2阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是 。该培养基中添加了氨苄青霉素（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒，这是由于 。 ②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2阶段二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含 （填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是 。 【答案】(1) PstI PstI和BamHI切割DNA分子产生的末端不能互补，若选择BamHI切割pBR322，则无法与PstI切割的外源DNA片段相互连接 (2) 稀释涂布平板法 pBR322和外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322或外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性 Amp 限制酶BamHI破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶PstI，不选择另外一种限制酶的理由是PstI和BamHI切割DNA分子产生的末端不能互补，若选择BamHI切割pBR322，则无法与PstI切割的外源DNA片段相互连接。 （2）①图示中培养基上菌落分布均匀，因此将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是稀释涂布平板法。由于pBR322（空载质粒）和含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322（空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性，因此在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒。 ②由于限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长，所以导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含Amp的培养基上获取。 37、（2024·广东·三模）某两性花植物花小不易进行杂交育种工作。已知雄性可育基因对雄性不育基因为显性。某科研团队利用基因工程将育性恢复基因A、花粉致死基因B、绿色荧光蛋白基因C连锁成为一个A-B-C基因并导入雄性不育个体的一条染色体上，获得育性恢复植株甲。雄性不育植株雄蕊发育不正常，但雌蕊正常。使用无缝克隆技术可将A、B、C基因连接成DNA片段，其机理如图。回答下列问题： (1)基因工程需要使用的工具酶有 ，后者主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键。与用单酶切割目的基因与载体相比，双酶切割法的优点是 。 (2)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，其目的是 。与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有 （写出2点即可）。 (3)甲植株自交得F1，F1中雄性不育植株所占比例为 。 (4)假设雄性可育植株与育性恢复植株、不育植株可区分。请利用雄性可育纯合植株、甲植株和荧光检测仪，设计杂交实验，探究导入的A-B-C基因是否与雄性不育基因在同一条染色体上（不考虑互换，不用具体描述荧光检测过程）。实验设计方案：甲植株作为母本与雄性可育纯合植株杂交，F1中通过荧光检测仪检测并选取有荧光的雄性可育植株进行自交，观察并统计F2中的表型及比例。预期结果：①若有荧光雄性可育植株：有荧光育性恢复植株：无荧光雄性可育植株：无荧光雄性不育植株的比例为3：1：3：1，则 ；②若 。 【答案】(1) 限制酶和DNA连接酶 双酶切割法可防止载体和目的基因自身环化，保证目的基因和载体定向连接，从而提高重组率 (2) 形成黏性末端 不受限制酶酶切位点的限制；不会引入多余碱基，不会出现移码突变；操作相对简单，成功率高 (3)1/2 (4) 导入的A-B-C基因与雄性不育基因不在同一条染色体上 有荧光雄性可育植株：无荧光雄性可育植株=1：1，则导入的A-B-C基因与雄性不育基因在同一条染色体上 【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）基因工程需要使用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键。单酶切会出现载体和目的基因自身环化和目的基因和载体的反向连接问题，但双酶切割法可防止载体和目的基因自身环化，保证目的基因和载体定向连接，从而提高重组率。 （2）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，操作时间短，成功率高。 （3）假设雄性可育基因与不育基因为D/d，甲植株的基因型是A_B_Cdd，分别产生A_B_Cd和d两种配子，比例为1：1，产生正常的雄配子只有d，自交得到的F1的基因组成及比例为A_B_Cdd：dd=1：1，即雄性不育植株占1/2。 （4）甲植株基因型为A_B_Cdd与雄性可育植株DD杂交，F1的基因型为A_B_CDd和Dd两种类型，表型为有荧光雄性可育植株和无荧光雄性可育植株两种，选择有荧光雄性可育植株自交，观察并统计F2中的表型及比例。若有荧光雄性可育植株：有荧光育性恢复植株：无荧光雄性可育植株：无荧光雄性不育植株的比例为3：1：3：1，则导入的A_B_C基因与雄性不育基因不在同一条染色体上；若有荧光雄性可育植株：无荧光雄性可育植株=1：1（或F2均为雄性可育植株，有荧光：无荧光=1：1），则导入的A_B_C基因与雄性不育基因在同一条染色体上。 38、（2024·海南·琼海市嘉积中学高三三模）研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①~⑥为不同过程，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知识，回答下列问题： (1)不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是 。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择SmaⅠ和PstⅠ比只选择PstⅠ的优点是 （答出两点）。 (2)研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb的DNA片段，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb的DNA片段；SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb的DNA片段（注意：DNA片段大小与图中所画比例一致），则抗盐碱基因的长度为 。 (3)利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，对两种引物的设计要求之一是 ；除引物外，PCR反应体系中还需要加入 （答出两点）。 (4)将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti质粒中。利用Ti质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是 。 (5)为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基中需要加入的物质是 。诱导组织细胞脱分化的是 号培养基。图中④⑤⑥过程，所利用的生物技术的理论基础是 。 【答案】(1) 限制酶AluⅠ切割会破坏抗盐碱基因 防止目的基因和质粒反向连接；防止目的基因、质粒自身环化 (2)2.4kb (3) 两种引物之间不能碱基互补配对 模板、dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液等 (4)农杆菌中Ti质粒上的T-DNA能转移并整合至植物细胞染色体DNA上 (5) 氨苄青霉素 3 植物细胞具有全能性 【分析】据图分析，图示为利用基因工程和细胞工程培育出抗盐碱大豆的过程，其中①表示构建基因表达载体；②表示将目的基因导入农杆菌细胞；③表示筛选含有目的基因的农杆菌；④表示脱分化形成愈伤组织的过程；⑤⑥表示幼苗培育成成体的过程。 【详解】（1）据图可知，抗盐碱基因中包含了AluⅠ限制酶识别序列，若用限制酶AluⅠ切割则会破坏抗盐碱基因；选择Sma I和Pst I两种限制酶分别切割抗盐碱基因和质粒，抗盐碱基因与质粒各自能形成不能互补配对的两个黏性末端，同时抗盐碱基因与质粒之间的黏性末端又能互补配对，相比只选择PstⅠ一种酶进行切割的优点是可防止目的基因和质粒反向连接、防止目的基因、质粒自身环化。 （2）研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb的DNA片段，可知原质粒的长度为7.7kb，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb的DNA片段，可知重组质粒的长度为7.8kb，重组质粒是用SmaⅠ和PstⅠ酶切后构建而来，且DNA片段大小与图中所画比例一致，已知SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb的DNA片段，故抗盐碱基因替换了原质粒中2.3kb的DNA片段，故抗盐碱基因的长度为7.8-5.4=2.4kb。 （3）利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，对两种引物的设计要求之一是两种引物之间不能碱基互补配对，以防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率；PCR反应体系中除引物外，还包括模板、dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液等。 （4）Ti质粒上的T-DNA具有可转移的特性，当农杆菌侵染大豆愈伤组织细胞时，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA包括插入其中的目的基因可转移并整合至受体细胞染色体DNA上。 （5）据图分析，质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故含重组质粒的农杆菌具有抗氨苄青霉素的特性，所以为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入氨苄青霉素；外植体经脱分化可形成愈伤组织，据图分析，3号培养基可诱导组织细胞脱分化形成愈伤组织；图中④⑤⑥过程，为植物的组织培养技术，所利用的理论基础是植物细胞具有全能性。 39、（2024·广西玉林·三模）Ti质粒上有vir区和T-DNA区，vir区决定T-DNA的转移。研究人员将vir区和T-DNA区分离，开发了包括微型Ti质粒和辅助Ti质粒的双元载体系统。利用该系统，将抗草甘膦基因（cp）导入大豆中，培育抗除草剂（草甘膦）的转基因大豆。回答下列问题： (1)双酶切可将cp基因以正确方向插入微型Ti质粒。已知cp基因的a链为转录的模板链，则引物1和引物2的5'端应分别加入 酶和 酶的酶切位点。 (2)目的基因表达载体过大时难以操作，转化效率较低。研究人员在构建微型Ti质粒时删除了生长素基因和细胞分裂素基因，这样做的优点是 （答出2点）。T-DNA从农杆菌转移到植物细胞中时始于右边界止于左边界，在T-DNA的转移过程中会出现不完整转移现象，若以绿色荧光蛋白基因（GFP）作报告基因研究T-DNA的转移，则GFP应构建在紧临 （填“左”或“右”）边界的位置。 (3)将微型Ti质粒上重组了cp基因的农杆菌与含辅助Ti质粒的农杆菌混合，一定温度下保温一段时间，得到含双元载体的农杆菌。在含双元载体的农杆菌中，辅助Ti质粒的作用是 。 (4)用含有cp基因表达载体的农杆菌侵染大豆愈伤组织，筛选出转cp基因的愈伤组织。诱导愈伤组织形成试管苗的过程，在植物组织培养中叫 阶段。此阶段需要更换新的培养基，是因为 。 【答案】(1) PstI EcoRI (2) 微型Ti质粒较小，容易操作；易于转化（提高质粒的转化率） 右 (3)协助微型Ti质粒上的T-DNA进行转移 (4) 再分化 诱导形成愈伤组织和诱导芽和根形成的生长素和细胞分裂素的比例不同 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶、基因的载体。基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1） 在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，因此在设计引物时，需在引物的5'端加入相应的酶切位点。因cp基因（目的基因）中含有XhoI，引物的酶切位点不能为XhoI，a链为转录的模板链，由于基因转录方向从模板3'到5'，由此可以推测cp基因（目的基因）的转录是从其右侧开始的，即该链在启动子后的方向应为3'→5'，因此，引物2应位于cp基因（目的基因）的上游，其上应构建EcoRI的酶切位点；引物应1位于cp基因（目的基因）的下游，其上应构建PstI的酶切位点。 （2）目的基因表达载体过大时难以操作，转化效率较低，因此在构建微型Ti质粒，删除了生长素基因和细胞分裂素基因，可以使微型Ti质粒较小，容易操作，且易于转化到受体细胞中，提高其转化效率。T-DNA从农杆菌转移到植物细胞中时始于右边界止于左边界，即T-DNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并整合到染色体上，且在T-DNA的转移过程中会出现不完整转移现象，即可能出现右边界被剪切，而左边界未被剪切的现象。若以绿色荧光蛋白基因（GFP）作报告基因研究T-DNA的转移，则GFP应构建在紧临右边界的位置，一旦T-DNA发生转移，绿色荧光蛋白便不能发挥作用。 （3）由图可知，辅助Ti质粒中含有vir区，vir区决定T-DNA的转移，在含双元载体的农杆菌中，辅助Ti质粒的作用是协助微型Ti质粒上的T-DNA进行转移。 （4）诱导愈伤组织形成试管苗的过程，在植物组织培养中叫再分化，由于诱导形成愈伤组织和诱导芽和根形成的生长素和细胞分裂素的比例不同，故此阶段需要更换新的培养基。 40、（2024·广西柳州·三模）γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA的工程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。请回答下列问题：    (1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是 。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA，表明基因与性状的关系是 。 (2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是 ，这在实践中的优势是 。 (3)在进行步骤②之前，需对gadB基因进行扩增以提高获得重组质粒的概率。现在常用的快速扩增技术是PCR，扩增过程使用的DNA聚合酶具有的特点是 ，扩增过程中的使用的引物 （填“可”或“不可”）重复利用。 (4)为筛选出含重组质粒的大肠杆菌，应在添加 的选择培养基上培养；培养后获得的菌落却不能判定是否含有重组质粒，理由是 。进一步检测成功转化的GABA高产大肠杆菌，可通过检测 获得（写出2个检测指标）。 【答案】(1) 繁殖速度快、细胞结构简单、遗传物质相对较少 基因通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物的性状 (2) NcoⅠ和KpnⅠ 不同种限制酶处理可防止质粒自身环化，避免目的基因反向连接入质粒 (3) 耐高温 不可 (4) 氨苄青霉素 含未重组质粒的大肠杆菌也能在该选择培养基上正常生长 是否翻译出GadB、单位时间GABA产量 【分析】基因工程技术的基本步骤: （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、基因对性状的控制：基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状。基因还可以通过控制酶的合成控制细胞代谢，从而控制生物体的性状。 【详解】（1）大肠杆菌作为工程菌有诸多优点，如繁殖速度快、细胞结构简单、遗传物质少、易于培养等。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA（不是蛋白质），说明基因可以通过控制酶的合成控制细胞代谢，从而控制生物体的性状。 （2）如图，用两种不同的限制酶NcoⅠ和KpnⅠ切割质粒，产生不同的粘性末端，可以防止质粒自身环化，避免目的基因反向连接入质粒。 （3）PCR过程中使用的是耐高温的TaqDNA聚合酶，引物已经进入新形成的DNA分子中，因此引物不可重复利用。 （4）重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，导入重组质粒的大肠杆菌就有氨苄青霉素抗性，因此可以用含氨苄青霉素的选择培养基来筛选。含有未重组质粒的大肠杆菌对氨苄青霉素也有抗性，也能在选择培养基上正常生长。进一步检测成功转化的GABA高产大肠杆，可以通过检测单位时间内单位时间GABA产量或者检是否翻译出表达产物GadB。 41、（2024·贵州毕节·三模）二十碳五烯酸（EPA）能促进体内饱和脂肪酸代谢，是人体自身不能直接从头合成但又不可缺少的营养物质。研究人员利用转基因技术从海洋细菌中提取了EPA合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增pfaB基因时，需要选用图1中的引物 （填序号），引物的作用是 。 (2)图2所示的两种引物中，引物 设计不合理。若将pfaB基因扩增n次，共需要引物 个。 (3)构建基因表达载体时，为使pfaB基因成功表达，应将其插入载体的 之间。 【答案】(1) ②③ 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) Ⅰ 2n＋1-2 (3)启动子和终止子 【分析】PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）利用PCR技术扩增pfaB基因时，需要选用图1中的引物②和③，因为引物②和③的3'端序列与pfaB基因的两端序列互补，能作为DNA聚合酶的结合位点，从而启动DNA的合成。引物的作用是作为DNA聚合酶的结合位点，启动DNA的合成。 （2）图2所示的两种引物中，引物Ⅰ设计不合理，因为引物Ⅰ折叠后会发生碱基互补配对形成“发夹”结构。若将pfaB基因扩增n次，共需引物2n+1-2个。 （3）构建基因表达载体时，为使pfaB基因成功表达，应将其插入载体的启动子和终止子之间，因为启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录过程，终止子能终止转录过程。 42、（2024·贵州·三模）在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生产植物疫苗时存在的问题之一。研究表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人员拟构建含有两个35s启动子（35s启动子是花椰菜花叶病毒的一种强启动子）串联的转基因苜蓿。一个35s启动子包括1个A区和2个B区。图甲表示35s启动子及其附近区域分布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待转入第二个35s启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。 (1)利用PCR技术可以扩增35s启动子，PCR技术的原理是 ，此技术设计引物很关键，引物是 。利用此技术扩增的35s启动子可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物。 (2)根据限制酶识别位点，为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择 限制酶切割图甲的DNA片段。 (3)为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是 、 ，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能 。 平板类型 ① ② ③ 甲：无抗生素 + + + 乙：卡那霉素 - - + 丙：？ - + + 丁：？ - - + 【答案】(1) DNA半保留复制（和DNA的热变性） 一 小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 琼脂糖凝胶电泳 (2)Xba I和Hind III (3) 氨苄青霉素 卡那霉素和氨苄青霉素 ② 增强外源基因（目的基因）的表达 【分析】1、基因工程主要利用到三个工具：准确切割DNA分子的“分子手术刀”——限制酶、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”——DNA连接酶、将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”——载体。基因工程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】（1）PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术；PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR过程需要引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。PCR扩增完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 （2）构建表达载体时，应将35s启动子插入质粒的T-DNA区域，这样才能将目的基因随T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，所以不能选择Sal I限制酶；限制酶不能破坏35s启动子的完整性，所以不能选择BamH I；为了防止限制酶切割后35s启动子和质粒自身环化及反应连接，常选用两种不同的限制酶同时切割35s启动子和质粒，所以不选EcoR I。综上：为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选用Xba I和Hind III两种限制酶切割图甲的DNA片段。 （3）构建表达载体的成功率达不到100%，所以得到的质粒有些是含有35s启动子的重组质粒，有些是不含35s启动子的质粒，在将目的基因导入受体细胞时，可能得到三种类型的细胞：未导入质粒的农杆菌、导入了不含35s启动子的质粒的农杆菌、导入了含有35s启动子的重组质粒的农杆菌。未导入质粒的农杆菌不能在含有抗生素的培养基上生长；导入了不含35s启动子的质粒的农杆菌能在含有卡那霉素和氨苄青霉素的培养基上生长；导入了含有35s启动子的重组质粒的农杆菌由于质粒上的卡那霉素抗性基因被限制酶Xba I切割后破坏，能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含有卡那霉素的培养基上生长。为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是氨苄青霉素、卡那霉素和氨苄青霉素。①只能在不含抗生素的培养基上生长，是未导入质粒的农杆菌；②能在含有氨苄青霉素的培养基上生长且不能在含有卡那霉素的培养基上生长，是导入了含有35s启动子的重组质粒的农杆菌；③在不含抗生素和含氨苄青霉素、卡那霉素的培养基中都能存活，为导入了不含35s启动子的质粒的农杆菌，所以应选择的菌落是②。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能增强外源基因（目的基因）的表达。 43、（2024·甘肃张掖·三模）γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、治疗神经损伤、生产可降解材料等方面有广泛应用，高效制备GABA是目前国内外的研究热点。科研人员运用基因工程技术构建重组表达载体（如图所示），将其成功导入大肠杆菌获得能生产GABA的工程菌。该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA。回答下列问题。    (1)在基因工程操作中，大肠杆菌是运用最广泛的工程菌，原因是 。 (2)由图可知，步骤①用于切割质粒的限制酶是 ，这在实践中的优势是 。 (3)在进行步骤②之前，需对gadB基因进行PCR扩增以提高获得重组质粒的概率，需加入 种引物和 酶，扩增过程中使用的引物 （填“可”或“不可”）重复利用。 (4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛选出转基因工程菌。 (5)将成功转化的大肠杆菌进行发酵培养，发酵罐内的原料应富含 ，酸碱度要求是调至 。一段时间后，检测GABA的含量。 【答案】(1)繁殖速度快、细胞结构简单、遗传物质相对较少 (2) NcoⅠ和KpnⅠ 不同种限制酶处理可防止质粒自身环化，避免目的基因反向连接入质粒 (3) 2 TaqDNA聚合酶 不可 (4) CaCl2 含氨苄青霉素 (5) L-谷氨酸 中性或弱碱性 【分析】基因工程技术的基本步骤: （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+转化法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、基因对性状的控制：基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状。基因还可以通过控制酶的合成控制细胞代谢，从而控制生物体的性状。 【详解】（1）大肠杆菌作为工程菌有诸多优点，如繁殖速度快、细胞结构简单、遗传物质少、易于培养等。 （2）如图，用两种不同的限制酶NcoⅠ和KpnⅠ切割质粒，产生不同的粘性末端，可以防止质粒自身环化，避免目的基因反向连接入质粒。 （3）PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。PCR过程中使用的是耐高温的TaqDNA聚合酶，引物已经进入新形成的DNA分子中，因此引物不可重复利用。 （4）将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，故可将重组质粒导入到用CaCl2处理的大肠杆菌中完成转化；结合图示可知，重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，导入重组质粒的大肠杆菌就有氨苄青霉素抗性，因此可以用含氨苄青霉素的选择培养基来筛选。 （5）该菌利用目的基因表达产物GadB，催化L-谷氨酸脱羧大量合成GABA，即将成功转化的大肠杆菌进行发酵培养，发酵罐内的原料应富含L-谷氨酸，大肠杆菌是细菌，其培养环境的pH应调整至中性或弱碱性。 44、（2024·甘肃白银·三模）随着抗生素需求的增加，利用基因工程从微生物中获得抗生素已成为生产抗生素的一种重要途径。某实验室欲利用大肠杆菌获得抗体，图1表示该抗体基因及部分碱基序列，图2表示质粒及限制酶的切割位点，图3表示不同限制酶的识别序列，其中AmpR、KanR分别为氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。回答下列问题： (1)限制酶作用于DNA分子的 键，其切割DNA后可产生 和平末端。 (2)将图1中抗体基因与图2中质粒结合的过程称为 ，结合过程中使用的限制酶是 。将目的基因导入受体细胞后，可在培养基中加入 （填“氨苄青霉素”或“卡那霉素”）对目的细胞进行筛选。 (3)与从实验室常用小鼠中获得的抗体不同，从大肠杆菌中获得的抗体在结构上较为简单，原因最可能是 。 【答案】(1) 磷酸二酯 黏性末端 (2) 基因表达载体的构建 BlgⅡ、NotⅠ 卡那霉素 (3)大肠杆菌中不含内质网、高尔基体，从大肠杆菌中获得的抗体没有经过两者的加工 【分析】1、基因工程的操作工具是DNA连接酶、限制酶和载体。 2、基因工程的操作步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）限制酶作用于DNA分子的磷酸二酯键，切割DNA后可产生黏性末端和平末端，平末端只能用T4DNA连接酶进行连接。 （2）将图1中抗体基因与图2中质粒结合的过程称为基因表达载体的构建，由图可知，抗体基因两侧具有已知的黏性末端，因此需使用限制酶Blg Ⅱ、Not Ⅰ切割质粒，使其具有与抗体基因两侧相同的黏性末端，才能保证目的基因和质粒的正确连接。基因表达载体构建时，会破坏AmpR基因，因此只有kanR可做标记基因，则需在培养基中加入卡那霉素对目的细胞进行筛选。 （3）大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等，大肠杆菌中获得的抗体没有经过两者的加工，因此从大肠杆菌中获得的抗体在结构上较为简单。 ( 2 )原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！ 学科网（北京）股份有限公司 $$