2025届高三生物一轮复习导学案：基因工程的基本工具和基本操作程序

基因工程的基本工具和基本操作程序导学案 复习目标： (1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶 和载体三种基本工具。 (2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基 因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴 定等步骤。 (3)DNA的粗提取与鉴定实验。 (4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用 软件进行虚拟PCR实验。 一、重组DNA技术的基本工具 1.基因工程概述 DNA分 操作 与杂交育种相比 子水平 水平 原理体因重组 创造出更符 基因工程 按照 通 合人们需要 等技术，赋 的新的 目的 手段 予生物新的遗传特性 和一 与诱变霸 种相比 克服远缘杂交不亲利 生物体外一 操作 优点的障碍，定向改造生物 环境 的 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶（也称“限制酶”） 来源)一主要存在于原核生物中 专一性 识别双链DNA分子的特定 特点 ,并使每一条链中特定部位的 断开 结果 一产生 或平末端 (2)DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 种类 ◆T4DNA连接酶 大肠杆菌◆米源 →T4噬菌体 只“缝合” 特点 黏性末端和平末端都可 “缝合” 作用 连接头率较低“ 将双链DNA片段缝合起 来。恢复被 切开 的两个脱氧核苷酸之间 的磷酸二酯超 (3)载体 质粒（常用载体，双链环状DNA分子、，动 植物病毒等 ①能自我复制，或整合到 同步复制 特 ②有一个至多个 供外源DNA片 断（基因）插入其中 ③常有特殊的 基因，便于重组DNA分子的 筛选 携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞 用 内对目的基因进行复制和表达 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 (1) 获取 利用PCR获取和扩增 目的基因、通过构建 来获取目的 方法 基因 (2)利用PCR获取和扩增目的基因 (原理)一DNA半保留复制 定的经神液、DNA摸板、2种 .4种 条件 和 的DNA聚合砖 通过控制 使DNA复制在体外反复进行 仪器 PCR扩增仪 当温度超过90℃时，双链DNA 解聚为单链 变性 工 不需解凌终！州热至90℃以上 3'TTTTTTT-5'5TTTTTTTT31 温度下降到50℃左右时 通过诚基互补配对与两条单链DNA 复性 结合 2gT'5m3T号 引物1 引物Ⅱ 方向邮是从端到” 当温度上升到72℃左右时，溶液中 的4种脱氧核苷酸在 的作用下，根据戴基互补配 纸伸 。对原则合成新的DNA链 3T工g:T山叮g} 引物I 引物Ⅱ (结果-量 扩增 (鉴定-采用」 来鉴定PCR的产物 2基因表达载体的构建—核心 使目的基因在 中稳定存在.并且遗传 给下一代：同时使目的基因能够表达和发探作用 是一段有特 是一段有特 殊序列结构 味序列结树 的DNA片段 的DNA片 位于目的基 此处A·丁舍量高 段.位于目 因的上游，是 G-C合量低 的基因的 下游，是 组 识别和结合 名动子基因 甘的 RNA聚合 的部位.能驱 表达载体 晦脱离的 动基因转录 复制 部位，使转 出mRNA 原点 标记 基因 录过停止 作州为鉴别 从而将含有目的基因的细胞箭选出来 限制酵切制位点 复制原友是冀体卫WA复制的起始 若复刺原点旋环。则体 启动子终止子 年不能复利 复 日的基因 质粒 限制裤切应插入 制位点 名动子 限制酶 和山 子三间 获取目的基因 DNA 连接酶 重组 DNA 分子 考起两曲相连，别DNA连接动连接DMA片投会出现 三种情况日的长因与日的基因的连接，日的基因与 盾位的连赣，盾拉与质性的连接，需海流出业如腐轻 提醒：启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别 位置 作用 RNA聚合酶识别和 位于DNA分子上《启动子)结合位点，启动转痕 过程 起始 位于mRNA分子上《 决定朝译的开始 密码子 位于DNA分于上终止子) 决定转录的站束 位于mRNA分子上《 终上 决定朝译的站来 器码子 3.将目的基因导入受体细胞 只有该步骤没涉及碱基互补配对原则 受体 导入 内容 细胞 方法 ①用微量注射器将含 的 DNA溶液直接注入 中 花粉管②植物受粉后，剪去柱头，将DNA 通道法 溶液滴在花柱切面上，使甘的基 植物 因借助花粉管通道进入胚囊 细胞 农杆菌 农杆菌细胞内的T质粒上的 转化法 一可携带甘的基因整合到受体细胞的 动物 细胞 技术 一一常用受体细胞： 用Ca*处理细胞，使细胞处于一种 原核 Ca2+处 细胞 理法 一能吸收周围环境中DNA分子的生 理状态 4.目的基因的检测与鉴定 染色体DNA上是否插 等技术]入了目的基因或检测 目的基因是否转录出 分子水平 了mRNA 的检测 目的基因是否翻译成 技术 蛋白质 个体生物学 抗虫、抗病接种实验等 水平的鉴定 成功与否的最终鉴定标准 三、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA的粗提取与鉴定 DNA 酒精，但某些 初步分离DNA 蛋白质溶于酒精 和蛋白质 (1】 DNA能溶于物质的量浓度 为 的NaCI溶液 ◆溶解DNA 在一定温度下，DNA遇 试剂呈现蓝色 鉴定DNA (2)方法步骤 研磨材料 新鲜洋葱.加 液充分研磨 浅液中可能会有DNA,RNA以发蛋白盾， 影质、稻美 获取含DNA 的滤液 过滤（纱布）、提取滤波：或离心取 在上清渡中加入体积相等的、衡冷的 DNA的析出 体积分数为的酒精溶液，静置 2~3min后州玻璃棒沿 搅拌。 卷起白色丝状物：或离心取沉淀物 将丝状物或沉淀物溶解在 的 溶解DNA NaCI溶液中 在溶有DNA的溶液中加入 试剂. DNA的鉴定 混合均匀后将试管在沸水中加热 溶液变成 冷抑后观察 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 →每次循环可分为变性。复注和延伸三步 PCR 双链 加热，双螺旋结构解体单链 原理 DNA 级授冷却，分离的DNA链又DNA 重新结合 DNA分子具有 的基团，在一定的 pH下，这些基团可以带上正电荷或负电 电泳 荷。在电场的作用下，这些带电分子会 向着与它所带电荷 的电极移动，这 个过程就是电泳。 PCR的产物一般通过 鉴定 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率 与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。 (2)PCR实验操作步骤 用 按照配方或PCR试剂盒的说 加样 明书，向微量离心管中依次加入各组分，盖 严 的盖子 将微量离心管放在离心机里，离心约10s, 离心 使反应液集中在管的 反应 将装有反应液的微量离心管放在 中 设置好PCR仪的循环程序进行反应 (3)电泳鉴定凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 的 紫外灯下被检测出来。 ①成功扩增出DNA片段的判断依据是 ②进行电泳鉴定的结果应该是 条条带。如图所示，该片段大 小约为 bpo pM123457812 四、练习巩固 1.构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的 DNA片段和载体。 己知限制性内切核酸酶I的识别序列和切点是GGATCC--,限制性内切 核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是GATC-, 根据图示分析回答下列问题： GGATCC GATC CCTAGG CTAG 青霉素 四环素 抗性基因 抗性基因 GGATCC 目的基因 GATC CCTAGG CTAG (1)请用图示法写出限制性内切核酸酶I和限制性内切核酸酶Ⅱ切割 后形成黏性末端的过程。 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。 2.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注 了部分碱基序列)都不合理（如图），请分别说明理由。 第1组引物 (引物I CAGGCT 引物Ⅱ AGCCTG 引物I' 第2组引物 AACTG 引物：。 CAGTT CGACT GATTA ①第1组： ②第2组： 3.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引 物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？ 答案： 一、1.生物类型生物产品人们的愿望转基因遗传性状 2.(1)脱氧核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端(2)黏性末端限制 酶 3.噬菌体受体DNA上限制酶酶切位点标记 二、1.(1)人工合成目的基因基因文库(2)引物脱氧核苷酸耐 高温温度两种引物耐高温的DNA聚合酶指数形式琼脂糖凝 胶电泳 2.受体细胞NA聚合酶受体细胞中是否含有目的基因 标记基因 限制酶 3.目的基因子房T-DNA 染色体DNA显微注射 受精卵 4.PCR抗原一抗体杂交 三、1.(1)不溶于2mo1/L二苯胺(2)研磨 上清液95%一个 方向2mol/L二苯胺5min蓝色 2.(1)可解离相反琼脂糖凝胶电泳大小和构象(2)微量移液器 离心管底部PCR仪(3)300nm。 ①可以在紫外灯下直接观察到 DNA条带②一750 四、1.(1)限制性内切核酸酶I: -GGATCC--G -CCTAGG CCTAG GATCC- G 限制性内切核酸酶Ⅱ： -GATC- -CTAG -CTAG GATC- (2)用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶】切割质粒。限制酶【的识别 序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶I的位 点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目 的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标 记基因”，故只能使用限制酶I切割质粒。 2.①物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物I'自身 折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 3.经过n轮循环需要消耗引物数为(2n+1一2)个，第n轮循环需要消耗 的引物数为2个。