专题08 生物技术与工程-【好题汇编】2024年高考生物二模试题分类汇编（山东专用）

专题08 生物技术与工程 一、单选题 1．（2024·山东济宁·二模）关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀 B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质 C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷 D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理 2．（2024·山东泰安·二模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列说法正确的是（    ） A．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3' B．若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带 D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不同，数目相同 3．（2024·山东滨州·二模）M基因在动物的肝细胞中特异性表达产生M蛋白。培育M基因失活的转基因克隆动物A的操作流程如图所示。下列说法错误的是（　　） A．显微操作去核是指去除MⅡ期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物 B．将成纤维细胞用离心法收集制成新的细胞悬液进行传代培养 C．提取A成纤维细胞中的蛋白质进行抗原—抗体杂交，检测M基因是否失活 D．A可以作为研发与M基因相关疾病药物的模型动物 4．（2024·山东淄博·二模）西妥昔是由人/鼠融合基因表达的一种人/鼠嵌合型单抗（如图），除具备鼠源抗体的特异性和亲和力外，还降低了鼠源抗体对人体的免疫原性，可用于多种癌症晚期的治疗。EGF是体内促进细胞生长和增殖的因子，西妥昔注射到人体后可与癌细胞表面的EGF受体特异性结合，抑制癌细胞的生长，诱导癌细胞凋亡。服用西妥昔有一定副作用，如可引起皮肤瘙痒、肝功能下降等。下列关于西妥昔的说法，正确的是（    ） A．恒定区决定了抗体的特异性 B．人体的不良反应主要与恒定区有关 C．EGF受体仅在某些癌细胞中表达 D．西妥昔单抗的制备过程属于蛋白质工程 二、多选题 5．（2024·山东·二模）凝胶阻滞试验（EMSA）的基本原理是：荧光标记的DNA与蛋白质结合后分子量增大，电泳后通过荧光检测可在相应位置显示出阻滞条带。已知O2蛋白通过与ZmGRAS11基因启动子区的motif序列结合来调控ZmGRAS11基因的表达，科学家为证实motif序列是与O2蛋白结合的关键序列，利用荧光标记的motif序列作为指示探针，无荧光标记的motif序列（WT）和无荧光标记的突变motif序列（M1-M6）作为7种竞争探针如下表所示，分别加入了相应泳道进行EMSA试验，实验结束后进行荧光检测，结果如下图所示，下列说法错误的是（    ） 探针类型 motif序列 WT CTTGTGACTCATCCA M1 CTTGTCCA M2 CTTGTTTTTTTTCCA M3 CTTGGGGGGGGTCCA M4 CTTGCAGCTCATCCA M5 CTTGTGGTCCATCCA M6 CTTGTGACCTGTCCA 注：“+”表示加人相应物质，“-”表示未加入相应物质，竞争探针足够多 A．图中“？”是指荧光标记的指示探针 B．泳道3无阻滞条带的原因是O2蛋白不与WT探针结合 C．突变的竞争探针中M3与O2蛋白结合能力最弱 D．突变探针M4、M5、M6发生了相同数目的碱基替换，但与O2蛋白结合影响相对较小的是M6 三、非选择题 6．（2024·山东济宁·二模）某种小麦的雄性不育由核基因M控制，其整个花药在发育早期停止发育进程，因此其雄性不育比较彻底。研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构建表达载体，表达载体T-DNA部分结构如图1所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将不同表达载体转入幼胚获得转基因小麦，分别对核不育小麦、野生型小麦及转基因小麦的表型和M基因表达情况进行检测，部分结果如表： 组别 实验材料 载体组成I、Ⅱ 植株表型 M基因表达情况 第一组 核不育小表 无 雄性不育 eg 第二组 野生型小麦 无 可育 fg 第三组 野生型小麦 ad 死亡 第四组 野生型小麦 ①____ ②____ eg 注：a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．仅在花药发育早期表达f．在花药发育各时期均不表达g．在根、茎、叶、雌蕊中均不表达 (1)表中①处应分别选择 （填表注中字母序号），②处植株表型是 ，结果发现在存活的转基因小麦花药中均能检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是 。 (2)实验过程中 （填“需要”或“不需要”）设置将bd导入野生型小麦的实验组，理由是 。 (3)科研人员为检测（1）中T-DNA插入受体细胞染色体中的位置，利用反向PCR技术对插入位点两侧序列进行了分析，过程如图2。已知T-DNA的一条单链序列为：5-GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA-3（虚线处省略了部分核苷酸序列）。应选下列引物中的 （填序号）用于步骤Ⅲ，引物的作用是 。 A．5'-CGCGAGTACT-3'   B．5'-GCGCTCATGA-3' C．5'-CGTAGCCTCT-3'   D．5'-TACGCATTGC-3' 7．（2024·山东泰安·二模）为获得转R—GFP融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引物。 (1)在PCR反应溶液中常添加 ，其作用是 。在利用PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”） 端需分别插入 的限制酶识别序列，以使RFP基因能正确插入载体中。用于扩增RFP编码区序列的引物需满足的条件是 。 (2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有 。 (3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，选取1～5五只小鼠，从中提取含Gata3基因的相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则 小鼠是Gata3—RFP基因纯合子小鼠；若用引物A和B进行PCR扩增， （填“能”或“不能”）区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是 。 (4)为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引物）的延伸产物，结果获得大量单链DNA（ss—DNA）。若反应体系中原有100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss—DNA 个（用科学计数法表示），在这30个循环中ss—DNA的产生量主要受 的影响。 8．（2024·山东·二模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生长和发育，决定作物的产量和品质。SUT基因家族中的StSUT2基因主要在花和老叶中表达，科学家借助Gateway克隆技术通过构建StSUT2植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应（如图一、图二所示）。 (1)获得大量StSUT2基因：首先从植物的 细胞中提取总mRNA，经过 过程获得cDNA，根据StSUT2基因两端的序列设计引物进行PCR扩增，获得大量的StSUT2基因。 (2)构建入门载体：利用图一中的TOPO反应将目的基因PCR产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保StSUT2基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2基因时，可在引物中引入5'— —3'序列。 (3)构建StSUT2基因超表达载体：LR反应可借助入门载体上的attL位点和超表达载体上的attR位点，将入门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，得到所需载体。请结合图二中的LR反应过程，在下图三的方框中画出含StSUT2基因的超表达载体 。 (4)StSUT2基因超表达及检测：通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2基因是否成功超量表达。 9．（2024·山东聊城·二模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 (1)图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序列是5＇ -3＇。 (2)图示 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 (3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。 (4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，依据 原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 10．（2024·山东泰安·二模）研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD（多肽）的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。 (1)可采用PCR的方法获取融合基因TAT-RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是 。已知RTA基因和欲得到的TAT-RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入 酶切位点，引物2的5′端加入 酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1 （写出引物5′端的12个碱基即可）。 (2)载体的部分结构如图2所示，His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT-RTA融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析原因是 。可通过引物2的特殊设计使His标签正常表达，请结合图1和图2写出引物2 （引物中如需添加碱基补足对应的密码子，可以添加任意碱基）。 11．（2024·山东德州·二模）抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因（部分过程如图1所示），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。   (1)DNA聚合酶能够从引物的 （填“3´”或“5´”）端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当 （填“提高”或“降低”）复性温度。 (2)Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物 和引物 的5´端添加互补序列。 (3)图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是 。   (4)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是 ；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为 。   12．（2024·山东滨州·二模）脱水素是青稞中的一种抗冻物质。研究人员利用下图所示的质粒将脱水素基因Dhn4导入草莓细胞，成功培育出了抗冻草莓植株。 (1)将Dhn4导入受体细胞前需构建基因表达载体，目的是 。 (2)为使Dhn4与载体正确连接，对Dhn4进行PCR扩增时，引物F的5'端应含有 限制酶的识别序列，理由是 。 (3)为了筛选出符合要求的重组质粒，除了用标记基因进行区分，还可用限制酶KpnI处理质粒，电泳分离后进行区分。在方框中画出电泳的结果 。 (4)下图是利用同源重组法构建基因表达载体的过程。此过程设计的引物A应含有两部分碱基序列，分别是 、 。与使用限制酶构建基因表达载体相比，同源重组法的优点是 。 13．（2024·山东淄博·二模）解整合素-金属蛋白酶33（由ADAM33基因编码）是参与气道重塑的生长因子，可诱导哮喘发作。为研究GATA结合蛋白3（由GATA3基因编码）与哮喘的关系，科研人员构建了ADAM33和GATA3的pGl3-Basic表达载体，并导入HEK293细胞。下图为ADAM33表达载体的构建过程。 (1)以人的基因组DNA为模板，设计P1、P2、P3、P4、P5五个上游引物和一个下游引物F。为使基因能够正常表达，上游引物设计在ADAM33的调控区，原因是 pGl3-Basic的MCS上有多个限制酶酶切位点，其意义是 。 (2)已知F引物上构建了BglⅡ序列，则应在P1~P5的 端构建KpnI序列。在P1~P5上，限制酶序列3'端以外的其它碱基序列应与 （填“a链”“b链”）上的相应碱基序列相同。分别将含有P1~P5不同长度的DNA导入pGl3-Basic，构建P1~P5重组质粒。 (3)HEK293是细胞系细胞，可在体外培养。将P1～P5重组质粒分别转染HEK293细胞，经细胞培养后裂解细胞，离心取上清液，随后加入荧光素酶底物检测荧光酶活性，结果如图。 对照组的实验处理是 。为获得包含强启动子的ADAM33，上游引物应选用 。 (4)用相似方法构建GATA3重组质粒。将P1～P5组中含有强启动子一组细胞分为甲、乙两组，甲组不做处理，乙组转染GATA3重组质粒，检测ADAM33的转录水平，结果如图。 实验结果初步表明 。 14．（2024·山东潍坊·二模）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 注：①bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因；Tetr为四环素抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因②F1、F2、R1、R2为引物③BamH I、Sma I、Bcl I为限制酶 (1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有 。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5'端序列与 互补。 (2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为 。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为 。 ①5'-…CTTGGATGAT-3'②5'-…TAAGTTGTCT-3'③5'-…ATTCAACAGA-3'    ④5'-…TCTGTTGAAT-3' (3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是 。 (4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 分析表明，该激素最主要的合成部位是 ，通过实验结果分析该激素的生理作用是 。 试卷第1页，共3页 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！3 学科网（北京）股份有限公司 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！3 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题08 生物技术与工程 一、单选题 1．（2024·山东济宁·二模）关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀 B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质 C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷 D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理 【答案】C 【分析】电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 【详解】A、将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀，A正确； B、根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质，B正确； C、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带点分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C错误； D、PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，D正确。 故选C。 2．（2024·山东泰安·二模）稻米胚乳直链淀粉含量高会导致食用品质差。研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3'，两引物之间无另外的AccⅠ酶的识别位点。下列说法正确的是（    ） A．该实验中需设计的引物2为5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3' B．若酶切产物只能观察到450bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 C．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为3条条带 D．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不同，数目相同 【答案】C 【分析】用PCR扩增DNA片段的过程中，脱氧核苷酸只能加在引物3'端，子链延长方向是5'→3'，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氢核苷酸单链片段作引物。 【详解】A、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，A错误； B、PCR产物从71bp开始，到530bp为止，共460bp。若被切为大概150bp、300bp的两段，说明PCR产物可被酶切，则基因型应为GG，若PCR产物不被酶切，电泳后只有一条450bp左右的条带，则基因型为TT，B错误； C、若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，C正确； D、组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不同，D错误。 故选C。 3．（2024·山东滨州·二模）M基因在动物的肝细胞中特异性表达产生M蛋白。培育M基因失活的转基因克隆动物A的操作流程如图所示。下列说法错误的是（　　） A．显微操作去核是指去除MⅡ期卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物 B．将成纤维细胞用离心法收集制成新的细胞悬液进行传代培养 C．提取A成纤维细胞中的蛋白质进行抗原—抗体杂交，检测M基因是否失活 D．A可以作为研发与M基因相关疾病药物的模型动物 【答案】C 【分析】核移植是指将动物的一个细胞的细胞核移入一个去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎。这个新的胚胎最终发育为动物个体。核移植得到的动物称克隆动物，克隆动物的核基因完全来自供体动物，而细胞质基因来自受体细胞。核移植包括体细胞核移植和胚胎细胞核移植，其中体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植，因为体细胞的全能性低于胚胎细胞。 【详解】A、显微操作去核是指去除MⅡ期次级卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物，进而为供体细胞提供卵母细胞的细胞质基质，A正确； B、将成纤维细胞用离心法收集制成新的细胞悬液进行传代培养，进而获得大量的成纤维细胞，B正确； C、提取A成纤维细胞中的蛋白质进行抗原—抗体杂交，检测M基因是否表达，C错误； D、A动物体内含有M基因，因而可以作为研发与M基因相关疾病药物的模型动物，D正确。 故选C。 4．（2024·山东淄博·二模）西妥昔是由人/鼠融合基因表达的一种人/鼠嵌合型单抗（如图），除具备鼠源抗体的特异性和亲和力外，还降低了鼠源抗体对人体的免疫原性，可用于多种癌症晚期的治疗。EGF是体内促进细胞生长和增殖的因子，西妥昔注射到人体后可与癌细胞表面的EGF受体特异性结合，抑制癌细胞的生长，诱导癌细胞凋亡。服用西妥昔有一定副作用，如可引起皮肤瘙痒、肝功能下降等。下列关于西妥昔的说法，正确的是（    ） A．恒定区决定了抗体的特异性 B．人体的不良反应主要与恒定区有关 C．EGF受体仅在某些癌细胞中表达 D．西妥昔单抗的制备过程属于蛋白质工程 【答案】D 【分析】单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高、可大量制备。 【详解】A、由图可知，可变区能够与抗原特异性结合，可变区决定了抗体的特异性，A错误； B、鼠源抗体对人体具有免疫原性，人体的不良反应与鼠源抗体有关，主要与可变区有关，B错误； C、EGF是体内促进细胞生长和增殖的因子，EGF受体在其他细胞中也能表达，C错误； D、西妥昔单抗的制备过程通过对原有抗体基因改造完成，属于蛋白质工程，D正确。 故选D。 二、多选题 5．（2024·山东·二模）凝胶阻滞试验（EMSA）的基本原理是：荧光标记的DNA与蛋白质结合后分子量增大，电泳后通过荧光检测可在相应位置显示出阻滞条带。已知O2蛋白通过与ZmGRAS11基因启动子区的motif序列结合来调控ZmGRAS11基因的表达，科学家为证实motif序列是与O2蛋白结合的关键序列，利用荧光标记的motif序列作为指示探针，无荧光标记的motif序列（WT）和无荧光标记的突变motif序列（M1-M6）作为7种竞争探针如下表所示，分别加入了相应泳道进行EMSA试验，实验结束后进行荧光检测，结果如下图所示，下列说法错误的是（    ） 探针类型 motif序列 WT CTTGTGACTCATCCA M1 CTTGTCCA M2 CTTGTTTTTTTTCCA M3 CTTGGGGGGGGTCCA M4 CTTGCAGCTCATCCA M5 CTTGTGGTCCATCCA M6 CTTGTGACCTGTCCA 注：“+”表示加人相应物质，“-”表示未加入相应物质，竞争探针足够多 A．图中“？”是指荧光标记的指示探针 B．泳道3无阻滞条带的原因是O2蛋白不与WT探针结合 C．突变的竞争探针中M3与O2蛋白结合能力最弱 D．突变探针M4、M5、M6发生了相同数目的碱基替换，但与O2蛋白结合影响相对较小的是M6 【答案】BC 【分析】凝胶阻滞试验，又叫DNA迁移率变动的实验，是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。该方法用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋自-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞” 【详解】A、泳道1，没有加O2蛋白和竞争探针以及“？”，且只有一条指示探针条带，说明图中“？”是指荧光标记的指示探针，A正确； B、泳道3，加入了O2蛋白和无荧光标记的竞争探针WT探针以及荧光标记的指示探针，只有一条指示探针条带，且于泳道1的指示探针条带宽度相同，说明O2蛋白没有与荧光标记的指示探针结合，都与无荧光标记的竞争探针WT探针结合了，所以观察不到阻滞条带，B错误； C、分析泳道1和2结果可知，O2蛋白与荧光标记的指示探针结合越多阻滞条带就会越宽，指示探针条带就会越窄，而对于加入无荧光标记的突变竞争探针会竞争性的与O2蛋白结合，从而使指示探针的条带会变宽，阻滞条带就会变窄，且突变的竞争探针与O2蛋白结合能力越强，阻滞条带就会越窄，加入M3的泳道没有阻滞条带，说明突变的竞争探针中M3与O2蛋白结合能力最强，C错误； D、加入无荧光标记的突变竞争探针会竞争性的与O2蛋白结合，从而使指示探针的条带会变宽，阻滞条带就会变窄，且突变的竞争探针与O2蛋白结合能力越强，阻滞条带就会越窄，加入突变竞争探针M4、M5、M6的泳道，M6的阻滞条带最窄，说明突变的竞争探针中M6与O2蛋白结合能力最强，即M6发生的碱基替换，对其与O2蛋白结合影响相对较小，D正确。 故选BC。 三、非选择题 6．（2024·山东济宁·二模）某种小麦的雄性不育由核基因M控制，其整个花药在发育早期停止发育进程，因此其雄性不育比较彻底。研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构建表达载体，表达载体T-DNA部分结构如图1所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将不同表达载体转入幼胚获得转基因小麦，分别对核不育小麦、野生型小麦及转基因小麦的表型和M基因表达情况进行检测，部分结果如表： 组别 实验材料 载体组成I、Ⅱ 植株表型 M基因表达情况 第一组 核不育小表 无 雄性不育 eg 第二组 野生型小麦 无 可育 fg 第三组 野生型小麦 ad 死亡 第四组 野生型小麦 ①____ ②____ eg 注：a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．仅在花药发育早期表达f．在花药发育各时期均不表达g．在根、茎、叶、雌蕊中均不表达 (1)表中①处应分别选择 （填表注中字母序号），②处植株表型是 ，结果发现在存活的转基因小麦花药中均能检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是 。 (2)实验过程中 （填“需要”或“不需要”）设置将bd导入野生型小麦的实验组，理由是 。 (3)科研人员为检测（1）中T-DNA插入受体细胞染色体中的位置，利用反向PCR技术对插入位点两侧序列进行了分析，过程如图2。已知T-DNA的一条单链序列为：5-GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA-3（虚线处省略了部分核苷酸序列）。应选下列引物中的 （填序号）用于步骤Ⅲ，引物的作用是 。 A．5'-CGCGAGTACT-3'   B．5'-GCGCTCATGA-3' C．5'-CGTAGCCTCT-3'   D．5'-TACGCATTGC-3' 【答案】(1) c、d 雄性不育 TRIM序列的插入引起启动子序列改变，导致M基因在花药发育早期表达 (2) 不需要 野生型小麦本身具有bd，不需要另外导入 (3) BD 使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 【分析】据题干信息分析，本实验的实验目的是研究TRIM序列与雄性不育之间的关系，自变量是野生型小麦是否携带有TRIM序列，检测指标是植株的表型（雄性是否不育）以及M基因的表达情况 【详解】（1）本实验的实验目的是研究TRIM序列与雄性不育之间的关系，因此野生型小麦需要选择插入TRIM序列的M等位基因启动子，即c，TRIM序列的M等位基因启动子的作用是启动M基因的表达的，因此在构建载体组成I、Ⅱ时需要在插入TRIM序列的M等位基因启动子之后加入M编码区，故表中①处应分别选择c、d。已知所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且第一组实验结果和第四组的实验结果中M基因表达情况是相同的，因此②处植株表型是雄性不育。第二组实验野生型小麦M基因在花药发育各时期均不表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达，而第四组和第一组雄性不育植株中M基因仅在花药发育早期表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达，综上推测导致雄性不育的原因是TRIM序列的插入引起启动子序列改变，导致M基因在花药发育早期表达。 （2）由于野生型小麦本身具有bd，不需要另外导入b．M等位基因启动子和d．M编码区。 （3）反向PCR技术指的是扩增T-DNA的两侧序列，以T-DNA的一条单链序列5'-GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA-3'为模板，扩增其5'一侧序列，因此对应的引物是5'-TACGCATTGC-3'，以T-DNA的另一条单链序列3'-CGTTACGCATCGGAGA……TTGATACGCGAGTACT-5'为模板，扩增其5'一侧序列，因此对应的引物是5'-GCGCTCATGA-3'，故选BD。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。 7．（2024·山东泰安·二模）为获得转R—GFP融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引物。 (1)在PCR反应溶液中常添加 ，其作用是 。在利用PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”） 端需分别插入 的限制酶识别序列，以使RFP基因能正确插入载体中。用于扩增RFP编码区序列的引物需满足的条件是 。 (2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有 。 (3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，选取1～5五只小鼠，从中提取含Gata3基因的相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则 小鼠是Gata3—RFP基因纯合子小鼠；若用引物A和B进行PCR扩增， （填“能”或“不能”）区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是 。 (4)为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引物）的延伸产物，结果获得大量单链DNA（ss—DNA）。若反应体系中原有100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss—DNA 个（用科学计数法表示），在这30个循环中ss—DNA的产生量主要受 的影响。 【答案】(1) Mg2+ 激活DNA聚合酶的活性 5' Sal Ⅰ、EcoR Ⅰ 分别与两条模板链（RFP编码区序列）3'端的碱基序列互补 (2)Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶 (3) 1和5 不能 两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带 (4) 2.048×106 限制性引物和非限制性引物比例 【分析】选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 DNA重组技术的基本工具包括 “分子手术刀”--限制酶、“分子缝合针”--DNA连接酶、“分子运输车”--基因进入受体细胞的载体。 【详解】（1）PCR的全称是聚合酶链式反应，真核细胞和细菌细胞的DNA聚合酶的活性需要Mg2+来激活，所以PCR反应溶液中添加Mg2+，其作用是激活DNA聚合酶的活性。若要对RFP基因进行扩增，需在引物的5’端添加限制酶识别序列，因为引物对应区段也属于调控序列，若在3’端添加限制酶识别序列，会导致限制酶的切割位点位于调控序列内部，进行相应酶切时，调控序列会被破坏。RFP基因的终止子在右侧（即转录方向为从左到右），故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计的时候：R引物末端插入对应下方载体的Xho Ⅰ酶切位点，F引物末端插入对应下方载体的Mun Ⅰ酶切位点，又因为RFP基因中含有的Xho Ⅰ位点，因此不能用Xho Ⅰ酶来切，否则会破坏基因序列。结合题干当中所给的5种限制酶的识别序列，Xho Ⅰ和Sal Ⅰ互为同尾酶；Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ互为同尾酶（即切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切酶）。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F末端添加的序列所对应的限制酶应选择Sal Ⅰ，这样可以与下方载体中Xho Ⅰ的酶切位点结合；同理R末端应选用与Mun Ⅰ同尾的EcoR Ⅰ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有效片段，又能使之正确转录。引物是能够与DNA母链特定的碱基序列互补配对的单链核酸片段，由于扩增目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。 （2）在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要限制酶，且载体构建过程中用到DNA扩增技术，所以还需要Taq DNA聚合酶，载体构建完成还需要DNA连接酶将DNA片段连接起来。 （3）Gata3-RFP基因为大片段，故结合图乙可知1小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠。由图乙可知，RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带，故用引物A和B进行PCR扩增，不能区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子。 （4）100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备Ss-DNA：100×20×210=2.048×106。根据题干“经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引物）的延伸产物”可知，该过程中ss-DNA的产生量主要受限制性引物和非限制性引物比例的影响。 8．（2024·山东·二模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生长和发育，决定作物的产量和品质。SUT基因家族中的StSUT2基因主要在花和老叶中表达，科学家借助Gateway克隆技术通过构建StSUT2植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应（如图一、图二所示）。 (1)获得大量StSUT2基因：首先从植物的 细胞中提取总mRNA，经过 过程获得cDNA，根据StSUT2基因两端的序列设计引物进行PCR扩增，获得大量的StSUT2基因。 (2)构建入门载体：利用图一中的TOPO反应将目的基因PCR产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保StSUT2基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2基因时，可在引物中引入5'— —3'序列。 (3)构建StSUT2基因超表达载体：LR反应可借助入门载体上的attL位点和超表达载体上的attR位点，将入门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，得到所需载体。请结合图二中的LR反应过程，在下图三的方框中画出含StSUT2基因的超表达载体 。 (4)StSUT2基因超表达及检测：通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2基因是否成功超量表达。 【答案】(1) 花或老叶 逆转录 (2) 限制酶和 DNA 连接酶 CACC (3) (4)StSUT2 转运蛋白含量 【分析】PCR过程： ①变性：当温度上升到90℃以上时，DNA解旋为单链； ②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合； ③延伸：再将温度上升到72℃左右，反应体系中的4种脱氧核苷酸在耐高温的TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】（1）为获得大量StSUT2基因，应首先从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，通过逆转录过程获得cDNA，然后根据StSUT2基因两端的序列设计两种引物进行PCR扩增，进而获得大量的StSUT2基因。 （2）载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。因此拓扑异构酶与基因工程的限制酶和 DNA 连接酶功能相似。由于目的基因左侧碱基序列为GTGG，因此在扩增StSUT2基因时，可在引物中引人5'—CACC—3'序列，以确保StSUT2基因定向连接人门载体。 （3）因为LR反应可借助入门载体上的attL位点和超表达载体上的attR位点，将入门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，因此StSUT2基因的超表达载体为：   （4）为确定StSUT2基因是否成功超量表达，可通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的StSUT2 转运蛋白含量。 9．（2024·山东聊城·二模）人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 (1)图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序列是5＇ -3＇。 (2)图示 hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 (3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 的特点，从而实现重组DNA的扩增，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。 (4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，依据 原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 【答案】(1) XhoⅠ、Mum Ⅰ CTCGAGCCTTTCAGCT (2) 有利于hCGβ进入内质网加工 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 (3) 繁殖快，易培养、遗传物质少 氨苄青霉素 (4) a、b 抗原和抗体特异性结合 【分析】图中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。 【详解】（1）hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加限制酶识别序列，Sma Ⅰ会破坏目的基因，不能添加Sma Ⅰ识别序列；EcoR Ⅰ会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因（标记基因），不能添加EcoR Ⅰ识别序列；Sal Ⅰ会破坏质粒上的组氨酸合成酶基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列；Xho Ⅰ识别序列与Sma Ⅰ识别序列相似，会破坏目的基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列。因此，在hCGβ基因两端应添加XhoⅠ、Mum Ⅰ限制酶识别序列。根据转录方向和质粒AOX1启动子位置确定，在①处插入了Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，则①处的碱基序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，互补链中，碱基序列为3＇-GAGCTCGGAAAGTCGAGT -5＇,对其设计引物序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，由于经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，加上Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，总共16个碱基，因此设计该端对应引物的序列是5＇-CTCGAGCCTTTCAGCT-3＇。 （2）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。AOXⅠ为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。 （3）由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 （4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨苄青霉素（即a和b），但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。 hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法，原理为抗原与抗体特异性结合。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。 10．（2024·山东泰安·二模）研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD（多肽）的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。 (1)可采用PCR的方法获取融合基因TAT-RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是 。已知RTA基因和欲得到的TAT-RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入 酶切位点，引物2的5′端加入 酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1 （写出引物5′端的12个碱基即可）。 (2)载体的部分结构如图2所示，His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT-RTA融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析原因是 。可通过引物2的特殊设计使His标签正常表达，请结合图1和图2写出引物2 （引物中如需添加碱基补足对应的密码子，可以添加任意碱基）。 【答案】(1) 与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 BamH Ⅰ Xbo Ⅰ 5'GGATCCATGAGC3' (2) DNA连接酶 限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取 5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3' 【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段： （1）PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 （2）PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）PCR中，引物的作用是与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT-RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的位点，RTA靠近终止子一侧有Xbo Ⅰ的位点，则引物1的 5′端加入BamH Ⅰ，引物2的5′端加入Xbo Ⅰ。TAT基因编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5'端需插入BamH Ⅰ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5'端应包含BamH Ⅰ的识别序列，故设计为5'GGATCCATGAGC3'，以便BamH Ⅰ切出相应的黏性末端。 （2）切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知， 限制酶2识别序列与His标签序之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在A碱基左右侧再（随意）插入两个碱基，方可不打乱His标签基因，结合图1引物2的方向、Xbo Ⅰ的识别序列及碱基互补配对原则可知，引物2为5'CTCGAGTA（TA为补充碱基）G（与模版链配对的）AACTGGCTGCTCGGCGG3'。 11．（2024·山东德州·二模）抗菌肽是一类广泛存在于自然界中的多肽，对细菌、真菌、寄生虫和病毒具有广泛的抑制作用。科研人员将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因（部分过程如图1所示），从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽。   (1)DNA聚合酶能够从引物的 （填“3´”或“5´”）端开始连接脱氧核苷酸。若设计的引物较长，为提高PCR的准确度需要适当 （填“提高”或“降低”）复性温度。 (2)Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板。为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要分别在引物 和引物 的5´端添加互补序列。 (3)图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是 。   (4)在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是 ；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片。根据图示实验结果推测，在A、D区域放置的滤纸片分别为 。   【答案】(1) 3´ 提高 (2) X Z (3)Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等 (4) 使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用 空白滤纸片、含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片 【分析】PCR技术进行的条件有：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定性的DNA聚合酶，所运用的原理为DNA分子的复制，遵循碱基互补配对原则。 【详解】（1）DNA聚合酶在DNA复制过程中，从引物的3’端 开始连接脱氧核苷酸，因为DNA聚合酶只能催化脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸片段的3'羟基上。如果设计的引物较长，那么引物与模板之间的结合会更加稳定，因此需要适当提高复性温度，以确保引物与模板之间的特异性结合。 （2）已知Piscidin基因表达以a链为模板，NK-lysin基因表达以d链为模板，方向为5´→3´，而在PCR扩增时，引物会与模板链的3´结合，沿着5´→3´方向延伸，所以为了实现图1中两基因重叠延伸，PCR1过程中需要在引物X和引物Z的5端添加互补序列，这是因为X引物用于扩增Piscidin基因，而Z引物用于扩增NK-lysin基因，并且这两个基因需要在PCR1过程中实现重叠延伸。通过在X和Z的5'端添加互补序列，可以确保在PCR1过程中， 两个基因能够按照预期的方式进行重叠和延伸。 （3）图2为PCR1扩增产物（Ⅰ、Ⅱ）和PCR2扩增产物（Ⅲ）的凝胶电泳实验结果，根据结果可说明基因融合成功，判断依据是Ⅰ、Ⅱ的长度之和与Ⅲ基本相等。 （4）在转化前，需要先构建含NK-LPd基因的表达载体，其目的是使融合基因能够在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，且使融合基因表达和发挥作用；在成功转化的酵母菌中提纯得到杂合抗菌肽NK-LPd，为验证NK-LPd对大肠杆菌的抑菌效果，先将大肠杆菌涂布在图3的平板上，再放置滤纸片，根据抑菌圈大小可以判断抑菌效果的强弱，在图3中A区域未出现抑菌圈，推测放置的滤纸片为空白滤纸片，D区域抑菌圈最大，根据题干信息可知，将抗菌肽Piscidin基因及NK-lysin基因进行融合形成杂合肽NK-LPd基因，从而获得具有更高抗菌活性的杂合抗菌肽，所以推测D区域放置的滤纸片为含杂合抗菌肽NK-LPd的滤纸片。 12．（2024·山东滨州·二模）脱水素是青稞中的一种抗冻物质。研究人员利用下图所示的质粒将脱水素基因Dhn4导入草莓细胞，成功培育出了抗冻草莓植株。 (1)将Dhn4导入受体细胞前需构建基因表达载体，目的是 。 (2)为使Dhn4与载体正确连接，对Dhn4进行PCR扩增时，引物F的5'端应含有 限制酶的识别序列，理由是 。 (3)为了筛选出符合要求的重组质粒，除了用标记基因进行区分，还可用限制酶KpnI处理质粒，电泳分离后进行区分。在方框中画出电泳的结果 。 (4)下图是利用同源重组法构建基因表达载体的过程。此过程设计的引物A应含有两部分碱基序列，分别是 、 。与使用限制酶构建基因表达载体相比，同源重组法的优点是 。 【答案】(1)让Dhn4在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使Dhn4能够表达和发挥作用 (2) PvuⅡ 转录是从模板链的3'端开始的，与模板链配对的引物F的5'端靠近载体中的启动子 (3) 说明：普通质粒对应泳道中2条带分别为4.7kb和1.75kb；重组质粒对应泳道中1条带为8.2kb (4) 同源序列1 与目的基因编码链5'端相同的碱基序列（或与目的基因模板链3'端互补的碱基序列） 目的基因的插入位点不受限制酶识别序列的限制 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 【详解】（1）将Dhn4导入受体细胞前需构建基因表达载体，目的是让Dhn4在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使Dhn4能够表达和发挥作用。 （2）质粒上含有两个KpnI限制酶切位点，若引物F的5'端含有KpnI限制酶的识别序列，则对质粒进行酶切时会将终止子切除，Dhn4基因转录时从模板连3'端开始，因此模板连3'端（F的5'端）与靠近启动子的PvuⅡ相连，即引物F的5'端应含有PvuⅡ限制酶的识别序列，理由是转录是从模板链的3'端开始的，与模板链配对的引物F的5'端靠近载体中的启动子。 （3）据图示分析，质粒上有两个KpnI限制酶切位点，酶切后形成（1.6+0.15）=1.75kb和（4.6+0.1)=4.7kb两个片段；目的基因插入在PvuⅡ和EcoRI之间，重组质粒只有一个KpnI限制酶切位点，酶切后只有（4.6+1.6+2.0）=8.2kb一个片段。电泳时DNA片段碱基数量越多，移动速度越快，因此电泳结果如图所示： （4）据图分析，引物A的作用是保证目的基因和线性化质粒连接，因此引物A的3'端与目的基因编码链5'端相同的碱基序列（或与目的基因模板链3'端互补的碱基序列），同时引物A的5'端与同源序列1互补。与使用限制酶构建基因表达载体相比，同源重组法的优点是目的基因的插入位点不受限制酶识别序列的限制。 13．（2024·山东淄博·二模）解整合素-金属蛋白酶33（由ADAM33基因编码）是参与气道重塑的生长因子，可诱导哮喘发作。为研究GATA结合蛋白3（由GATA3基因编码）与哮喘的关系，科研人员构建了ADAM33和GATA3的pGl3-Basic表达载体，并导入HEK293细胞。下图为ADAM33表达载体的构建过程。 (1)以人的基因组DNA为模板，设计P1、P2、P3、P4、P5五个上游引物和一个下游引物F。为使基因能够正常表达，上游引物设计在ADAM33的调控区，原因是 pGl3-Basic的MCS上有多个限制酶酶切位点，其意义是 。 (2)已知F引物上构建了BglⅡ序列，则应在P1~P5的 端构建KpnI序列。在P1~P5上，限制酶序列3'端以外的其它碱基序列应与 （填“a链”“b链”）上的相应碱基序列相同。分别将含有P1~P5不同长度的DNA导入pGl3-Basic，构建P1~P5重组质粒。 (3)HEK293是细胞系细胞，可在体外培养。将P1～P5重组质粒分别转染HEK293细胞，经细胞培养后裂解细胞，离心取上清液，随后加入荧光素酶底物检测荧光酶活性，结果如图。 对照组的实验处理是 。为获得包含强启动子的ADAM33，上游引物应选用 。 (4)用相似方法构建GATA3重组质粒。将P1～P5组中含有强启动子一组细胞分为甲、乙两组，甲组不做处理，乙组转染GATA3重组质粒，检测ADAM33的转录水平，结果如图。 实验结果初步表明 。 【答案】(1) pGl3-Basic缺少启动子 增大质粒的适用性 （方便目的基因插入） (2) 5' b链 (3) 将pGl3-Basic （空载质粒）转染HEK293细胞 P3 (4)乙组的表达量高，说明GATA3（GATA结合蛋白）促进 ADAM33的表达 ，（GATA3/GATA结合蛋白3）促进哮喘的发生与发展 【分析】DNA分子是由两条链按反向平行方式盘旋成的双螺旋结构。DNA的一条单链具有两个末端，一端有一个游离的磷酸基团，这一端称作5′ 端，另一端有一个羟基（–OH），称作3′ 端，DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3′端。启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA；终止子位于基因的下游，起到终止转录的作用，因此在构建基因表达载体时，外源的DNA片段（目的基因）应插在启动子和终止子之间。 【详解】（1）由图可知：pGl3-Basic缺少启动子，pGl3-Basic的MCS上有多个限制酶酶切位点。为使ADAM33基因能够正常表达，应将P1、P2、P3、P4、P5五个引物设计在ADAM33的调控区，该设计的意义是：增大质粒的适用性 （方便目的基因插入）。 （2）DNA分子是由两条链按反向平行方式盘旋成的双螺旋结构。图中的a链和b链中，有一个游离的磷酸基团的为5′ 端，有一个羟基（–OH）的一端为3′ 端，利用PCR技术扩增目的基因时，子链的延伸方向为5′ 端到3′ 端。已知F引物上构建了BglⅡ序列，则应在P1~P5的5' 端构建KpnI序列。在P1~P5上，限制酶序列3'端以外的其它碱基序列与a链上的相应碱基序列互补，应与b链上的相应碱基序列相同。 （3）由题意和题图可知：自变量为pGl3-Basic 中是否插入外源的DNA片段。P1组～P5组为实验组，将P1～P5重组质粒分别转染HEK293细胞，因此对照组的实验处理是将pGl3-Basic （空载质粒）转染HEK293细胞。题图显示：P3组的荧光素酶相对活性最高，据此可推知，为获得包含强启动子的ADAM33，上游引物应选用重组质粒P3。 （4）由题意和题图可知：该实验的自变量为是否转染GATA3重组质粒，因变量是3rADAM33的转录水平。结果转入转染GATA3重组质粒的乙组的3rADAM33的转录水平明显高于没有转入转染GATA3重组质粒的甲组的3rADAM33的转录水平，由此可初步表明：乙组的表达量高，说明GATA3（GATA结合蛋白）促进 ADAM33的表达 ，（GATA3/GATA结合蛋白3）促进哮喘的发生与发展。 14．（2024·山东潍坊·二模）A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。 注：①bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因；Tetr为四环素抗性基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因②F1、F2、R1、R2为引物③BamH I、Sma I、Bcl I为限制酶 (1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有 。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5'端序列与 互补。 (2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为 。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为 。 ①5'-…CTTGGATGAT-3'②5'-…TAAGTTGTCT-3'③5'-…ATTCAACAGA-3'    ④5'-…TCTGTTGAAT-3' (3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是 。 (4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示： 部位 根 茎 叶 完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝 缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝 分析表明，该激素最主要的合成部位是 ，通过实验结果分析该激素的生理作用是 。 【答案】(1) DNA聚合酶和DNA连接酶 F1（或P基因左侧序列） (2) Bcl I和Sma I ①④ (3)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞 (4) 根 促进植物对磷元素的吸收 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 【详解】（1）由题图信息可知，利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因（P基因）与葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，构建A蛋白检测探针，所以无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有DNA聚合酶和DNA连接酶。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5'端序列与F1（或P基因左侧序列）3'互补。 （2）利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamH I，会降Ti质粒上的复制原点切掉，剩下的部分在启动子和终止子之间没有限制酶的切割位点，故选择Bcl I和Sma I。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3'端序列可以与④5'-…TCTGTTGAAT-3'配对，5'端序列的互补链可以与①5'-…CTTGGATGAT-3'配对，因此选用的引物组合为①④。 （3）利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。 （4）葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，根据表格可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，而在含磷的完全培养液中出现蓝色，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收，促进葡萄糖苷酸酶合成，水解X-Gluc呈蓝色。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！3 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$