3.2 基因工程的基本操作程序（第二课时）课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第2 节 基因工程的基本操作程序 第二课时 1.目的基因的筛选与获取（前提） 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞（关键） 4.目的基因的检测与鉴定（保证） （1）从基因文库中获取 （2）人工合成法 （3）利用PCR技术获取和扩增（回顾） 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 PCR回顾 3 【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？ 转录 初级RNA 成熟mRNA 剪切、拼接 DNA聚合酶 单链DNA cDNA 逆转录酶 逆转录 复制 cDNA不含有非编码序列。即启动子、终止子和内含子。 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 基因表达载体 启动子： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 终止子： 终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。 标记基因： 目的基因： 复制原点： 便于重组DNA分子的筛选。 能控制表达所需要的特殊性状。 注意：目的基因必须插入到 与 之间。 启动子 终止子 DNA复制的起始位点。 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 作用 DNA mRNA 转录的起点和终点 翻译的起点和终点 载体≠表达载体 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 二.基因表达载体的构建（核心） 重组 DNA分子 DNA连接酶 获取目的基因 限制酶 目的基因 限制酶切割位点 基因表达载体构建模式图 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 构建过程 1)单酶切法 单酶切的方法缺陷是什么？ 3.构建过程 自连 目的基因自连 质粒自连 片段间的连接 目的基因与质粒连接 质粒与质粒连接 目的基因与目的基因连接 2)双酶切法 双酶切的优点: ① 防止质粒重新环化 ② 防止质粒与目的基因反向连接 ③ 防止目的基因自身环化 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割 根据限制酶的选择原则应选择的限制酶 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法（常用与双子叶和裸子植物） 基因枪法（单子叶植物常用） 花粉管通道法 1.方法 ——显微注射法 —— Ca2+转化法 （我国科学家独创，单双都可） 三.将目的基因导入受体细胞 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（单子叶植物常用，但成本较高） 花粉 外源DNA 花粉管 子房 胚珠 1)花粉管通道法 ①用_____________将_________________________直接注入______中； 微量注射器 含目的基因的DNA溶液 子房 ② 在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在___________上，使目的基因借助_____________进入_______； 柱头 DNA溶液 花柱切面 花粉管通道 胚囊 受体细胞： 受精卵 子房 花粉 柱头 花粉管 精子 卵细胞 胚囊 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 简便经济，但要求花朵较大 2)农杆菌转化法（采用最多） ①转化： 目的基因进入___________内，并且在受体细胞内维持_______和_______的过程。 受体细胞 稳定 表达 ②农杆菌特点 ③利用农杆菌进行转化的思路： a. 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数_____________没有侵染能力； 双子叶植物 裸子植物 单子叶植物 b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（_______________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________； Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 可转移的DNA 整合到该细胞的染色体DNA上 将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的_______作用，就可以使目的基因________________。 Ti质粒的T-DNA 转化 进入植物细胞 有吸引农杆菌的化学物质。 ④ 农杆菌转化法的过程： T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现出新性状的植物 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌； 提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入 两次拼接： 两次导入： 表现出新性状的植株 第二次拼接：指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作)。 第二次导入：指含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)。 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 过程： 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ ① 体积大，易操作。 ② 全能性高，易培养成完整个体。 导入动物细胞 3)显微注射法 科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。 病毒侵染法 细胞 处理大肠杆细胞 Ca2+ 感受态 与感受态细胞混合 细胞吸收DNA分子 基因表达载体 使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。 注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 导入微生物细胞 4)Ca2+转化法 增加细菌细胞膜的通透性 因为没有内质网、高尔基体 对蛋白质进一步加工。 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 项目 种类 花粉管通道法或 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 受精卵或体细胞 受精卵 原核细胞 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中 1.目的 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 2. 检测内容及方法 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原——抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 四.目的基因的检测与鉴定 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 方法1：PCR扩增 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 DNA半保留复制 原理： 是否扩增出目的基因 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 电泳操作 引物如何设定？ 1)分子水平的检测 初步鉴定 原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 酶切 转膜 标记的DNA/RNA探针 DNA分子杂交（Southern-blot)流程图 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 方法2： DNA分子杂交技术 碱基互补配对 原理： 1)分子水平的检测 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法：PCR扩增或分子杂交技术 转基因生物 提取RNA RNA作为模板 PCR操作 电泳 是否扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA 转膜 标记的DNA/RNA探针 RNA RNA分子杂交(Northern Blot)流程图 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 1)分子水平的检测 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法： 抗原与抗体的特异性结合 原理： 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 抗原— 抗体杂交技术 1)分子水平的检测 yi 2)个体生物学水平鉴定 没有抗虫基因的棉花植株 有抗虫基因的棉花植株 棉铃虫没有死亡 棉铃虫死亡 接种 棉铃虫 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 转Bt基因 非转基因 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 23 抗虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定等 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒植物 抗盐植物 抗除草剂植物 饲喂害虫 害虫死亡 病毒感染（病毒接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 2)个体生物学水平鉴定 第四步：目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序（4个步骤） 第一步：目的基因的筛选和获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 利用PCR获取和扩增 人工合成；构建基因文库 目的基因、标记基因、启动子、终止子 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、Ca2+处理法(微生物) 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 ---核心 25 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 (1) afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 (2) 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 (3) 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 随堂练习 3.下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ ） A.该技术应用体内DNA半保留原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件 B.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上 C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的 D.该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是 A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 随堂练习 $$