3.2 基因工程的基本操作程序（第1课时） 课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2 基因工程的基本操作程序 （第1课时） 学习目标： 1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右) 基因工程的基本操作程序 培育转基因抗虫棉的简要过程 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 导入 抗虫基因 （Bt抗虫蛋白基因） 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取（前提） 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞（关键） 4.目的基因的检测与鉴定（保证） (含抗虫基因） （含有并表达抗虫基因） 抗虫基因已插入染色体DNA中 一、目的基因的筛选和获取 概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。 1.目的基因 目的基因主要是指编码蛋白质的基因 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 （也可以是一些具有调控作用的因子） 一、目的基因的筛选和获取 2.目的基因的筛选 筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。 实例： Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程 苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 Bt抗虫蛋白的抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ 一、目的基因的筛选和获取 3.目的基因的获取 （1）从基因文库中获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 类型： 基因组文库: 部分基因文库 包含一种生物的全部基因 （如cDNA文库）： 包含一种生物的部分基因 （2）人工合成法： （化学合成法、逆转录法） 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 DNA合成仪 （3）利用PCR技术获取和扩增 一、目的基因的筛选和获取 （3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用） PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR扩增仪 一、目的基因的筛选和获取 回顾：DNA复制的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 模板 原料 能量 酶 解旋酶：打开DNA双链 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 四种游离的脱氧核苷酸 ATP 打开的两条DNA母链 DNA复制的过程 PCR条件 ①DNA模板（需含有目的基因） ②四种脱氧核苷酸 (或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP) ③耐高温的DNA聚合酶 （不需要解旋酶，DNA在高温下解旋） ⑤引物（分别与模板DNA相结合的2种引物） ④稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+激活DNA聚合酶） 一、目的基因的筛选和获取 拓展：引物 A T C G A A T C G G T T T A C C T T A G C C A A DNA 聚合酶 母链 DNA 子链 DNA 引物 3′ 3′ 5′ 5′ DNA聚合酶 ①因为DNA复制时，子链延伸的方向都是从5’→3’端 ②DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从3’端延伸DNA链 一、目的基因的筛选和获取 拓展：引物 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 子链延伸方向5’ 3’ PCR扩增的前提是： 根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物（不需要知道整个目的基因的碱基序列） 由于DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增，PCR扩增时至少需要2种引物 引物的作用：定位目的基因的位置，与模板连结合，并为子链的延伸提供起点。 一、目的基因的筛选和获取 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 引物 待扩增DNA片段 5’ 5’ 变性 温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链 复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 PCR反应的过程 一、目的基因的筛选和获取 3’ 3’ 3’ 3’ 第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。 第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ PCR得到的DNA产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定 比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件 在DNA复制中的作用 体内DNA复制条件 PCR反应条件 DNA母链 DNA母链 解旋酶 高温条件（90℃以上） 4种脱氧核苷酸 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 一小段RNA （人工合成的）一小段DNA 提供DNA复制的模板 断裂氢键， 打开DNA双链 合成子链DNA的原料 催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链 使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物） DNA 分子数： 2n DNA 单链总数： 2n+1 DNA长 单链总数： 2 DNA中单链总数： 2n 等长DNA数： 2n-2n 含其中一种引物的DNA分子数 2n -1 同时含两种引物的DNA分子数 2n -2 共消耗引物的对数 2n -1 PCR中的数量关系 1.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　） A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 2.如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是（　　） A.片段a、b、c的长度均相同 B.片段a、b只是第一次循环的产物 C.片段c最早出现在第二次循环的产物中 D.经过30次循环后，片段c的数量为230 3.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个（　　） A.2 B.4 C.6 D.8 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 间隔的、不连续的 外显子： 内含子： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列 能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列 外显子 内含子 启动子 终止子 【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？ 转录 初级RNA 成熟mRNA 剪切、拼接 DNA聚合酶 单链DNA cDNA 逆转录酶 逆转录 复制 cDNA不含有非编码序列。即启动子、终止子和内含子。 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 原核细胞的基因结构 非编码区： 不转录，不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列。 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因上游； 本质： 位置： 作用： 也是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因下游； 终止转录 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 启动子 终止子 连续的、不间隔的 二、基因表达载体的构建 获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因（目的基因）能够表达和发挥作用。 构建基因表达载体 （核心步骤） 基因表达载体由哪些部分组成 二、基因表达载体的构建 基因表达载体 启动子： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 终止子： 终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。 标记基因： 目的基因： 复制原点： 便于重组DNA分子的筛选。 能控制表达所需要的特殊性状。 注意：目的基因必须插入到 与 之间。 启动子 终止子 DNA复制的起始位点。 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 位置 作用 DNA mRNA 转录的起点和终点 翻译的起点和终点 载体≠表达载体 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 二、基因表达载体的构建 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端切口 带有相同黏性末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 基因表达载体构建过程（课本P80） (2022·天津市高二阶段练习)研究人员用下图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点)，将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述不正确的是 A.构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶 B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组 C.能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌 D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙 √ 2016高考全国卷1：40．【生物——选修3：现代生物科技专题】（15分） 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： （1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件 有 （答出两点即可）。 而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外， 还需具有启动子和终止子。 能自我复制、具有标记基因 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： （2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞不能区分的，其原因是 ； 并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 的固体培养基。 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长 含质粒载体 含重组质粒 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 Lavf57.83.100 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$