小单元3 第1课时 基因工程的基本工具和基本操作程序-【金版教程】2025年高考生物一轮复习解决方案全书word（新教材，不定项版）

2025高考科学复习解决方案　生物学　经典版(不定项) 小单元3　基因工程 1．从结构与功能观、系统观等视角，结合抗虫棉的培育等生活和生产实例，阐述基因工程的基本原理和操作过程。 2．面对日常生活或社会热点中与基因工程有关的话题，能基于证据运用生物学基本概念和原理进行分析，举例说出基因工程的原理和生产实践之间的关系。 3．针对人类生产或生活的某一需求，如利用基因治疗方法治疗某些遗传病，在基因工程中选取恰当的技术和方法，尝试提出初步的工程构想，并进行简单的设计和制作并运用科学术语报告实验结果。 4．面对日常生活或社会热点话题中与基因工程有关的安全问题，如转基因食品是否安全，能表明自己观点并展开讨论。 我国拥有自主知识产权的基因工程药物——重组人胰岛素已经研制成功并得到广泛应用。请从以下几个方面了解人工胰岛素生产的相关知识。 1．为什么能够生产胰岛素？(基因工程的原理) 2．怎么生产胰岛素？(基因工程操作步骤) 3．如何优化“人工胰岛素”产品？(蛋白质工程) 第课时　基因工程的基本工具和基本操作程序 [内容标准细化]　1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定。 课前5 min检测 1．研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是(　　) A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作 B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因 C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶 D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功 答案　B 解析　基因表达载体的构建是培育转基因生物的核心工作，A错误；题述研究的目的是获得抗冻的番茄品种，因此抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因，B正确；构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶，不需要核酸酶，C错误；番茄需要具有抗冻性状才能代表抗冻番茄培育成功，含有的afp基因若不表达，则表示抗冻番茄的培育仍未成功，D错误。 2.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜。Ti质粒如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．农杆菌的拟核DNA与番木瓜基因发生重组 B．构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D．转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 答案　D 解析　农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；由于基因C的插入引起T­DNA上的四环素抗性基因被破坏，则含重组Ti质粒的农杆菌具有卡那霉素抗性，而不具有四环素抗性，C错误；因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T­DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D正确。 3．(2023·河北邢台期末)如图为利用逆转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析，下列说法错误的是(　　) A．③过程使用90～95 ℃的高温处理是为了让目的基因充分变性 B．⑤过程使用70～75 ℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸 C．④过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 D．若RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则其逆转录合成的双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40% 答案　D 解析　③过程为变性，变性过程使用90～95 ℃的高温处理是为了让目的基因的氢键断裂，双链解开，充分变性，A正确；⑤过程为延伸，延伸过程使用70～75 ℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸，B正确；④过程为复性，复性过程使用55 ℃左右的温度处理，使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，C正确；DNA中不含有U，含有T，D错误。 知识自主梳理 一　基因工程的概念及基本工具 1．基因工程概念 (1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 知识拓展 基因工程的理论基础 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称：限制酶) ①本质：蛋白质。 ②来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ③作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ④结果：产生黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。 ②类型 常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 (3)载体 二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR特异性地快速扩增目的基因 PCR含义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNA半保留复制 要求 模板 目的基因的两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 PCR反应过程 变性 当温度超过90__℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50__℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72 ℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 扩增方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 方式 指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数) 结果 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 知识拓展 1.在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2．引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 3．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 ③还可以通过构建基因文库来获取目的基因。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心工作 (1)操作目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体组成 (3)构建过程 特别提醒 1.目的基因应插入启动子和终止子之间。 2．若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。 3．将目的基因导入受体细胞 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞(受精卵) 显微注射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞(原核细胞) Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 4.目的基因的检测与鉴定 知识拓展 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。 (3)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 三　实验 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 ①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。 ②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 (2)实验步骤(以洋葱为例) 特别提醒 1.加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 2．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)PCR仪 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 (2)电泳鉴定PCR产物的原理 ①电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ②鉴定原理 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300 nm的紫外灯下被检测出来。 (3)实验步骤 ①PCR实验操作步骤 ②DNA的电泳鉴定 (4)注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 典例精研精练 题型一　重组DNA技术的基本工具 1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中错误的是(　　) 限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG 注：Y为C或T，R为A或G。 A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 答案　D 解析　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；HindⅡ识别的序列中Y为C或T，R为A或G，所以一种限制酶并非只能识别一种核苷酸序列，D错误。 2．(不定项)第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析正确的是(　　) A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团 C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D．抗原基因在体内表达时需要解旋酶 答案　AB 解析　质粒是环状DNA分子，其上只有一个EcoRⅠ的切点，因此被EcoRⅠ切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团，B正确；从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D错误。 题型二　基因工程的基本操作程序 3．为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作与实验目的不符的是(　　) A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因 B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 答案　C 解析　由图可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，A正确；图中质粒与GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，B正确；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，C错误。 4.(不定项)如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是(　　) A．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶 B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的5′→3′方向延伸 C．从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/16 D．在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/2 答案　BD 解析　利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，该过程中氢键的断裂是通过高温完成的，而子链延伸过程需要耐高温的DNA聚合酶，A正确；引物是子链合成延伸的基础，即DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，也可以说子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，B错误；从理论上推测，第四轮循环产物共有24＝16个DNA分子，其中有2个含有母链，只含有引物A的DNA片段即为与其中的一个母链形成的1个DNA分子，因此，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/16，C正确；第三轮循环即DNA复制3次，共形成8个DNA，其中2个DNA分别含有引物A、引物B，6个DNA含有引物A和引物B，其中只有2个两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，含量为1/4，D错误。 5．(2024·福建泉州高三质量检测)可用作生物表面活性剂的鼠李糖脂不仅具有优异的功能稳定性，还具有无毒、无污染、可被生物降解等优点，因而在医药、食品、农业、石油开采、环境污染修复等领域展示了其独特的应用前景。可合成鼠李糖脂的天然菌株存在致病性等缺点，而异源菌株中往往存在合成鼠李糖脂的重要前体物质，理论上只要将外源基因插入该菌株进行异源表达即可合成鼠李糖脂。某科研团队选择在无致病的异源菌株恶臭假单胞菌(P.putida)中插入外源基因rhIA以合成鼠李糖脂。已知表达载体pBBR1mcs­5的MCS含有多种限制性内切核酸酶的单一切点，GmR为庆大霉素的抗性基因。请回答： (1)利用PCR技术获取外源基因rhIA：以下可提供外源基因rhIA模板的菌株有________。 ①P.putida　②E.coli　③P.aeruginosa ④Burkholderia sp. (2)因外源基因rhIA不含有MCS中的限制酶酶切位点，需对上述PCR产物进行二次PCR扩增。二次PCR所使用的引物应该在第一次PCR引物的________(填“3′”或“5′”)端插入包含限制酶酶切位点的序列。在上游引物所插入的序列含有5′－AGGGCGAATTGGAGCTC－3′，下游引物插入的序列含有 5′－GCTTGATATCGAATTCGA－3′。 (3)基因表达载体构建：将表达载体pBBR1mcs­5与上述扩增产物用SacⅠ和________限制性内切核酸酶酶切后进行连接。 (4)将目的基因导入受体细胞：用________处理P.putida使其处于能够吸收外源DNA的生理状态，与上述基因表达载体混合培养一段时间。 (5)目的基因的检测与鉴定： ①用稀释涂布法将培养液接种到含庆大霉素的________(填“选择”或“鉴别”)培养基上培养以检测表达载体是否导入重组菌株。 ②通过PCR技术可检测________。 a．表达载体pBBR1mcs­5是否含有外源基因rhIA b．外源基因rhIA是否转录出mRNA c．外源基因rhIA是否表达出相应的蛋白质 ③测定发酵液中________的含量。 答案　(1)③④　(2)5′　(3)EcoRⅠ (4)Ca2＋(或CaCl2) (5)①选择　②ab　③鼠李糖脂 解析　(1)外源基因rhIA应存在于天然菌株中，可提供外源基因rhIA模板的菌株有③P.aeruginosa和④Burkholderia sp.两种天然菌株。 (2)子链延伸的方向为5′→3′，故二次PCR所使用的引物应该在第一次PCR引物的5′端插入包含限制酶酶切位点的序列。 (3)已知目的基因上游引物所插入的序列含有5′－AGGGCGAATTGGAGCTC－3′，下游引物插入的序列含有5′－GCTTGATATCGAATTCGA－3′，SacⅠ可以特异性识别并切割位于上游引物的GAGCTC序列，下游引物中含有的GAATTC序列可以被EcoRⅠ识别并切割，故将表达载体pBBR1mcs­5与上述扩增产物用SacⅠ和EcoRⅠ限制性内切核酸酶酶切后进行连接。 (5)①重组的基因表达载体含有庆大霉素的抗性基因，用稀释涂布法将培养液接种到含庆大霉素的选择培养基上，只有含有表达载体的菌株可以正常生长，以检测表达载体是否导入重组菌株。②可以直接利用PCR技术检测表达载体pBBR1mcs­5是否含有外源基因rhIA或外源基因rhIA是否转录出mRNA，其原理为碱基互补配对原则，故选ab。③外源基因的插入使该菌株进行异源表达即可合成鼠李糖脂，若菌株成功导入外源基因rhIA，则发酵液中可以检测到鼠李糖脂。 技法提升 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用两种限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 题型三　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 6．多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是(　　) A．研磨液可通过离心去除固体杂物 B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色 答案　C 7．(不定项)人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法错误的是(　　) A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率只与cfDNA分子的大小有关 C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物 D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查 答案　AB 解析　PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。 课时作业 一、单项选择题(每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的) 1．(2023·山东滨州模拟)构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5′－P变成5′－OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′－OH与3′－OH不能连接而形成切口(nick)。下列说法错误的是(　　) A．经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化 B．外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理 C．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端 D．重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA 答案　B 解析　将经过碱性磷酸单酯酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′－OH与3′－OH不能连接而形成切口(nick)，因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；DNA进行半保留复制，1个重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。 2．(2023·福建模拟预测)实时荧光RT—PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT—PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　) A．做RT—PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B． RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增 C．若有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D．病毒的检测还可以检测病毒的蛋白类物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 答案　C 解析　PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误；RNA病毒的检测方法还有特异性抗原蛋白检测(可检测病毒表面的一种蛋白)和特异性抗体检测(检测感染者体内通过免疫反应产生的某种抗体)，其原理均为抗原—抗体杂交，D正确。 3．DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带电荷的DNA分子在电场中向它所带电荷相反的电极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是(　　) A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢 B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测 C．拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽提剂抽提，再用体积分数为70%的冷乙醇沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率 D．新型冠状病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染 答案　C 解析　DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，A正确；应用体积分数为95%的冷乙醇沉淀抽提，这样抽提的效果最好，C错误。 4．进行基因编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某二倍体生物B基因进行定点编辑的过程，用sgRNA可指引内切核酸酶Cas9结合到特定的切割位点。下列说法不正确的是(　　) A．基因定点编辑前，需要设计与片段Ⅱ两端碱基序列配对的sgRNA B．Cas9通过断裂脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键实现对片段Ⅱ切除 C．通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因的功能 D．通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因不是等位基因 答案　D 解析　sgRNA可指引内切核酸酶Cas9结合到特定位点进行切割，因此基因定点编辑前需要设计与被切割基因的两端碱基序列配对的sgRNA，A正确；Cas9切断的是DNA片段，所以Cas9切断的是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，来实现对片段Ⅱ切除，B正确；通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因原有的功能，C正确。 5．(2024·辽宁沈阳二中模拟)下列对DNA相关实验的叙述，错误的是(　　) A．可利用DNA不溶于酒精的特点来提取DNA B．可利用洋葱研磨液离心后的沉淀物来提取DNA C．PCR中通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 D．琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时，需将核酸染料加入琼脂糖溶液中 答案　B 6．(2024·辽宁沈阳模拟)PCR又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是(　　) A．以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行 B．耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸 C．反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步 D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 答案　B 7．基因工程中要使目的基因在受体细胞中稳定存在并能够表达和发挥作用，需要选择合适的载体。下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 答案　D 解析　在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点，具有标记基因等特点的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误。 二、不定项选择题(每题给出的四个选项中，有的只有一个选项符合题目要求，有的有多个选项符合题目要求) 8．B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，正确的是(　　) 注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。 A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录 B．可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列 C．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上 D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光 答案　ABD 解析　启动子是与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；从图中可以看出，卡那霉素抗性基因位于T­DNA区域外，不会整合到水稻细胞染色体DNA上，检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该在培养基中加入潮霉素，C错误；由于Luc基因随目的基因导入了卵细胞，Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。 9．(2024·湖南常德高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　) A．甲、乙、丙都属于黏性末端 B．甲与乙片段、甲与丙片段可形成重组DNA分子 C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处 D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 答案　BC 解析　甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B错误；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为,因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。 10．(2024·辽宁沈阳高三质量监测)科研人员通过PCR技术获得白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建基因表达载体，培育出在肝细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列相关叙述正确的是(　　) A．将基因表达载体导入受精卵经培育获得转基因小鼠 B．利用PCR技术获得白蛋白启动子需要一种引物 C．通过抗原—抗体杂交技术可检测Cre基因是否完成表达 D．转基因小鼠只在肝细胞中含有Cre重组酶基因 答案　AC 解析　将该表达载体导入受精卵以获得转基因小鼠，A正确；DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA，因此PCR过程中需要添加引物才能完成复制过程，要合成两条子链，需要两种引物，B错误；Cre基因完成表达的产物是蛋白质，故可通过抗原—抗体杂交技术进行检测，C正确。 三、非选择题 11．(2023·全国甲卷，38，改编)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是________________________________________________________________________________________。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是___________________________________　_____________________________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是____________。 (3)目的基因导入酵母细胞后，可通过________检测目的基因是否插入染色体中。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 答案　(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遗传物质，接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒 (2)鉴别受体细胞(酵母菌)中是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因)，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来　RNA聚合酶 (3)PCR等技术 (4)从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，观察是否有杂交带出现。 12．人血清白蛋白(HSA)是由肝脏细胞合成的，具有重要的医用价值，原本只能从血清中提取，现利用基因工程的方法生产HSA。请结合相关知识回答下列问题。 (图甲为获取的含HSA基因的DNA片段及酶切位点；图乙是三种限制酶的识别序列；图丙为质粒结构示意图) (1)科研人员利用人肝细胞中的________构建出cDNA文库，通过该方法合成的DNA含量较少，可通过PCR进行扩增获取较多的DNA分子，根据该基因的序列 (5′－CTAGGTCGAAATTC…TCTCCAACGATCGG－3′)，应选择________作为PCR的引物。 A．引物Ⅰ是5′－CTAGGTCGAAATTC－3′，引物Ⅱ是5′－CCGATCGTTGGAGA－3′ B．引物Ⅰ是5′－CTAGGTCGAAATTC－3′，引物Ⅱ是5′－TCTCCAACGATCGG－3′ C．引物Ⅰ是5′－GATCCAGCTTTAAG－3′，引物Ⅱ是5′－AGAGGTTGCTAGCC－3′ D．引物Ⅰ是5′－GATCCAGCTTTAAG－3′，引物Ⅱ是5′－CCGATCGTTGGAGA－3′ 为使HSA基因能与质粒正确连接，根据图甲、乙、丙，应选择限制酶______________________切割目的基因。 (2)PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法。电泳一段时间后进行检测，若电泳带有________条，且与DNA Marker对比，产物大小正确，表明PCR扩增成功。 (3)目的基因与质粒连接后可以导入到不同的受体细胞中进行表达。若导入到原核生物大肠杆菌中，可用CaCl2处理大肠杆菌，有利于重组质粒的导入。但由于原核细胞中缺少________________等细胞器，不能对表达产物进行加工，可能会影响蛋白质的功能。若将重组质粒导入到真核细胞，如小鼠细胞中，则可避免上述问题的产生。现利用小鼠乳腺作为生物反应器生产该蛋白，可将重组质粒通过________法导入小鼠的________细胞中，然后将转化的细胞进行培养，由于无法进行全体外胚胎培养，________成为胚胎工程中获得转基因小鼠的唯一方法。利用________________技术检测小鼠乳腺分泌物，可以判断目的基因是否表达。 答案　(1)mRNA　A　EcoRⅠ和BamHⅠ (2)1 (3)内质网、高尔基体　显微注射　受精卵　胚胎移植　抗原—抗体杂交 解析　(1)人血清白蛋白(HSA)主要在肝脏中合成，为了获得HSA基因，可从人体的肝脏细胞中提取mRNA，通过反转录获得cDNA(双链)，构建出cDNA文库。根据碱基互补配对原则可知，该基因的两条链序列为 5′－CTAGGTCGAAATTC…TCTCCAACGATCGG－3′、 5′－CCGATCGTTGGAGA…GAATTTCGACCTAG－3′， PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，故引物Ⅰ能与5′－GAATTTCGACCTAG－3′进行配对，为5′－CTAGGTCGAAATTC－3′；引物Ⅱ能与5′－TCTCCAACGATCGG－3′配对，为5′－CCGATCGTTGGAGA－3′，A正确，B、C、D错误。 28 学科网（北京）股份有限公司 $$