小单元3 第35讲 基因工程及生物技术的安全性和伦理问题-【金版教程】2025年高考生物一轮复习创新方案word（新教材，创新版，不定项版）

金版教程　高考科学复习创新方案　生物学（不定项版） 小单元3　基因工程 1．通过资料分析、模拟制作活动，阐明基因工程的原理、基本工具的作用和基本操作程序。 2．举例说明基因工程在生产、生活中的应用，理解科学、技术和社会的互动关系，探讨生物技术的安全与伦理问题。 第35讲　基因工程及生物技术的安全性和伦理问题 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。5.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。6.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。7.举例说出日常生活中的转基因产品。8.探讨转基因技术在应用过程中带来的影响。9.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题。10.分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。11.举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害。12.认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散。 考点一　基因工程的基本工具 1．基因工程 2．限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 3．DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。 (2)类型 常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 [归纳总结]　DNA连接酶、DNA聚合酶、限制酶和解旋酶 种类 作用底物 作用部位 形成产物 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 新的DNA分子 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 含黏性末端或平末端的DNA片段 解旋酶 DNA分子 氢键 单链DNA 4．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” [特别提醒]　在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (选择性必修3 P74拓展应用T2)限制性内切核酸酶SalⅠ和XhoⅠ识别序列与切割位点如图1。用SalⅠ切割目的基因两侧，用XhoⅠ切割载体质粒，再用连接酶处理可形成重组质粒。实验者用2种酶单独切割或同时切割普通质粒和重组质粒，再将产物电泳分离，其结果如图2。下列叙述正确的是(　　) A．SalⅠ切割产生的黏性末端与XhoⅠ切割产生的黏性末端不同 B．根据重组质粒的酶切结果可知有2个目的基因插入重组质粒中 C．重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhoⅠ的识别序列 D．2种酶切后产生的2 kb产物可作为探针筛选含目的基因的受体细胞 答案　C 解析　SalⅠ和XhoⅠ切割产生的黏性末端都是3′—AGCT—5′，A错误；由于用一种酶切割后只有一个片段，用两种酶切割结果显示为两个片段，说明重组质粒上各有一个SalⅠ和XhoⅠ的识别序列，C正确；由C项分析可知，重组质粒上各有一个SalⅠ和XhoⅠ的识别序列，推测XhoⅠ的识别序列在目的基因上，如果插入2个目的基因，则2种酶切后会产生3个片段，B错误；2种酶切后产生的2 kb产物包括目的基因部分片段和载体部分片段，不适合作为探针筛选目的基因，D错误。 1．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是－↓GATC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－G↓GATCC－。根据图示判断下列操作正确的是(　　) A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 答案　C 解析　限制酶Ⅰ的识别序列和切点是－↓GATC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－G↓GATCC－，可知限制酶Ⅰ可以识别并切割限制酶Ⅱ识别的核苷酸序列。由图可知，只有限制酶Ⅰ可以将目的基因切割下来；若用限制酶Ⅰ切割质粒，则GeneⅠ和GeneⅡ均被破坏，使重组质粒无标记基因，则应用限制酶Ⅱ切割质粒，可以保留GeneⅠ，其产生的黏性末端可以与目的基因所在DNA经限制酶Ⅰ切割后产生的黏性末端相连。综上所述，C正确。 2.(不定项)如图为基因表达载体的模式图，下列叙述错误的是(　　) A．构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA聚合酶 B．终止子位于基因的下游，使翻译在所需要的地方停止下来 C．构建成功后可使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代 D．抗生素抗性基因作为标记基因 答案　AB 解析　终止子位于基因的下游，作用是使转录在相应的地方停止，不是使翻译在所需要的地方停止下来，B错误。 借助基因工程生产抑制宫颈癌细胞增殖的药用蛋白，培养科学创新能力以及用生物技术治疗疾病的责任担当 3．PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的RNA，再经逆转录过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。如图为所用载体图谱示意图，质粒DNA含有启动子，启动子作用是________________________________________________。 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT EcoRⅠ G↓AATTC PvitⅡ CAG↓CTG PstⅠ CTGC↓AG KpnⅠ G↓GTACC BamHⅠ G↓GATCC 注：箭头表示切割位点。 (2)构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶，其中，DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。图中限制酶的识别序列及切割位点见表，为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入____________和____________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用____________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 (3)转化前需用________处理大肠杆菌细胞，使其处于________，以提高转化效率。将转化后的大肠杆菌接种在含________的培养基上进行培养。 答案　(1)RNA聚合酶识别结合的位点，驱动目的基因转录出mRNA (2)磷酸二酯键　Pvit Ⅱ　EcoR Ⅰ(两空顺序可颠倒)　T4 DNA连接酶 (3)CaCl2(或Ca2＋)　感受态　氨苄青霉素 解析　(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。目的基因应导入启动子和终止子之间，从图中可知，两者之间存在三种限制酶切割位点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该在扩增的phb2基因两端引入EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列。根据PvitⅡ和EcoRⅠ的酶切序列可知，PvitⅡ切出了平末端，EcoRⅠ切割出黏性末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。 考点二　基因工程基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取(第一步) (1)目的基因 (2)筛选目的基因 (3)获取目的基因的方法 ①人工合成目的基因 ②通过构建基因文库获取目的基因 ③常用PCR特异性地快速扩增目的基因 [特别提醒] 1．在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2．有关引物的注意事项 (1)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 (2)设计引物的依据是：目的基因两端的核苷酸序列。 (3)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需要在引物的5′－端加上限制酶的酶切位点。 (4)使用的一对引物的序列不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列。两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增。 (5)DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3′－端延伸DNA链(DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3′－端的羟基上)，所以PCR需要引物。 [归纳总结]　DNA体内复制与体外复制(PCR技术)条件的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 碱基互补配对 条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料 延伸方向 新链都是从5′－端向3′－端延伸 不同点 解旋方式 90 ℃以上高温解旋 解旋酶催化 场所 PCR扩增仪 主要在细胞核 延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶 温度 控制温度，需要在不同温度下进行 体内温和条件 过程 结果 大量的DNA片段(目的基因) 形成完整的子代DNA 2．基因表达载体的构建(第二步) [特别提醒] 1．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 本质 位置 功能 启动子 DNA片段 目的基因上游 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子 DNA片段 目的基因下游 使转录在所需要的地方停下来 起始密码子 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA首端 翻译的起始信号(编码氨基酸) 终止密码子 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA尾端 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 2．同一种限制酶切割获得的目的基因和载体混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：目的基因自身环化；载体自身环化；目的基因与目的基因连接；载体与载体连接；目的基因与载体连接。“载体—目的基因”产物，目的基因也可能反向连接到质粒上。 3．将目的基因导入受体细胞(第三步) 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞(受精卵) 显微注射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞(原核细胞) Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 4.目的基因的检测与鉴定(第四步) (1)目的 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 (2)目的基因的检测与鉴定方法 类型 检测内容 方法 分子水平 的检测 检测受体细胞的染色体的DNA上是否插入了目的基因 核酸分子杂交、PCR等技术 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交技术 个体生物学 水平的鉴定 检测表达产物是否具有生物学活性(或生物个体是否具有相应性状) 抗性测定、个体性状测定等 [特别提醒]　如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌 落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 5．DNA的粗提取与鉴定 [特别提醒] 1．如果植物材料不易充分研磨，可以适当加入纤维素酶处理材料。 2．利用DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同的原理，可以使用不同浓度的NaCl溶液粗提DNA。 6．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (选择性必修3 P83概念检测T1)科学家对北极比目鱼的抗冻蛋白基因的结构已经非常明确，将其转入番茄后，使番茄的耐寒能力大大提高。下列有关叙述错误的是(　　) A．以抗冻蛋白基因的mRNA作为模板进行PCR扩增，可获得大量的目的基因 B．抗冻蛋白基因上游可以构建受低温因素影响的诱导型启动子 C．该抗冻蛋白基因结构已知且功能清晰，能进行较为有效的筛选 D．鱼和番茄的基因能拼接成功说明二者的DNA分子空间结构是相同的 答案　A 解析　以抗冻蛋白基因作为模板进行PCR扩增，可获得大量的目的基因，A错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，抗冻蛋白基因上游可以构建受低温因素影响的诱导型启动子，B正确。 题型一　基因工程的基本操作程序 1．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　　) A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连 C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16 答案　D 解析　用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。 2．(不定项)(2023·北京东城模拟)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作与实验目的相符的是(　　) A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因 B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 答案　ABD 解析　由图可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，A正确；图中质粒与GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，B正确；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，C错误。 3．(2024·大连测试)某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。回答下列问题： 注：LacZ基因编码产生的β­半乳糖苷酶可以分解X－gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。 (1)制备重组质粒时常用同种限制酶的原因是能产生____________。为了使质粒与目的基因连接形成重组质粒，还需要在混合物中加____________。 (2)题图所示培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要添加__________________，以便筛选导入目的基因的大肠杆菌。 (3)为了使大肠杆菌处于一种易于________________的生理状态，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞。 (4)将质粒和目的基因的混合物与上述处理后的大肠杆菌混匀，制备转基因大肠杆菌，取0.1 mL上述溶液，采用____________法接种于培养基表面，在37 ℃下倒置培养16 h。经培养后，分别统计转基因大肠杆菌的菌落数和总菌落数，并计算转化效率。理论上转基因受体菌的菌落呈现________色，原因是_________________________________________________________ _______________________________________________。实验中实际转化效率介于50%～85.7%之间，推测其原因可能与____________________________有关。 答案　(1)相同(黏性)末端　DNA连接酶 (2)氨苄青霉素、X－gal (3)吸收周围环境中DNA分子 (4)稀释涂布平板　白　目的基因的插入，使LacZ基因不能正常表达，不能形成β­半乳糖苷酶，底物X－gal也就不会被分解　重组质粒的形成效率和导入效率 解析　(2)因质粒上含有氨苄青霉素抗性基因以及LacZ基因，氨苄青霉素抗性基因为标记基因，LacZ基因能表达β­半乳糖苷酶，β­半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，而导入目的基因后，LacZ基因被破坏，不能表达β­半乳糖苷酶，底物X－gal也就不会被分解，菌落为白色。故培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要添加氨苄青霉素、X－gal，以便筛选导入目的基因的大肠杆菌。 (4)实验中实际转化效率介于50%～85.7%，可能与重组质粒的形成效率和导入效率有关。影响重组质粒形成效率的因素有很多，如插入基因和质粒的浓度、限制酶和DNA连接酶的活性、反应时间等。影响重组质粒导入受体细胞效率的因素也有很多，如重组质粒的浓度、受体菌的状态和密度、转化时间等。 题型二　DNA的粗提取与鉴定 4．下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验的原理的叙述，错误的是(　　) A．利用DNA不溶于酒精溶液，而某些蛋白质能溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离 B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离 C．在用预冷的酒精沉淀DNA时，要用玻璃棒沿一个方向搅拌，防止DNA断裂 D．利用DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液，可将提取的丝状物或沉淀物溶解于NaCl溶液中 答案　B 解析　高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在60～80 ℃发生变性，DNA在80 ℃以上变性。 5．多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是(　　) A．研磨液可通过离心去除固体杂物 B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色 答案　C 题型三　DNA片段的扩增及电泳鉴定 6．人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法错误的是(　　) A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关 C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物 D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查 答案　A 解析　PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。 7．(不定项)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号模板为转基因植株的DNA，10号使用蒸馏水代替模板DNA。据此做出分析不合理的是(　　) A．PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达 C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 答案　B 解析　3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A不符合题意；3号PCR结果包含250～500 bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B符合题意；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C不符合题意。 借助基因工程修复重金属污染土壤，培养用生物技术保护环境的责任担当意识 8．(2020·北京等级考)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　) A．①＋③ B．①＋② C．③＋② D．③＋④ 答案　B 解析　PCR扩增时，由于子链延伸方向为5′－端到3′－端，因此应在模板DNA两条链的3′－端分别设计一个引物，A错误；为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者扩增获得的DNA片段只要既包含外源高效启动子序列又包含HMA3基因的序列，便可在检测是否有HMA3基因的同时，又可排除内源HMA3基因的干扰，若用③＋②或③＋④引物组合进行PCR扩增，扩增获得的HMA3基因不包含外源高效启动子序列，C、D错误；若用①＋②或①＋④引物组合进行PCR扩增，获得的DNA片段符合要求，B正确。 考点三　基因工程的应用和蛋白质工程 1．基因工程的应用 (1)农牧业方面 (2)医药卫生领域 (3)食品工业方面 (4)其他方面 培育出可降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染，利用经过基因改造的微生物来生产能源等。 2．蛋白质工程 3．蛋白质工程与基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 区别 过程 预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 筛选获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程 1．(选择性必修3 P91相关信息)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为______________。 答案　基因工程菌 2．(不定项)(选择性必修3 P96拓展应用)T4溶菌酶来源于T4噬菌体，是重要的工业用酶。科学家通过一定技术使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸(异亮氨酸的密码子是AUU、AUC、AUA，半胱氨酸的密码子是UGU、UGC)，于是在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而使T4溶菌酶的耐热性得到了提高。对上述过程的叙述正确的是(　　) A．对T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴 B．上述过程通过直接改造T4溶菌酶mRNA上的2个碱基实现 C．参与新的T4溶菌酶合成的tRNA种类可能不变 D．改造后的T4溶菌酶肽键数不变，二硫键的作用类似于DNA中的氢键 答案　ACD 解析　对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的，故对T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴，A正确；蛋白质工程直接改造的对象为基因，B错误；改造前组成T4溶菌酶的氨基酸中就含有半胱氨酸，改造后组成T4溶菌酶的氨基酸中也可能仍含有异亮氨酸，因此参与其合成的tRNA种类可能不变，C正确；改造后的T4溶菌酶替换了一个氨基酸，氨基酸总数不变，且发生替换的两个氨基酸R基上都不含羧基或氨基，所以肽键数不变，二硫键使T4溶菌酶的耐热性提高；DNA分子中氢键越多，热稳定性越强，二者作用类似，D正确。 题型一　基因工程的应用 1．(2023·长沙市质检)红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是(　　) A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶 B．构建的重组表达载体中终止密码子的作用是终止转录过程 C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术 D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得 答案　C 解析　过程①构建基因表达载体，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与，A错误；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测，C正确；乳腺生物反应器是将含人EPO基因的基因表达载体转入雌性哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，D错误。 2．(2023·韶关模拟)我国科学家黄三文团队通过基因编辑技术培育出二倍体自交系和杂交优势显著的杂交马铃薯品系“优薯1号”，突破了百年来马铃薯自交不亲和，薯块只能无性繁殖的难题。如图是科学家用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因的示意图。 (1)据图分析CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA引导Cas9蛋白到____________________进行切割。已知CRISPR/Cas9仅存在于原核生物中，故需借助________技术才能在马铃薯细胞中发挥作用。Cas9蛋白和向导RNA结合形成的复合物能切割DNA，从功能上来看该复合物相当于基因工程中的限制酶，CRISPR/Cas9打破了限制酶______________________________的局限性。所以在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用________(填“相同”或“不同”)的向导RNA。 (2)敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因后可让该植株自交观察是否产生种子来检测其作用效果，这属于____________水平的鉴定。 (3)基因编辑技术比传统的基因工程技术更准确，目的性更强。通过上述材料，推测利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除的应用价值可能有________________________ __________________________________(答出一点即可)。 答案　(1)一个特定的基因位点　转基因　只能识别一种特定的核苷酸序列　不同 (2)个体生物学 (3)进行基因治疗、研究基因功能、构建疾病研究动物模型等 有关基因工程应用的四个易错点 (1)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。 (2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。 (3)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。 (4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，且个体本身的繁殖速度应较快，同时泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。 题型二　蛋白质工程 3．(不定项)天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射后往往要逐渐解离为单体，才能发挥作用，在一定程度上延缓了疗效。科学家利用蛋白质工程(基本思路见下图)研发出速效胰岛素，已在临床上广泛应用。下列有关叙述正确的是(　　) A．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟 B．从六聚体胰岛素解离为单体形式是将胰岛素水解为氨基酸 C．利用基因工程和蛋白质工程生产胰岛素都经历①②过程 D．利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从推测a入手 答案　CD 解析　当前限制蛋白质工程发展的关键因素是蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往很复杂，人们对蛋白质的高级结构了解太少，A错误；由题干信息可知，经过蛋白质工程改造后，发挥作用的仍是胰岛素分子，所以从六聚体胰岛素解离为单体形式是将六个胰岛素形成的六聚体水解为单个胰岛素的过程，未将胰岛素水解为氨基酸，B错误；蛋白质工程中，首先根据预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构，因此利用蛋白质工程生产速效胰岛素要从推测a(蛋白质)入手，D正确。 4．(2023·天津十二校模拟)乳酸菌无氧呼吸过程中，第一阶段产生的丙酮酸会在乳酸脱氢酶(LDH)的催化下产生乳酸，科学家通过改造乳酸脱氢酶(LDH)，能够高效地生产高纯度的苯乳酸。 (1)科学家拟改造LDH基因成为mLDH基因，需将LDH第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，可用于生产苯乳酸。 ①先将LDH基因片段连入载体中，形成环状质粒，如图。 注：a.方框中“GTA”转录出的UAC是酪氨酸的密码子。 b．亮氨酸的密码子为CUX(X可为任意碱基)、UUA、UUG。 将突变后的序列设计在引物1中，以环状质粒为PCR的________，再向体系中加入四种脱氧核苷酸(dNTP)、__________________酶、________以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因，PCR产物的序列便引入了预期的突变。下列引物序列中符合引物1要求的有________、________。 A．5′－TGACTGACTAACACTCGGAC－3′ B．5′－TGACTGACAACCACTCGGAC－3′ C．5′－TGACTGACGATCACTCGGAC－3′ D．5′－TGACTGACGAGCACTCGGAC－3′ ②上述PCR产物为________状DNA分子，改造后的LDH基因序列位于PCR产物的两侧，需要用________酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。 (2)产生苯乳酸的过程还需FDH酶参与，现需要构建同时含有mLDH、FDH的基因表达载体。根据如图信息，先用限制酶________和________切割质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物，再用限制酶________________切割质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。 (3)上述科学实践属于生物工程中的________工程。 答案　(1)①模板　耐高温的DNA聚合　引物2　A　D ②链　DNA连接 (2)NdeⅠ　XhoⅠ　NcoⅠ和BamHⅠ (3)蛋白质 解析　(1)①分析题意可知，科学家拟改造LDH基因，将突变后的序列设计在引物1中，以环状质粒为PCR的模板，加入四种游离的脱氧核苷酸(dNTP)、耐高温的DNA聚合酶、引物2以及碱基替换后的引物进行扩增LDH基因。由于亮氨酸的密码子为CUX、UUA、UUG，根据碱基互补配对原则，引物中相同位点(对应题干方框中的“GTA”)能转录出含有相应密码子的只有A和D。②题干中扩增得到的PCR产物为链状DNA分子，需要用DNA连接酶将产物两端连接起来，获得含有mLDH基因的质粒。 (2)分析题图可知，质粒1中的mLDH基因适合用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ切割，质粒2中的FDH基因适合用限制酶XbaⅠ和XhoⅠ或NdeⅠ和XhoⅠ切割，而空载体中限制酶XbaⅠ切割位点位于启动子中，故不宜选用限制酶XbaⅠ。因此，应先用限制酶NdeⅠ和XhoⅠ切割质粒2和空载体，将两种酶切产物连接获得连接产物，再用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ切割质粒1和上一步中的连接产物，连接获得基因表达载体。 (3)题干的科学实践中，先设计需要的蛋白质再改造出相应的基因，属于生物工程中的蛋白质工程。 借助蛋白质工程干扰某些病毒感染以及治疗血友病的实例，培养用技术为人类健康服务的责任担当意识 5．某病毒通过表面刺突蛋白(S蛋白)的活性域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白的RBD紧密结合，以干扰该病毒的感染。下列叙述不合理的是(　　) A．生产LCB1用到了基因工程的操作技术 B．可直接从细胞中获取基因用于LCB1的生产 C．LCB1的结构可能与S蛋白的抗体有相似之处 D．S蛋白的RBD结构可以为设计LCB1提供信息 答案　B 解析　由题意可知LCB1是一种自然界不存在的蛋白质，故不能从细胞中获取相应基因，B错误；S蛋白的抗体能与S蛋白特异性结合，而根据题干可知LCB1可与S蛋白的RBD紧密结合，说明LCB1的结构可能与S蛋白的抗体类似，C正确；由于LCB1可与S蛋白的RBD紧密结合，故LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计，D正确。 6．(不定项)FⅧ基因主要在肝脏中表达，控制合成凝血因子(FⅧ)。若使FⅧ第309位的丙氨酸替换为丝氨酸，可增加FⅧ的分泌。A型血友病是由于FⅧ基因突变导致FⅧ含量降低或功能异常的疾病。下列叙述正确的是(　　) A．上述得到高分泌量的FⅧ的操作过程属于蛋白质工程 B．构建基因表达载体时应将编辑后的FⅧ基因连接于肝脏细胞特异性启动子下游 C．以腺病毒为载体将编辑后的FⅧ基因插入到肝细胞核基因组可对A型血友病患者进行治疗 D．为了检测编辑后的FⅧ基因是否成功表达，可以从血液中提取蛋白质进行抗原—抗体杂交 答案　ABCD 解析　上述通过基因工程手段改造已有基因得到高表达凝血因子的过程属于蛋白质工程，A正确；选择肝细胞特异性的启动子，可使FⅧ基因表达严格限于肝细胞，B正确；将编辑后的FⅧ基因插入到肝细胞基因组并成功表达属于体内基因治疗，C正确；编辑后的FⅧ基因表达的凝血因子与患者体内遗传凝血因子不同，所以可以从血液中提取蛋白质进行抗原—抗体杂交，检测编辑后的FⅧ基因是否成功表达，D正确。 考点四　生物技术的安全性和伦理问题 (选择性必修3 P110拓展应用)某科研小组把人的诱导多能干细胞注入猪的早期胚胎中，成功培育出人猪嵌合体胚胎，并在猪体内孕育了3～4周后才终止妊娠。下列有关说法错误的是(　　) A．实验过程需要利用体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术 B．诱导多能干细胞可以由成体的成纤维细胞转化而来 C．若成功培育出“人猪嵌合体”将面临巨大的伦理道德挑战 D．该研究为在动物体内培育出可供移植的人类器官提供了可能 答案　A 解析　实验过程未使用体外受精技术，A错误。 1．转基因抗虫棉的安全性问题是社会关注的热点，下列叙述正确的是(　　) A．需要积极推广转基因抗虫棉，这样能够杀死啃食棉花的所有昆虫 B．若保证抗虫基因均来自自然界，则培育出的转基因抗虫棉不会有安全问题 C．转基因抗虫棉周围种植非转基因棉花，可有效降低棉铃虫抗性基因的突变率 D．将目的基因导入棉花体细胞的叶绿体中，可防止花粉传播造成的基因污染 答案　D 解析　将目的基因导入受体细胞的叶绿体中，由于叶绿体的遗传是细胞质遗传，精子中主要是细胞核，所以可防止花粉传播造成的基因污染，D正确。 2．研究人员利用CRISPR基因编辑技术成功修复了人类早期胚胎中与肥厚性心肌病相关的基因MYBPC3的突变，且定向非常精确，未出现“脱靶”效应。这项研究在攻克用基因组编辑技术治疗人类遗传病的若干技术问题的同时，也引起了一些伦理方面的争论。下列相关叙述错误的是(　　) A．运用该技术编辑少量的细胞就可以对遗传病进行治疗 B．运用该技术可能诱发基因歧视等诸多社会不公平现象 C．要在清晰地了解转基因技术的原理和操作规程的基础上，讨论转基因技术的相关问题 D．随着该技术的成熟，可以设计“完美婴儿”，促进人类发展和进步 答案　D 3．(不定项)(2023·北京市房山区高三上学期期末)治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后的免疫排斥反应具有重要意义。流程图如下，相关叙述正确的是(　　) A．重组细胞C的获得利用了体细胞核移植技术 B．胚胎干细胞通过分裂和分化产生移植所需的器官 C．获得的组织器官移植给个体B不发生免疫排斥反应 D．治疗性克隆属于无性生殖，生殖性克隆属于有性生殖 答案　ABC 解析　因为个体B是供核的一方，和克隆的组织器官的细胞核遗传物质相同，因此获得的组织器官移植给个体B一般不发生免疫排斥反应，C正确；克隆是无性生殖，治疗性克隆和生殖性克隆都属于无性生殖，D错误。 借助基因工程进行水体中污染物的检测，培养保护环境的意识，提高社会责任意识 4．水中雌激素类物质(E物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。斑马鱼的肌细胞、生殖细胞等均存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种快速的水体E物质监测方法。下列分析错误的是(　　) A．将GFP基因表达载体导入斑马鱼受精卵的最常用方式是显微注射法 B．GFP基因表达时需要消耗脱氧核苷酸、氨基酸和酶以及能量 C．在被E物质污染的水体中转基因斑马鱼的幼体会显绿色 D．转基因斑马鱼逃逸可能带来生物安全问题 答案　B 解析　基因表达包括转录和翻译，前者需要核糖核苷酸，后者需要氨基酸，它们都需要酶和能量，B错误。 借助“人兽嵌合体”的培育，建立生命伦理观 5．(不定项)在权威学术期刊《细胞》上曾发表相关文章，宣布全球首个人—猴嵌合体胚胎出世。研究者首先使猴子胚胎中器官发育所需的基因失去活性，然后注入人体干细胞，利用研究组新近开发的猴子胚胎体外培养体系，使这些胚胎的存活时间达到了20天，操作如图所示。下列相关叙述不正确的是(　　) A．①代表人体的干细胞，体外培养时需要提供充足的营养和稳定的内环境 B．嵌合体胚胎继续发育的话，③代表的细胞将来发育成胎膜和胎盘 C．实验中用到了动物细胞培养、早期胚胎培养、胚胎移植等技术 D．嵌合体的出现可能会带来伦理争议，它一定会导致人类和动物之间的界限模糊 答案　ACD 解析　内环境指人体的细胞外液构成的液体环境，动物细胞培养时需要稳定的环境条件，A错误；该实验中未用到胚胎移植，C错误。 1．(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案　C 解析　用酶3切割质粒和目的基因产生的是平末端，而E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。 2．(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案　D 解析　若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，不会破坏四环素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。 3．(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 答案　B 解析　低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 4．(2023·全国乙卷，38，改编)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是______________________________________________ __________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是___________________ _____________________________________________________。 (2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是______________________________________________________________ __________(答出1点即可)。 (3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是___________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)终止子　启动子　被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来 (2)密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同 (3)获取YFP基因并构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入真核细胞，检测其是否会发黄色荧光 解析　(1)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的下游，也是一段有特殊结构的DNA短片段。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，该题中的氨苄青霉素抗性基因就可以作为这种基因。 (2)结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同。 (3)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。 5．(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 答案　(1)RNA聚合酶　标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或F1和R2)　a链 (3)J－V5融合蛋白　不是 解析　(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体，需要有复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。 (2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2、R1或F1、R2，若选用引物F1、R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′－端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′－端，引物要与DNA的3′－端互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。 (3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J－V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 6．(2022·广东，22)“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等——碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________________________________，终止子的作用是______________________________________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_________________________________________________________________________ _______________________________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________________________________ ______________________________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 答案　(1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长；酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量 (4)废物的资源化　既可以获得化工产品，还可以消耗工业废气中的二氧化碳 解析　(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶才能从引物的3′－端延伸子链。 (3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，会消耗大量能量和物质，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。 (4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等——碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅获得化工产品，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 7．(2022·湖南，22，节选)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题： (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是____________________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有____________ ____________________、____________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是____________。 答案　(1)多肽链　mRNA　密码子的简并性 (2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA半保留复制 解析　(1)蛋白质工程流程图中物质a是具有特定氨基酸序列的多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。 8．(2020·山东等级考改编)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 (1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________ ______________。 (2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________ ____________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是____________________________。 (3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(WxmRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是______________________________________________。 (4)各品系WxmRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________。 答案　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3　品系3的WxmRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 解析　(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接。 (2)启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平，在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中的编码区，编码区中不包括启动子序列，因此3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列不发生改变。 9．(2020·天津等级考节选)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。 据图回答： (1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。 (2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________。 A．引入短肽编码序列不能含终止子序列 B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列 C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列 D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性 (3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。 答案　(1)6　(2)ABCD　(3)3 解析　(1)从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由图可知这7个核苷酸应该存在于6个密码子中，所以该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。 (2)要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选A、B、C、D。 (3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。 课时作业 一、单项选择题(每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的) 1．(2024·九省联考甘肃)胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是(　　) A．用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步 B．构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 C．大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体 D．抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞 答案　D 解析　抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成胰岛素，若抗原—抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。 2．(2023·山东滨州模拟)构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5′—P变成5′—OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′—OH与3′—OH不能连接而形成切口(nick)。下列说法错误的是(　　) A．经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化 B．外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理 C．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端 D．重组DNA经过2次复制可得到不含切口的子代DNA 答案　B 解析　将经过碱性磷酸单酯酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′—OH与3′—OH不能连接而形成切口，因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；DNA进行半保留复制，1个重组DNA经过2次复制，可得到2个不含切口的子代DNA，D正确。 3．天然乳酸菌生产乳酸的能力不足以满足人类的需求，现将与乳酸生成有关的LDH酶基因导入酵母菌中，使酵母菌具有生产乳酸的能力。图1为两种限制酶的识别序列及切割位点，图2为LDH酶基因所在的环状DNA，图3是可作为基因工程载体的质粒，Amp为青霉素的抗性基因。以下说法错误的是(　　) A．LDH酶基因的双螺旋结构是其能在酵母菌中成功转化的结构基础 B．用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制酶可避免反向连接和目的基因自身环化 C．由图可知，应选择质粒2作为载体才能获得符合需求的转基因酵母菌 D．可通过抗原—抗体杂交技术检测LDH酶基因在酵母菌内是否成功表达 答案　C 解析　结合图2可知，LDH酶基因上游存在EcoRⅠ识别位点，下游存在BamHⅠ识别位点，目的基因应正确插入启动子和终止子之间，才能保证基因的正确表达，故切割的LDH酶基因应选用图3中的质粒1，C错误。 4．(2024·朝阳期末)下图是利用猪唾液腺生产大量高纯度人神经生长因子(hNGF)的流程，相关说法错误的是(　　) A．培养猪细胞A和重构胚胎通常需在培养液中加入血清 B．培育转基因猪D的过程涉及核移植、胚胎移植等技术 C．转基因猪D的遗传性状由A和C的遗传物质决定 D．猪唾液腺作为生物反应器具有不受性别限制的特点 答案　C 5.(2024·湖南怀化高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是(　　) A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变 C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链 D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程 答案　C 解析　单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B正确；除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。 6．(2023·福建泉州模拟)中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境，以下说法错误的是(　　) A．该工程可以定向改变蛋白质分子的结构 B．改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的 C．改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种 D．改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质 答案　D 解析　蛋白质工程改造的是基因，基因可以遗传给子代，因此改造后的中华鲟的后代也具有改造的蛋白质，D错误。 7．下列应用实例最可能造成生物技术安全性与伦理问题的是(　　) A．对先天性免疫缺陷症患儿的免疫细胞进行基因编辑，然后回输给患儿进行治疗 B．利用干细胞培养出具有单个腔室结构的迷你跳动心脏，以增加器官移植供体来源 C．利用人体的成纤维细胞转变成iPS细胞，进而利用iPS细胞治疗阿尔茨海默病 D．利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期得到身高标准和智力超群的“完美婴儿” 答案　D 解析　利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期得到身高标准和智力超群的“完美婴儿”，已经涉及新生命的诞生，会造成生物技术安全与伦理问题。 二、不定项选择题（每题给出的四个选项中，有的只有一个选项符合题目要求，有的有多个选项符合题目要求） 8．(2024·青岛模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶分别处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是(　　) A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解 B．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相同的电极移动的原理 D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 答案　CD 解析　DNA在冷酒精中溶解度很低，提取DNA时加入酒精，是为了让DNA析出、蛋白质等物质溶解，A正确；将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水浴条件下进行鉴定，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，B正确；DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理，C错误；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。 9．进行基因编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某二倍体生物B基因进行定点编辑的过程，用sgRNA可指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的切割位点。下列说法正确的是(　　) A．基因定点编辑前，需要设计与片段Ⅱ两端碱基序列配对的sgRNA B．Cas9通过断裂脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键实现对片段Ⅱ切除 C．通过分析破坏B基因后的生物体功能变化，可推测B基因的功能 D．通过基因编辑技术改造后的B基因与编辑前的B基因不是等位基因 答案　ABC 10．B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，正确的是(　　) 注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。 A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录 B．可利用水稻体细胞和精子中的RNA构建cDNA文库，从中获得B基因中编码蛋白的序列 C．过程②在培养基中加入卡那霉素不能检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上 D．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光 答案　ABCD 解析　启动子是与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；从图中可以看出，卡那霉素抗性基因位于T­DNA区域外，不会整合到水稻细胞染色体DNA上，检测T­DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应该用PCR等技术，C正确；由于Luc基因随目的基因导入了卵细胞，Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D正确。 三、非选择题 11．R­7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA，可与某些mRNA尾端的一段非编码序列(3′­UTR)结合，进而影响基因的表达。为研究R­7是否影响家蚕基因B(调控家蚕眼睛发育)的表达，科研人员将基因B中对应3′­UTR的DNA片段与荧光素酶基因重组，如图1所示。将该重组载体导入家蚕胚胎细胞并检测其表达情况，结果如图2所示。请回答下列问题： (1)要想短时间内获得大量目的基因，需要用到的技术是________________，该技术的原理是______________。若将一个含目的基因的DNA扩增n代，则共需消耗________对引物。 (2)图1中对应3′­UTR的DNA片段应插入到位点________，原因是__________________ ______________________________________。基因工程的核心步骤是__________________，其目的是_______________________________________________________________。 (3)科研人员从图2所示的实验组和对照组细胞中提取蛋白质，经处理检测后获得相对荧光值(在适宜条件下，荧光素酶可催化荧光素发生氧化反应并发出荧光)。实验组为将重组载体导入含R­7的家蚕胚胎细胞中，对照组1为将含有荧光素酶基因的表达载体(不含对应3′­UTR的DNA片段)导入含R­7的家蚕胚胎细胞中，则对照组2应为____________________________ __________。由结果推知R­7通过________________________________________________进而抑制基因B的表达。 答案　(1)PCR扩增技术　DNA半保留复制　2n－1 (2)2　目的基因应插入到启动子与终止子之间，且不能破坏荧光素酶基因　基因表达载体的构建　使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用 (3)将重组载体导入不含(或去除)R­7的家蚕胚胎细胞中　与基因B所转录的mRNA的3′­UTR结合 解析　(1)短时间内获得大量目的基因需用到的技术是PCR扩增技术，该技术原理是DNA半保留复制。若对一个含基因B的DNA扩增n代，共得到2n个DNA，净增DNA为2n－1，因此共需消耗的引物为2n－1对。 (3)由图2可知实验组的相对荧光值较低，而对照组1和对照组2的相对荧光值较高。又因为对照组1的处理为将含有荧光素酶基因的表达载体(不含对应3′­UTR的DNA片段)导入含R­7的家蚕胚胎细胞中，说明没有3′­UTR片段的细胞中荧光素酶基因正常表达，相对荧光值较高。实验组为将重组载体导入含R­7的家蚕胚胎细胞中，相对荧光值较低，说明R­7抑制了荧光素酶基因的表达。由此可以推测对照组2的处理应为将重组载体导入不含(或去除)R­7的家蚕胚胎细胞中。R­7通过与基因B所转录的mRNA的3′­UTR结合进而抑制基因B的表达。 12．(2024·九省联考河南)水稻胚乳可作为生物反应器用于开发功能性产品。从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，研究小组设计其预期的结构，推测应有的氨基酸序列，合成新的基因X。利用PCR技术对其进行扩增并连接启动子1，形成Z片段。把Z片段插入Ti质粒的T­DNA中，将构建好的基因表达载体导入水稻细胞完成转化，在胚乳中获得相应蛋白，最终将蛋白进一步加工为植物源猪瘟疫苗。相关信息如图所示。 回答下列问题。 (1)研究小组通过PCR扩增Z片段，延伸过程中，4种脱氧核苷酸在________________催化作用下合成新的DNA链。酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。为构建基因表达载体，选择限制酶Hind Ⅲ和________进行切割，可使Z片段插入T­DNA的效率最高。为使基因能够正常表达，质粒上的N和J应都为________。 (2)为获得含蛋白X的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成________，然后通过________的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其________形成具有根、茎、叶的完整植株。 (3)为验证水稻中目的基因X是否表达(转录和翻译)，分子水平上的检测方法有____________ __________________________________________________________(答出2点即可)。 (4)从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，合成基因X，进而得到猪瘟疫苗的过程属于________工程的范畴。相较于大肠杆菌，水稻胚乳作为生物反应器制备疫苗的优势及理由有______________________________________________________________________(答出1点即可)。 答案　(1)耐高温的DNA聚合酶　EcoRⅠ　终止子 (2)愈伤组织　农杆菌　再分化 (3)通过PCR技术检测水稻细胞中目的基因X是否转录出了mRNA；从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出了蛋白质 (4)蛋白质　水稻胚乳细胞比大肠杆菌多了复杂的生物膜系统，可对基因X的表达产物进行正确地加工与折叠，产生具有生物活性的重组蛋白质 解析　(1)PCR是根据DNA半保留复制的原理在体外进行DNA复制的技术，体外DNA复制过程中用超过90 ℃的温度处理DNA使其解旋，因此，在子链延伸过程中，4种脱氧核苷酸要在耐高温的DNA聚合酶催化作用下合成新的DNA链。依题意，酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。XbaⅠ与HindⅢ识别序列有重叠，不符合题目要求。EcoRⅤ所切末端为平末端，连接效率低，不符合题目要求。EcoRⅠ识别序列与HindⅢ识别序列无重叠，产生的切口是黏性末端，连接效率相对平末端高。为使基因能够正常表达，基因结构的上游和下游各有启动子和终止子，因此，N和J应都为终止子。 45 学科网（北京）股份有限公司 $$