3.2.3 探究.实践DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

探究・实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定 目录 一、实验原理 二、材料用具 三、实验步骤 四、注意事项 五、结果分析 （一）PCR扩增DNA片段的原理： 一、实验原理 1.PCR利用了热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解旋和结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 2.PCR扩增DNA片段还利用了半保留复制的原理。 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 延伸 复性 低温 中温 （二）DNA片段电泳鉴定的原理： 1.分离：DNA分子具有可解离基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 2.鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外光下被检测出来。 3.纯化：电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。 一、实验原理 一、实验原理 （三）影响DNA迁移速率的因素： 1.凝胶浓度：琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。 2.DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。 电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。 3.DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 二、材料与用具 （一）用具: 1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增) 2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所) 3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等) 二、材料与用具 （一）用具: 1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增) 2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所) 3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等) 二、材料与用具 （一）用具: 1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增) 2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所) 3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等) 二、材料用具 （二）试剂: 1.4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL PCR反应体系的配方 二、材料用具 （二）试剂: 2.电泳缓冲液(TAE或TBE)、凝胶载样缓冲液(内含指示剂——溴酚蓝)、琼脂糖和核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)等。 EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物在紫外线激发下，发射出红橙色荧光。EB-DNA复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗略地估计样品中DNA含量。（EB有剧毒） 电源 + 电泳槽 琼脂糖凝胶 样品孔 缓冲液 — 三、实验步骤 视频来源：学科网https://www.zxxk.com/soft/39018533.html 三、实验步骤 （一）DNA片段的扩增过程 步骤 操作 加样 按配方加样 离心 将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部，以提高反应速率。 反应 设置好PCR仪循环程序，将含有反应液的微量离心管放入PCR仪中反应 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 三、实验步骤 （二）PCR扩增产物电泳鉴定的过程 制胶 根据