2.2.2 HAT选择培养基的筛选原理-2023-2024学年高二下学期生物学选择性必修三

HAT选择培养基的筛选原理 先看一道试题： 杂交瘤细胞制备示意图如下。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT － ），在 HAT 筛选培养液中不能正常合成 DNA ，无法生长。据图回答下列问题： （ 1 ）细胞融合的原理是 _____________ ，诱导动物细胞融合特有的方法是 __________________________ 。 （ 2 ）选择免疫 B 细胞是因为其 _____________ ，且使杂交瘤细胞能在 HAT 培养液中生存。杂交瘤细胞制备利用了骨髓瘤细胞的 _____________ 特点。杂交瘤细胞具备两种细胞的优势。 （ 3 ）利用杂交瘤细胞生产 _____________ 抗体，还需要进一步的多次筛选，原因是 _____________ 。 （ 4 ）将最终获得的杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到 _____________ 内增殖，一段时间后从相应的材料中获取抗体。 【答案】 细胞膜的流动性 灭活的病毒（或“灭活的仙台病毒”等） 能产生特异性（单一）抗体（但不能无限增殖） （在体外培养条件下）能无限增殖（但不能产生抗体） 单克隆 每一种免疫 B 细胞（浆细胞）只能产生一种抗体，免疫 B 细胞（浆细胞）的种类多，杂交瘤细胞种类多，需要筛选能分泌所需要抗体的细胞 小鼠腹腔 【解析】 据图分析，免疫 B 细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT + ），但不能在体外培养；骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT － ），在 HAT 筛选培养液中不能正常合成 DNA ，无法生长，最后死亡；而 B 细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞在 HAT 培养液中可以存活，据此分析。 （ 1 ）细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性，诱导动物细胞融合的方法有电刺激、聚乙二醇、灭活的病毒（如灭活的仙台病毒），后者是动物细胞融合所特有的方法。 （ 2 ）免疫 B 细胞是 B 淋巴细胞经过某抗原反复刺激后增殖分化形成的，能产生特异性抗体，但不能无限增殖，其具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT + ），使杂交瘤细胞能在 HAT 培养液中生存。制备杂交瘤细胞利用了骨髓瘤细胞能无限增殖的特点，故杂交瘤细胞具备两种细胞的优势。 （ 3 ）由于每一种免疫 B 细胞只能产生一种抗体，而机体产生的免疫 B 细胞的种类多，导致杂交瘤细胞种类也很多，因此利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体时，还需要进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选，才可获得能分泌所需要抗体的杂交瘤细胞。 （ 4 ）将最终获得的杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖，一段时间后从相应的材料中获取抗体。 此题考查HAT筛选杂交瘤细胞。教材没有详细介绍 那么，HAT筛选杂交瘤细胞的原理是什么？ 小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的过程中，有5种细胞存在（未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B淋巴细胞与B淋巴细胞融合的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞、杂交瘤细胞）。正常的B淋巴细胞在培养基中仅能存活5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去；未融合的骨髓瘤细胞则需要筛选去除。 正常细胞的核苷酸合成有两个途径：全合成途径和补救合成途径。要进行D途径，需要叶酸为辅酶；要进行S途径，需要HGPRT和TK两种酶的催化。培养基中添加了氨基蝶呤，因为它是叶酸拮抗剂，所以D途径就被阻断了，而培养基中H、T的存在让S途径成为可能。 但是B淋巴细胞虽然有HGPRT和TK两种酶，但因为是高度分化的细胞，没有增殖能力，所以体外培养一段时间就死亡了；我们选择的瘤细胞，则是HGPRT-和TK-的缺陷型，虽然H、T在，但没有酶所以也死亡；而杂交瘤细胞，则可正常进行S途径，所以得以生存的都是杂交瘤细胞。如下图： HAT培养基中三个字母分别对应于：H：次黄嘌呤。A：氨基碟呤。（注意，不是氨基嘌呤，不少试题和参考书存在错误。）T：胸腺嘧啶核苷。 在HAT培养基上，A（氨基蝶呤）会阻断核苷酸的全合成途径，骨髓瘤就不能合成核苷酸进而合成DNA，不能增殖而被淘汰掉。杂交瘤细胞具有B淋巴细胞的遗传特性，还可以通过补救途径合成核苷酸，进而合成DNA，能在HAT培养基中长期存活与繁殖。 抗体检验的目的，选出产生特定抗体的杂交瘤细胞再进行单克隆培养。 如下图，最上面一行是HAT培养基选择出来的抗体检测阳性的细胞（已经经过第一次抗体检验）。但是因为之前杂交瘤细胞有多种，是异质性的，所以抗体虽为阳性却还不能保证是来自单个细胞，可能会有好几种细胞类型（也称多克隆）。 挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，稀释后进行克隆培养（第二排图）。像上面说的，多孔板每个孔内理论期望值是1个细胞/孔，实际却可能是没有、2个也可能（一般认为0.5-2个/孔）。