2024届高考生物一轮复习：动物细胞融合技术与单克隆抗体、DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定(实验)

第十单元　生物技术与工程 第36讲 基因工程 重组DNA技术的基本工具 01 基因工程的基本操作程序 02 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定(实验) 03 基因工程的应用和蛋白质工程 04 目录 考点三　 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定(实验) 03 DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可溶于2 mol/L的NaCl溶液 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 初步分离DNA和蛋白质 溶解DNA 鉴定DNA 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 （1）实验原理 1、DNA的粗提取与鉴定 ①取材、研磨 称取约30g切碎的菜花 加10mL研磨液充分研磨 研磨目的：破碎细胞，使核物质易溶在研磨液中 （2）实验步骤 1、DNA的粗提取与鉴定 ②过滤获取含DNA的上清液 在漏斗中垫上纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中 在4℃冰箱中放置几分钟后再取上清液。 低温放置的作用可抑制酶的活性以阻止DNA降解及运动，使之易形成沉淀析出。 也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 DNA会吸附在滤纸上，用纱布减少DNA的损失 （2）实验步骤 1、DNA的粗提取与鉴定 ③冷却酒精析出DNA 上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA的降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 （2）实验步骤 1、DNA的粗提取与鉴定 上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 防止将丝状DNA搅碎，不利于DNA絮状物的挑出 ③冷却酒精析出DNA （2）实验步骤 1、DNA的粗提取与鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。 然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 1号试管 2号试管 加入2mol/L NaCl 溶液 5mL 5mL 丝状物(DNA) 不加 用玻璃棒搅拌 无变化 加入二苯胺试剂 4mL 4mL 沸水浴 5min 5min 观察现象 不变蓝 变蓝 加入 丝状物溶解 ④DNA的鉴定 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关 （2）实验步骤 1、DNA的粗提取与鉴定 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合；PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环； ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理 （1）实验基础 2、DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷。 ②迁移动力与方向： 在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 （1）实验基础 2、DNA片段的扩增及电泳鉴定 （2）PCR实验操作步骤 ①用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 ②待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 2、DNA片段的扩增及电泳鉴定 ③参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合 （2）PCR实验操作步骤 2、DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。 ②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适