备课素材：凝胶电泳技术-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

凝胶电泳技术 要研究某种分子,首先需要分离,而分离有技术有多种,如凝胶电泳、离子交换层析、凝胶过滤层析,2019版高中生物学教材中介绍了凝胶电泳技术。在该技术的分离过程中,还需要用染料染色后肉眼观察,则需要PCR技术扩增。 那么,该技术的原理和影响因素有哪些?核酸和蛋白质分离的方法有什么区别? 凝胶电泳可用于分离核酸和蛋白质。操作步骤包括制胶(琼脂糖、TAE电泳缓冲液、核酸染料)、上样(PCR产物、DNA上样缓冲液)两步。为什么需要PCR产物呢?凝胶中的每个条带是特定大小的,所有DNA片段都迁移到凝胶中相同位置的结果。要产生肉眼可见的条带,至少需要约5 10﹣9gDNA。这对大小为3kb的片段而言,相当于大于109的分子。所以,任何特定的DNA片段要在电泳凝胶上产生肉眼可见的条带,必须要有数目众多的拷贝。 1.核酸的分离——琼脂糖凝胶电泳 在DNA分离的该技术中,在先制备一个带槽的凝胶,方法是将加热的(液体)琼脂糖溶液倒进一个插有“梳子”的浅盒子里。待胶凝固后拔去梳子留下长方形的小孔或槽。向胶孔中加入少许DNA,在中性pH下,接通电源使电流通过凝胶。 (1)DNA片段琼脂糖凝胶电泳分离的原理 DNA因骨架上的磷酸而带负电荷,因此向凝胶另一端的阳极(正极)迁移。凝胶能够分离不同大小DNA片段的秘密在于摩擦力。小分子DNA由于与溶剂和凝胶分子间的摩擦力小,因此迁移较快。而大分子DNA受到的摩擦力相对较大,因此迁移较慢。电流根据DNA片段的大小将它们分离开,最大的靠近凝胶顶端,而最小的靠近凝胶底部。最后用荧光染料(如溴化乙锭)对DNA染色,并将凝胶置于紫外灯下检测。以下是某绿色荧光蛋白(GFP)基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图: (2)影响DNA片段琼脂糖凝胶电泳的因素 DNA分子的大小:线性DNA分子的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比。 琼脂糖浓度:若要有效地分离不同大小的DNA,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。 DNA分子的形态:在同一浓度的琼脂糖凝胶中,超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快,线性DNA分子比开环DNA分子快。 电流强度:每厘米凝胶电压不超过5V,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。 任何未知大小的DNA都能与标准DNA片段同时电泳,只要其落在标准DNA片段的范围之内,就能估测其大小。同样,也可用此方法对不同大小的RNA片段进行电泳。 实际上,大分子DNA即使在温和条件下也很容易断裂,如在烧杯中搅拌或移液操作等,产生的剪切力都足以将其打断。分子生物学家还是开发了一种新的凝胶电泳技术——脉冲场凝胶电泳(PFGE),该技术可以分离长达几百万个碱基对的DNA分子。 2.蛋白质的分离——聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳也常用于蛋白质的分离,只是其凝胶介质通常有聚丙烯酰胺制成,因此称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。为了确定某种复杂蛋白质的多肽组成,必须处理蛋白质,以便多肽链或亚基能独立的电泳移动。通常利用去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS)处理蛋白质,使各个亚基变性,不再相互结合。 SDS有两个附加优点: (1)使所有多肽的表面都覆盖上负电荷,从而在电泳时都会往阳极泳动; (2)遮蔽蛋白质亚基的原有电荷,使各亚基在电泳时按分子质量大小而不是原有电荷迁移。小分子多肽容易穿过凝胶上的小孔,因而迁移得较快,而大分子多肽则相对较慢。研究者也经常用还原剂打开亚基间的共价键。 用SDS-PAGE对一组多肽链分离时,每个多肽链都结合了一种染料,以便在电泳时能看到。通常的做法是在电泳后用染料如考马斯亮蓝对所有多肽进行染色。此方法可以用来检测基因的表达产物。 因此,通过凝胶电泳可把各种分子质量的DNA、RNA和蛋白质分离出来。在核酸电泳中常用的凝胶是琼脂糖;而在蛋白质电泳中常用的是聚丙烯酰胺。SDS-PAGE通常是根据分子质量的大小分离多肽的,但有时多肽混合物非常复杂,需要用更好的方法把它们分离开,即双向凝胶电泳。 例、利用多种限制酶切割重组质粒时,得到图1所示电泳图谱,其中Marker为DNA标准样。从图1酶切结果分析,图2中目的基因(长度为2.0 kb)插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是( ) A.①,BamH B.①,EcoR 和Hind C.②,EcoR D.②,EcoR 和Hind 解析:B [分析图1可知,重组质粒被EcoR 酶切后,得到5.8 kb的片段,说明重组质粒中只有一个EcoR 的酶切位点;重组质粒被BamH 酶切后产生3.8 kb和2.0 kb两种片段,说明重组质粒中有2个BamH 的酶切位点;重组质粒被EcoR 和Hind 酶切后,产生4.5 kb和1.3 kb两种片段,说明重组质粒中有EcoR 和Hind 的酶切位点,且两种酶切位点之间的片段为4.5