3.2.1目的基因的筛选与获取 讲义2026-2027学年高二下学期生物人教版选择性必修3

目的基因的筛选与获取 重难点 题型 分值 重点 ①基因工程的基本操作程序 选择题、非选择题 3-5 ②在各项基本操作中的注意事项 难点 ③PCR技术扩增目的基因 ④农杆菌转化法导入受体细胞 走进转基因技术:转基因抗虫棉是将苏云金杆菌的杀虫基因转移到棉花中,使棉花获得了抗棉铃虫的性状,减少了农药的使用,降低了棉铃虫的危害,增加了产量。 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤:目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。首先学习目的基因的筛选与获取。 一、目的基因 在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或者获得预期表达产物等的基因就是目的基因。它主要是编码蛋白质的基因,如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫基因),破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验,将细菌的“杀虫基因”转到棉花里,让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因,Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。 除此之外,在大肠杆菌中表达胰岛素的胰岛素基因、转基因鲤鱼中的生长激素基因等都属于目的基因。 二、筛选合适的目的基因 1. 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行目的基因的筛选是获取目的基因较为有效的方法之一。 在培育抗虫棉之前,人们就对苏云金杆菌制成的生物杀虫剂有广泛的应用,还掌握了Bt基因的序列信息以及该基因的表达产物-Bt抗虫蛋白。在人们对此认识的基础上,Bt基因则成为培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 问题探究:Bt抗虫蛋白会不会对人畜等生物造成影响呢? 提示:当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后,多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合,导致细胞膜穿孔,最后造成虫害死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性,而人和牲畜的胃液呈酸性,肠道细胞也没有特异性受体。因此,不会对人畜产生影响。 2. 通过构建基因文库来获取目的基因 3. 利用PCR获取和扩增目的基因 (1)概念: PCR是聚合酶链式反应的缩写。是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1988年发明,并获得诺贝尔化学奖。 (2)DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 (3)PCR反应需要的条件 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,需提供DNA模板,分别与两条模板链结合的2种引物,4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶;同时通过控制温度使DNA在体外反复进行。 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,因此,PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。通常为20-30个核苷酸。因此进行PCR扩增某目的基因时一定要知道目的基因首位的一段核苷酸序列,以便制备相应的引物。 (3)PCR扩增的过程 ①变性:当温度上升到90 以上时,目的基因DNA受热变性后解为单链。即打开氢键,将双链DNA全部解旋为单链。 ②复性:但温度下降到50 左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA相应互补序列结合,形成部分双链区。 ③延伸:当温度上升到72 左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则进行DNA链的延伸,合成新的DNA链。即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端,如此重复循环多次。 由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板,因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍,即成指数形式扩增,约为2n,其中n为扩增循环的次数。 脱氧核苷酸之间的聚合过程: 一个核苷酸上的磷酸基团上的“-OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水,形成磷酸二脂键,即在相邻的两个脱氧核苷酸的3'和5'碳原子之间形成磷酸二脂键。 DNA分子是由两条反向平行的链组成,即一条链为3'-5',另一条链为5' -3'。如图为待扩增的DNA片段: 加热会将待扩增DNA的全部氢键打开,成为两条单链,引物分别和其中的一条单链的3'端结合,形成部分双链。如图所示: DNA聚合酶的特性: 不能从头合成DNA,只能从DNA的3′端开始延伸DNA链,因此, DNA复制需要引物;当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后, DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链, DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。如图: 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板,经过变性、复性、延伸三步产生第二轮循环的产物;同理,第二轮循环的产物可作为第三轮循环的产物。 上述过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成,完成以后,常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 问题探讨:细胞内DNA的复制和PCR反应扩增DNA的区别是什么? 提示:(1)在细胞内进行DNA复制时,打开氢键的是解旋酶,在PCR反应中打开氢键的条件是高温。 (2)需要的是耐高温的DNA聚合酶,复制过程中不需要DNA连接酶。 (3)在细胞内是DNA复制的过程是边解旋边复制,通过PCR技术扩增DNA时是全解旋再复制。 问题探讨:用PCR技术可以扩增mRNA吗? 提示:PCR技术只增扩增DNA模板,对RNA模板不能直接扩增。 例题1 下列有关PCR技术中引物的叙述,正确的是( ) A. 引物是一小段DNA分子或双链RNA分子 B. 扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目 C. 两种引物之间能够发生碱基互补配对 D. DNA聚合酶只能从引物的5' 端连接脱氧核苷酸 答案:B 解析:本题主要考查与引物相关的知识,难度中等。引物是一小段单链DNA或RNA,可与DNA母链通过碱基互补配对进行结合,A错误;扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目,B正确;引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合,两种引物之间不能发生碱基互补配对,C错误;DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸,D错误。 例题2 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,下列有关PCR过程的叙述,不正确的是( ) A. 变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键 B. 复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D. PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高 答案:C 解析:本题主要考查PCR的过程以及条件,难度中等。PCR技术变性过程中是通过高温破坏DNA分子内碱基对之间的氢键,进而使DNA分子解链,该过程在细胞内是通过解旋酶实现的,A正确;复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的,B正确;PCR反应的产物是DNA,所需原料应为四种脱氧核苷酸,所以,延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种脱氧核苷酸,C错误;PCR过程所需的酶是耐高温的DNA聚合酶,比细胞内DNA复制过程所需的DNA聚合酶的最适温度高,D正确。 例题3 利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( ) A. 用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 B. 设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连 C. 复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D. 第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16 答案:D 解析:本题主要考查PCR反应的过程,难度较大。用PCR方法扩增目的基因时,要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物(两种),但不必知道基因的全部序列,A正确;设计引物时,需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连,B正确;复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合,因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合,进而导致PCR反应得不到任何扩增产物,C正确;DNA复制为半保留复制,第四轮循环即DNA复制4次,共形成24=16个DNA分子,其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B,其余14个DNA分子均含有引物A和引物B,所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16=7/8,D错误。 (答题时间:30分钟) 1. 下列关于目的基因的相关说法正确的是( ) A. 目的基因指的就是能编码蛋白质的基因,比如解毒,抗逆,合成酶等 B. 目的基因可以从自然界已有的物种中分离,也可以用人工方法合成 C. PCR技术扩增目的基因的原理是碱基互补配对原则 D. 已知相应蛋白质的空间结构无法获取目的基因 2. PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同,它们是( ) ①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中,DNA不需要解旋,直接以双链DNA为模板进行复制 A. ③④ B. ①② C. ①③ D. ②④ 3. 下列有关PCR扩增目的基因的叙述,错误的是( ) A. PCR扩增一般需要经历多个循环,每个循环分为变性、复性和延伸3步 B. PCR扩增时,需要向PCR管中加入4种游离的脱氧核苷酸 C. PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶和DNA连接酶 D. PCR扩增区域由2个引物来决定 4. 一种深海火山噬菌体基因组编码的DNA聚合酶(Nrs1DNA聚合酶)识别复制起点后,在解旋酶和DNA结合蛋白的帮助下,能以脱氧核苷酸为原料直接合成子链,完成DNA的单向复制,而真核生物则采取多起点双向复制的方式。下列叙述错误的是( ) A. 单向复制和双向复制都是半保留复制 B. NrS1DNA聚合酶与真核生物的DNA聚合酶结构相同 C. NrS1DNA聚合酶催化DNA复制时不需要引物 D. NrS1DNA聚合酶可以简化PCR过程 5. 多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术。利用PCR技术将某DNA分子进行体外扩增n代的过程中,下列相关叙述正确的是( ) A. 高温解旋过程中,需用到耐高温的解旋酶使氢键断裂 B. 需要消耗脱氧核苷酸合成子链,并需不断添加ATP为反应供能 C. 适温延伸过程中,用的DNA聚合酶在高温下仍保持活性,可以一次加入,不需添加 D. 体外扩增n代的过程中,共有2n+1个引物参与子代DNA分子的合成 6. 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环:90 以上使模板DNA变性、解链 50 下复性(引物与DNA模板链结合) 72 下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是( ) A. 变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,也可利用解旋酶实现 B. 复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C. 延伸过程中需要DNA连接酶、ATP、四种核糖核苷酸 D. PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高 7. PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,使目的DNA得以迅速扩增。其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述错误的是( ) A. PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板 B. PCR技术制备大量DNA时引物要被不断消耗 C. DNA的合成方向总是从子链的3 端向5 端延伸 D. 应用PCR技术与探针杂交技术可以检测特定的基因 8. PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,下列关于该技术的说法错误的是( ) A. PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步 B. PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 C. 扩增过程中,延伸的温度大于复性的温度,而小于变性的温度 D. 引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶从引物的3' 端开始延伸DNA链 9. 图1是生物体内染色体DNA复制示意图,图2是利用PCR技术进行体外DNA扩增过程。请分析并回答下列问题: 图1 图2 (1)图1和图2所示过程均遵循原理。 (2)图1所示DNA复制过程中两条子链的合成方向都是;其中一条子链是不连续合成的,先合成短的DNA片段(称为冈崎片段),再通过的催化形成较长的分子。在PCR过程中无冈崎片段形成的原因是。 (3)图2所示的PCR扩增的3个基本步骤分别是;步骤3需要的酶具有性。 (4)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但的引物需要设定更高的复性温度。 10. 随着研究的不断深入,PCR方法被不断改进,PCR需要模板DNA、引物、脱氧核糖核苷酸和DNA聚合酶、ATP等条件,其简要过程如图所示。请分析回答下列有关问题: (1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增,依据的原理是。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在环境温度的不同,在PCR中先用94 高温处理的目的是。 (2)若将1个DNA分子拷贝10次,则需要在缓冲液中至少加入个引物。 (3)DNA子链复制的方向是,这是由于。 (4)PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利,而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了乙肝病毒(DNA病毒),你认为可以用PCR扩增血液中的。 1. B 解析:本题考查目的基因以及目的基因的获取,难度中等。需要研究的基因称为目的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是起调控作用的因子,A错误;目的基因可以从自然界已有的物种中分离,也可以用人工方法合成,B正确;PCR技术扩增的原理是DNA复制,C错误;已知相应蛋白质的空间结构可根据氨基酸序列推断脱氧核苷酸序列以获取目的基因,D错误。 2. C 解析:本题主要考查PCR反应与DNA复制的差异,难度中等。PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA,①正确;PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶,②错误;PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的,③正确;PCR过程中,DNA不依靠解旋酶解旋,而是利用高温解旋,然后以单链DNA为模板进行复制,④错误,C正确。 3. C 解析:本题考查PCR扩增的过程以及条件,难度中等。PCR扩增一般需要经历多个循环,每个循环分为变性、复性和延伸3步,A正确;PCR扩增的原料是四种脱氧核苷酸,B正确;PCR过程中用耐高温的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合, 不需要DNA连接酶,C错误;PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3'端延伸DNA链,又由于DNA的两条模板链为反向平行,所以复制时需要2个引物,D正确。 4. B 解析:本题考查DNA的复制以及DNA聚合酶的特点,难度较大。DNA分子的半保留复制保证了DNA的亲子代关系,是DNA复制的模式,无论单向复制还是双向复制,均为半保留复制,A正确;NrS1DNA聚合酶催化DNA单向复制,与DNA聚合酶催化结果不同,即两种酶所起的作用不同,所以两种酶结构不同,B错误;Nrs1DNA聚合酶识别复制起点后,能以dNTP为原料直接合成子链,所以不需要引物参与,C正确;由于Nrs1DNA聚合酶不需要引物即可开始DNA复制过程,若以其作为PCR过程中的工具酶,可以不加入引物,从而简化PCR过程,D正确。 5. C 解析:本题主要考查利用PCR反应扩增DNA,以及相关的计算,难度较大。高温解旋过程中,高温会使氢键断裂,不需要解旋酶,A错误;需要消耗dNTP合成子链,但不需要添加ATP为反应供能,B错误;适温延伸过程中,用的Taq酶在高温下仍保持活性,可以一次加入,不需添加,C正确;根据DNA半保留复制的特点,体外扩增n代的过程中,只有亲代DNA的两条单链不含有引物,共有2n+1-2个引物参与子代DNA分子的合成,D错误。 6. C 解析:本题考查PCR反应的过程,难度中等。95 下使模板DNA变性是使DNA分子两条链碱基对之间的氢键断裂,从而解链,解旋酶的作用部位就是氢键,解旋酶也能使氢键断裂,A正确;引物是单链的DNA片段,因此引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成,B正确;延伸过程中合成的是DNA,需要耐高温的DNA聚合酶,原料是四种脱氧核糖核苷酸,C错误;细胞内DNA复制是生物体内完成的,因此最适温度就是生物体的体温,而PCR技术的温度是不断循环变化的,总体来说PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,D正确。 7. C 解析:本题考查PCR技术的过程以及相关的应用,难度中等。PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,A正确;PCR技术制备大量DNA时引物要被不断消耗,B正确;DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸,C错误;应用PCR技术与探针杂交技术可以检测特定的基因,D正确。 8. B 解析:本题考查PCR技术的过程,难度中等。PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步,A正确;PCR技术中通过高温解旋,不需要采用解旋酶,B错误;复性前,在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA,因此延伸的温度要大于复性温度但小于变性温度,C正确;DNA聚合酶从引物的3′开始延伸DNA链,D正确。 9.(1)半保留复制(或碱基互补配对原则) (2)5' 3' DNA连接酶 细胞内是边解旋边复制,而PCR中是完全解螺旋后再复制 (3) 变性、复性、延伸 耐高温 (4)引物和模板链 G和C含量(比例)高 解析:本题考查DNA的细胞内复制以及利用PCR技术体外扩增DNA,难度中等。 (1)图1和图2所示过程均遵循碱基互补配对原则,原理是半保留复制。 (2)DNA聚合酶只能识别DNA的3' 端,因此催化5' 3' 方向的聚合反应。图1所示DNA复制过程中两条子链的合成方向都是5′ 3′;其中一条子链是不连续合成的,先合成短的DNA片段(称为冈崎片段),再通过DNA连接酶的催化形成较长的分子;由于细胞内是边解旋边复制,而PCR中是完全解螺旋后再复制,因此在PCR过程中无冈崎片段的形成。 (3)PCR全称为聚合酶链式反应,是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术。图2所示的PCR扩增的3个基本步骤分别是变性(90 以上)、复性(50 左右)、延伸(72 左右);PCR技术存在高温变性过程,因此步骤3需要的酶具有耐高温性。 (4)复性的目的是让引物结合到互补DNA链上,若复性温度过高会破坏引物和模板链的碱基配对。C-G之间有3个氢键,A-T之间有2个氢键,因此C-G含量越高DNA分子热稳定性越高。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但G和C含量高的引物需要设定更高的复性温度。 10.(1)DNA(双链)复制 使DNA变性(或使DNA的两条链解开) (2)211-2 (3)5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端拼接单个脱氧核苷酸分子 (4)病毒核酸 解析:本题主要考查PCR技术的原理、过程以及应用,难度中等。 (1)PCR技术的原理是DNA复制;在PCR中先用94 高温处理的目的是使DNA变性(使DNA的两条链解开)。 (2)PCR 技术大量扩增目的基因时,缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2,因此,若将1个DNA分子拷贝10次,则需要在缓冲液中至少加入211-2个引物。 (3)由于DNA聚合酶只能从引物的3′端拼接单个脱氧核苷酸分子;故DNA子链复制的方向是5′ 到3′。 (4)PCR就是聚合酶链式反应,用于扩增DNA序列,所以可以用PCR扩增血液中病毒核酸便于检测。 从构建基因表达载体到目的基因的检测与鉴定 重难点 题型 分值 重点 ①基因工程的基本操作程序 选择题、非选择题 3-5 ②在各项基本操作中的注意事项 难点 ③PCR技术扩增目的基因 ④农杆菌转化法导入受体细胞 一、基因表达载体的构建 1. 目的:获得了足够量的Bt基因后,下一步就是让基因在受体细胞中稳定存在,并传给下一代,并使该基因能够在细胞内表达和发挥作用,这就需要构建基因表达载体。这是培育转基因抗虫棉的核心工作,也是基因工程的核心步骤。 构建基因表达载体是将目的基因和运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果将获得的目的基因直接导入受体细胞,会在其中酶的作用下被分解而失去作用。 2. 基因表达载体的组成以及作用 (1)目的基因:控制某种蛋白质合成的基因; (2)标记基因:在载体上存在的标记基因,如抗性基因,其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细胞筛选出来; 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力——当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞,倘若在选择培养基中不能存活,则表明无质粒转入,当然不会有“目的基因”转入,能存活时必含该载体。 (3)启动子:是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,是RNA聚合酶识别和结合的部位,有启动子才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要,会在载体中人工构建诱导型启动子,当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达。 (4)终止子:是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的下游,使转录在所需要的地方停下来,相当于一盏红色信号灯。 注意:目的基因需要插入启动子和终止子中间的位置。 基因表达载体中启动子、终止子的来源 ①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的,在构建基因表达载体时,不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子,因为目的基因中已含有启动子、终止子。 ②如果目的基因是通过人工方法合成的,则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中,目的基因没有启动子、终止子,是无法转录的,因此,在构建基因表达载体时,需要在与质粒结合之前,在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 3. 基因表达载体构建的过程 用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口;然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段,获取目的基因要在该基因的两侧进行切割;在利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,从而形成重组DNA分子。 问题探讨:如果用同种限制酶切割会出现怎样的弊端?可以采用怎样的方法解决? 提示:同种限制酶切割可产生相同的末端,质粒会发生重新连接的现象、比较长的DNA会发生自我成环、同种或不同种的DNA均可连接、目的基因有可能发生倒接现象。 在实际操作中可以采用双酶切的方式,使切割后的末端不同,即可避免任意连接的现象,使目的基因定向插入到特定的位置。 目的基因中一定不能有限制酶的识别序列,否则会将目的基因切割而失去活性。 名词辨析:启动子和终止子、起始密码子和终止密码子 起始(终止)密码子 启动(终止)子 本质 三个相邻碱基 DNA片段 位置 位于mRNA上 位于DNA上 作用 启动(终止)翻译 启动(终止)转录 二、将目的基因导入受体细胞 (一)将目的基因导入植物细胞 1. 花粉管通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 2. 农杆菌转化法 将目的基因导入植物常用的方法。 (1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (2)农杆菌的特点:一种在土壤中生活的微生物,能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有侵染能力。 (3)农杆菌转化的过程:农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞。 (4)农杆菌转化的途径 将新鲜的从叶片上去下的圆形小片与农杆菌共培养,然后筛选转化细胞,并再生成植株; 将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间,然后培养植株并获得种子,再进行筛选、鉴定等。 对于单子叶植物的转化也取得了成功,研究表明损伤的组织产生的某种物质是吸引农杆菌聚集并侵染的关键,因此可以在单子叶的植物材料上涂抹相应的物质,以吸引农杆菌并完成转化。 (二)将目的基因导入动物细胞 利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中,受精卵将发育成为具有新性状的动物。 问题探讨:为什么选择受精卵为受体细胞呢?在培育成动物的过程中需要哪些技术? 提示:受精卵具有全能性,可以发育成完整的个体,而其他体细胞的全能性受到限制。 需要早期胚胎培养技术、胚胎移植技术。 (三)经目的基因导入微生物 在基因工程操作中,常用原核生物作为受体细胞,以大肠杆菌应用最广。研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。 三、目的基因的检测与鉴定 这是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。 1. 分子水平的检测 (1)通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因; (2)检测Bt基因是否转录出mRNA; (3)从转基因棉花中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交,检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白。 2. 个体水平的鉴定 通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 总结基因工程的“四部曲”: 例题1 为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因 C,拟将其与质粒重组,再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是( ) A. 用限制性酶 EcoR 和DNA连接酶构建重组质粒 B. 在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞 C. 用含基因 C 的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将基因 C 导入细胞 D. 通过检测基因 C 是否整合到菊花染色体上可确定基因转移是否成功 答案:B 解析:本题主要考查基因工程的具体步骤,难度中等。据图分析可知,在目的基因的两端、启动子和终止子之间都有限制酶EcoR 的切割位点,因此可以用限制酶EcoR 切割目的基因和运载体,之后再用DNA连接酶连接形成基因表达载体,A正确;图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因,应该在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,B错误;将目的基因导入到植物细胞,常用农杆菌转化法,可以将目的基因C导入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA段,之后再用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞中染色体上的DNA上,C正确;可通过检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因来确定基因转移是否成功,D正确。 例题2 下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述,不正确的是( ) A. ① ②利用两种不同限制酶处理,能避免抗虫基因的DNA片段自身环化 B. ② ③可用氯化钙处理农杆菌,有助于促进重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中 C. ③ ④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上 D. ④ ⑤用植物组织培养技术培养,具有抗虫性状的植株产生了可遗传变异 答案:C 解析:本题主要考查抗虫植物的培育过程,难度中等。图示是利用基因工程培育抗虫植物的示意图,其中①为质粒,作为运载体;②为重组质粒;③为含有重组质粒的农杆菌;④为含有目的基因的植物细胞;⑤为转基因植株。① ②利用两种不同限制酶处理,能避免含抗虫基因的DNA片段自身环化,A正确;② ③可用氯化钙处理农杆菌,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞,这样有助于促进重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中,B正确;③ ④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒的T-DNA片段整合到植物细胞的染色体上,C错误;④ ⑤用植物组织培养技术培养,具有抗虫性状的植株产生了可遗传变异,D正确。 例题3 为使玉米获得抗除草剂性状, 需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,导致未转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是( ) A. 筛选1需要用含有氨苄青霉素的培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌 B. 筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织 C. 为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达,需要把目的基因片段插入到表达载体的复制原点和启动子之间 D. 为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状,可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株 答案:C 解析:本题主要考查通过基因工程培育具有特定性状的植物的过程,难度中等。分析图解可知,该基因工程的标记基因为氨苄青霉素抗性基因,因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌,A正确;根据题意可知,报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色,因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织,B正确;为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达,需要把目的基因片段插入到表达载体的启动子、终止子之间,C错误;为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状,可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株,D正确。 (答题时间:30分钟) 1. 为提高大豆对磷元素的吸收能力,研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因 OsPTF 转移到大豆植株中,下图为重组 Ti 质粒上 T-DNA 的序列结构示意图。下列相关叙述不正确的是( ) A. 以水稻 RNA 为模板通过逆转录及PCR 扩增可获得大量OsPTF 基因 B. RNA 聚合酶与启动子 I 识别并结合后,启动抗除草剂基因的转录 C. 可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的的基因大豆愈伤组织 D. 用 EcoRI、BamHI 双酶切重组 Ti 质粒后,可得到两条不同长度的片段 2. 基因工程为花卉育种提供了新的技术保障。如图为花卉育种的过程(字母代表相应的物质或结构,数字代表过程或方法)。下列说法正确的是( ) A. ①过程需要的酶有限制酶和DNA聚合酶 B. ②过程常用的方法是农杆菌转化法 C. ③、④过程为分化和再分化,该过程体现了植物细胞的全能性 D. 转基因生物DNA上是否插入目的基因,可用抗原—抗体杂交技术检测 3. 某研究小组为了研制预防甲型H1N1流感病毒的疫苗,开展了前期研究工作,其简要的操作流程如图所示。下列有关叙述错误的是( ) A. 步骤①所代表的过程是逆转录 B. 步骤②需使用限制酶和DNA连接酶 C. 步骤③可用CaCl2溶液处理大肠杆菌 D. 步骤④表达出甲型H1N1流感病毒的抗体 4. 我国科学家运用DNA重组技术,将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达,培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A. 基因的完整性对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少 B. 重组DNA分子中增加一个碱基对,不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C. 抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至其野生亲缘种,从而造成基因逃逸 D. 转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的 5. 在基因表达载体的构建中,下列说法不正确的是( ) ①一个表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 ④所有基因表达载体的构建是完全相同的⑤构建过程应该在体外进行 ⑥选择同种限制酶和DNA连接酶构建可以提高定向连接效率 A. ②③⑤ B. ①④⑥ C. ①②⑤ D. ③④⑥ 6. 下图表示利用细菌中抗虫基因培育抗虫玉米的过程,其中①~⑧表示操作步骤,a、b表示相关分子,c~e表示培养过程,其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养。下列有关叙述正确的是( ) A. 图中需要用到限制酶的是步骤①②③ B. 图中导入目的基因的是步骤④ C. 步骤⑤的主要目的是扩增目的基因 D. 脱分化和再分化的步骤分别是⑦和⑧ 7. 科研人员先分别PCR扩增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信号肽基因(编码的肽链能引导新合成的蛋白质转移、分泌),再将它们拼接形成融合基因,并导入大肠杆菌生产尿酸酶。相关叙述错误的是( ) A. 扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向 B. 构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外 C. 融合基因导入大肠杆菌前需构建基因达载体,以保证目的基因正常表达和遗传 D. 在导入融合基因前,应先用NaCl处理大肠杆菌,使其变为已接受外源DNA的状态 8. 利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素,下列相关叙述正确的是( ) A. 人和大肠杆菌工程菌中合成胰岛素时翻译场所是相同的 B. 不同的限制酶识别相同的核苷酸序列 C. 通过检测,大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌 D. 选用大肠杆菌作为受体细胞主要原因是繁殖快、易培养、产量高 9. 径柳匙叶草是一种泌盐植物。科研工作者将径柳匙叶草液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因(TaNHX2基因)转移到棉花细胞内,获得了转基因耐盐棉花新品种。图1是获取的含有目的基因的DNA片段,Sau3AI、EcoRI、BamHI为三种限制酶,图中箭头所指为三种限制酶的切点;图2是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图;图3是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图,请分析回答问题: (1)若要得到大量的图1中的目的基因,可采用的方法是。 (2)不能在径柳匙叶草根尖分生区细胞中获得TaNHX2基因的mRNA,其原因是。 (3)若用BamHI切割图1所示的DNA片段,获得目的基因,则需选用切割图3所示质粒,以便构建基因表达载体,该方案的缺陷是。故切割图1所示DNA片段的最佳方案是选用酶。 (4)用上述最佳方案构建基因表达载体,所得重组质粒(选填“能”“不能”或“不一定能”)被BamHI切割。 (5)图3中,质粒上的抗生素抗性基因的作用是。 (6)为了检测技术成果,科研工作者将转基因棉花种植在盐碱地,观察其生长状况,这属于水平的检测。 (6)科研工作者将转基因棉花种植在盐碱地,观察其生长状况,属于个体水平上的检测。 10. 基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段。如图是基因工程示意图,请据图回答下列问题: (1)从基因文库中提取的目的基因通过PCR技术进行扩增时,所用的酶与细胞内同类酶的差异在于该酶。 (2)进行①过程时,需用酶切开载体以插入目的基因。若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过表达载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是应(答出两点即可)。 (3)若图中宿主细胞为大肠杆菌,一般情况下②过程不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是;已转化的宿主细胞(大肠杆菌)指的是。 (4)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。 1. B 解析:本题考查基因表达载体的构建以及不同结构的功能,难度中等。以水稻RNA为模板通过逆转录可以合成cDNA,然后再以cDNA为模板利用PCR扩增可获得大量OsPTF基因,A正确;识图分析可知,抗除草剂基因位于启动子2的后面,因此RNA聚合酶与启动子2识别并结合后,启动抗除草剂基因的转录,B错误;由于图中T-DNA的序列中含有目的基因和抗除草剂基因,故可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因大豆愈伤组织,C正确;用EcoRI、BamHI双酶切重组Ti质粒后,可得到两条不同长度的DNA片段,即含耐低磷基因OsPTF的片段和含有除草剂基因的片段,D正确。 2. B 解析:本题考查转基因植物的培育过程,难度中等。①过程是构建基因表达载体,需要的酶有限制酶和DNA连接酶,A错误;基因表达载体导入到植物细胞中常用农杆菌转化法,B正确;③、④过程为脱分化和再分化,该过程体现了植物细胞的全能性,C错误;检测DNA是否插入到生物体内,应用DNA分子杂交技术,D错误。 3. D 解析:本题考查利用基因工程研制疫苗,难度中等。步骤①的模板是RNA,产物是DNA,应为逆转录过程,A正确;步骤②为基因表达载体的构建过程,需使用限制酶切割目的基因和运载体并用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA,B正确;步骤③将外源基因导入受体细胞,可用CaCl2处理大肠杆菌,使其处于感受态,C正确;步骤④为目的基因的表达过程,由于目的基因携带的是病毒的遗传信息,故表达出的是甲型H1N1流感病毒的蛋白质,不是抗体,D错误。 4. D 解析:本题考查抗虫棉的培育,难度中等。基因工程的关键步骤是构建基因表达载体,基因表达载体由启动子、目的基因、标记基因和终止子等部分组成,可见基因的完整性对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少,A正确;重组DNA分子中增加一个碱基对,会引起基因突变,但由于密码子的简并性等原因,基因突变不一定会导致毒蛋白的毒性丧失,B正确;抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至其野生亲缘种,从而造成其野生亲缘种也有抗虫基因,该近缘物种再通过授粉会造成基因进一步扩散和污染,C正确;转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对棉铃虫的抗性来确定的,D错误。 5. B 解析:本题考查基因表达载体的结构以及功能,难度中等。基因表达载体的构建是基因工程的核心内容,一个表达载体的组成,除了目的基因外,还有启动子、终止子和标记基因等,①错误;启动子在基因的首段,它是RNA聚合酶的结合位点,能控制着转录的开始,②正确;终止子在基因的尾端,它控制着转录的结束,③正确;由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分,以及目的基因导入受体细胞的方法不同,因此基因表达载体的构建是不完全相同的,④错误;基因表达载体的构建必须在体外进行,⑤正确;选择不同种限制酶和DNA连接酶构建可以提高定向连接效率,⑥错误。②③⑤正确,①④⑥错误,B正确。 6. C 解析:本题考查抗虫玉米的培育过程,难度中等。①表示目的基因的获取,需要用到限制酶,②切割质粒产生黏性末端的过程,也需要用到限制酶,而步骤③需要用DNA连接酶,A错误;图示将目的基因导入受体细胞(玉米细胞)的方法是农杆菌转化法,即图中步骤④⑤⑥,B错误;步骤⑤是通过农杆菌的繁殖来扩增目的基因,C正确;步骤⑦表示植物组织培养过程,包括脱分化和再分化两个过程;⑧表示植物的生长发育过程,D错误。 7. D 解析:本题考查基因表达载体的构建以及目的基因的导入,难度中等。每个基因的两端都有启动子和终止子,它会调节基因的表达,因此扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向,以便它们都能正常表达,A正确;根据题干中原核生物胞外蛋白信号肽基因的功能可知,构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外,B正确;融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体,以保证目的基因正常表达和遗传,C正确;在导入融合基因前,应先用CaCl2处理大肠杆菌,使其变为感受态细胞,D错误。 8. D 解析:本题考查基因工程的步骤,难度中等。人的胰岛素基因在细胞核中,因此转录发生在细胞核中,而翻译发生在细胞质中的核糖体上, A错误;限制酶具有专一性,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,不同的限制酶识别不同的核苷酸序列,B错误;通过检测,大肠杆菌中没有胰岛素产生只能确定目的基因没有翻译成蛋白质,不能判断重组质粒未导入受体菌,C错误;选用大肠杆菌作为受体细胞是因为其具有繁殖快、易培养、产量高,D正确。 9. (1)PCR技术体外扩增 (2)基因的选择性表达(径柳匙叶草根尖分生区细胞中TaNHX2基因不能表达) (3)Sau3A I 出现目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定 EcoRI和BamH I (4)不一定能 (5)以便筛选出含有目的基因的受体细胞 (6)个体 解析:本题考查的是基因工程的基本操作步骤,难度中等。 (1)扩增目的基因可采用PCR技术。 (2)由于细胞中基因是选择性表达的,而径柳匙叶草根尖分生区细胞中TaNHX2基因不能表达,因此不能在径柳匙叶草根尖分生区细胞中获得TaNHX2基因的mRNA。 (3)已知切割图1所示的DNA片段的限制酶是BamHI,因此切割目的基因的限制酶应该是BamHI或者是切割后能够产生相同黏性末端的限制酶,图2显示BamHI与Sau3A I切割后产生的黏性末端相同,而图3质粒又没有BamHI识别位点,因此只能用Sau3A I切割质粒;该方案切割后,目的基因两侧的黏性末端以及质粒的两个黏性末端相同,可能会引起目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定等情况;为了防止这种现象的出现,我们应该选择不同的限制酶切割目的基因的两侧以及质粒,结合图1和图3分析,应该选择EcoRI和BamH I切割图1所示DNA片段,EcoRI和Sau3A I切割图3质粒。 (4)结合以上分析可知,形成的重组质粒上肯定含有EcoRI、Sau3A I的识别位点,不一定含有BamH I的识别位点,所以所得重组质粒不一定能被BamHI切割。 (5)图3中,质粒上的抗生素抗性基因为标记基因,其作用是筛选出含有目的基因的受体细胞。 10. (1)耐高温(或具有热稳定性) (2)限制(或限制性内切核酸) 目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子、目的基因无表达所需的终止子 (3)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力弱 已导入目的基因并且目的基因能稳定遗传和表达的细胞 (4)蛋白酶缺陷型 蛋白酶 解析:本题考查基因工程的基本步骤,难度中等。 (1)利用PCR技术扩增目的基因时,需要特殊的耐高温的DNA聚合酶。 (2)在构建基因表达载体时,需用限制酶将载体切开,以便目的基因的插入;若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过表达载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子和终止子。 (3)若受体细胞是大肠杆菌(微生物),由于未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力弱,则需要用钙离子处理大肠杆菌,使之成为感受态细胞;已转化的宿主细胞(大肠杆菌)指的是已导入目的基因并且目的基因能稳定遗传和表达的细胞。 (4)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解,为防止蛋白质被降解,可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物,因此为防止蛋白质被降解,在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。 学科网(北京)股份有限公司 $