3.1 限制性内切核酸酶的发现-2023-2024学高二下学期生物人教版选择性必修三

限制性内切核酸酶的发现 2019版高中生物学选择性必修三说，切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）， 简 称 限 制 酶（restriction enzyme）。 这 类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的： 那么，限制性内切核酸酶是如何发现的？ 在20世纪60年代，科学家们偶然发现了某些噬菌体侵染细菌后会出现"限制"现象。这一发现引起了瑞士分子遗传学家阿尔伯（Werner Arber）以及美国科学家史密斯（Hamilton Smith）和内森斯（Daniel Nathans）的兴趣和研究。他们的努力最终导致了限制性内切酶的发现和制备，这一重大突破标志着基因工程技术的诞生。 限制性内切酶最早由阿尔伯课题组于1962年提出，并在之后的几年里通过一系列理论研究和实验证实。阿尔伯利用噬菌体研究紫外线对生物体基因突变的影响，发现大肠杆菌感染噬菌体有的繁殖，有的不繁殖。通过进一步的研究和推理，他认为噬菌体进入细菌细胞后，细菌细胞能够释放出一种酶，这种酶一旦发现外来的DNA（噬菌体），便将其切割、分裂，使之大部分或全部失活，以此遏制噬菌体在细菌细胞内的生长与存活，从而保护自己。他将这种酶称为DNA限制性内切酶。 阿尔伯首次从理论上提出了DNA限制性内切酶的存在，他们发现细菌中存在一种特殊的酶，能够降解外来噬菌体的DNA而限制其在细菌内的繁殖。并且认为人类可以运用DNA限制性内切酶对重要遗传物质DNA分子的特定部位进行切割，为不同DNA之间的连接创造必不可少的条件。1968年，阿尔伯等人还成功地分离出I型DNA限制性内切酶，但是这种酶切割DNA分子的效果并不是像预期那样好。 同时，细菌自身也有一种修饰酶，能够保护其自身的DNA不受损害。这个限制-修饰系统的发现为理解细菌免疫机制提供了重要线索。 在阿尔伯研究的基础上，美国微生物学家史密斯从流感嗜血杆菌中发现了切割DNA分子效果非常好的II型限制性内切酶（Hind II）。此后，美国分子生物学家内森斯利用Hind II来测定DNA碱基排列顺序，并作为分离DNA的工具，首次成功完成了DNA的人工切割。史密斯和内森斯的工作证实了阿尔伯的理论，阿尔伯由此成为现代生物技术工程这个新学科的先驱者。这一重大发现扩展了对限制性内切酶的了解，并为后续研究奠定了基础。 与此同时，内森斯正在努力解决如何将病毒DNA切割成片段的问题。正当他为此苦恼时，史密斯向他发来了好消息，告诉他发现了一种具有特定切割位置的新型酶。内森斯立刻认识到这一发现的重要性，并与史密斯合作。他们利用最简单的动物致瘤病毒SV40，通过限制酶将其DNA切割成11个特定的片段。此后，他们又用另外两种新发现的限制性内切酶对SV40基因组DNA进行切割，然后对这些DNA片段进行排列组合，成功构建了SV40的基因组物理图谱。这是人类首次通过化学方法获得的基因组图谱，为分子遗传学研究打开了新的大门。 限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在 DNA链上没有固定的切割位点，一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点，但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。 限制性酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称回文序列，如EcoRI的识别序列为： GAATTC CTTAAG 将纵轴一侧的序列以横轴为中心旋转180°，则纵轴两侧的序列相互对称，这种结构又称为双重对称结构。大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。4核苷酸序列在DNA链中出现频率高，对一随机排列的DNA分子来说，理论值为1/44，因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多，产生片段的数目多，长度短，显示出酶的特异性较低。对于5和6核苷酸识别序列的酶，出现频率分别为1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出现频率低，酶的特异性强，而8核苷酸识别位点在DNA链中出现机率更低(1/48 )，特导性更强，可提供更长的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列，其回文识别序列被个或几个其他核苷酸所间隔，如BglⅠ，这种酶的特异性比识别长度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(约10种，如BbVⅠ等)，其识别序列不表现为回文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。 限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割 DNA链时，总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’末端则为游离羟基。因此某一种酶的