备课素材：常见DNA连接酶种类及作用机理--2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

常见DNA连接酶种类及作用机理 2019版高中生物学新教材中增加了连接酶的种类和作用机理： DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。基因工程中用到的连接酶主要是大肠杆菌DNA连接酶以及T4 DNA连接酶，目前后者的应用更为广泛。 1.DNA连接酶与DNA聚合酶的区别 （1）形成方式不同：DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键。 （2）模板不同：DNA连接酶不需要模板，因为DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来形成一条与模板链互补的DNA链。 （3）用途不同：DNA连接酶主要用于基因工程，将由限制性内切核酸酶“剪”出的黏性末端重新组合，故也称“基因针线”。DNA聚合酶在DNA复制中起作用，主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 2.常见DNA连接酶种类及作用机理 在DNA的复制过程中也需要DNA连接酶的作用，就是将DNA复制时复制叉处形成的不连续的后随链（冈崎片段）连接起来。此外，在损伤的DNA的碱基修复中，DNA连接酶Ⅰ也同样起到重要的作用。这种酶就是E.coliDNA 连接酶。 （1)一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为大肠杆菌（E.coil） DNA连接酶，只连接具有相同黏性末端的DNA分子的基本骨架，即磷酸二酯键。作用机理：大肠杆菌DNA连接酶可以催化双链DNA黏性末端的5′ -磷酸和3′ -羟基形成磷酸二酯键，即只能连接具有互补配对粘性末端的双链，不能有效连接平末端底物。E.coli DNA连接酶需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作辅酶。 （2）另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶，T4 DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶。可连接双链DNA的平末端、互补黏性末端及其中的单链切口，也能催化RNA连接到DNA或者双链RNA上，但不催化单链核酸的连接（如图）。 T4 DNA连接酶可以直接在载体和目的片段之间形成磷酸二酯键，碱基之间不再需要配对，但是这种方式连接效率很低且容易发生载体自连。一般可以将平末端转为转成黏性末端后进行连接。例如，利用末端转移酶分别在目的片段和载体的末端上添加互补的多聚A和多聚T碱基，人工添加黏性互补末端，这种方式可以提高连接效率。 作用机理：ATP通过断裂最后一个高能磷酸键释放能量，同时产生的AMP和T4 DNA连接酶利用ATP水解释放的能量形成E-AMP复合物；所形成的E-AMP复合物可以识别DNA双链之前被切开的切口，识别之后AMP会脱离E-AMP复合物并与DNA的5’-P基团结合；需要连接另外一段DNA分子片段的3’-OH会攻击第二步形成5‘-P-AMP，3’-OH和磷酸基团残基发生反应形成磷酸二酯键，同时释放出一个AMP。 3. 影响连接效率的因素 （1）连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，黏性末端的氢键结合很不稳定，因此，连接黏性末端的最适温度一般认为4~16℃比较合适。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥； （2）酶浓度的影响； （3） pH的影响。 例、构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5'-Р变成5'-0H，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5'-0H与3'-0H不能连接而形成切口（nick）。下列说法错误的是（   ） A．经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化 B．外源DNA也必需用碱性磷酸单酯酶处理 C．T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端 D．重组DNA经过⒉次复制可得到不含nick的子代DNA 解析：将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5'-0H与3'-0H不能连接而形成切口（nick），因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA连接不能连接形成重组DNA，B错误；DNA连接酶在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。连接酶的催化作用需要消耗ATP。T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA是半保留复制，重组DNA经过⒉次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。故答案为B。 学科网（北京）股份有限公司 $$