第4章 第1节 第2课时 基因工程的操作步骤与PCR技术及电泳鉴定（word教参）-【新课程学案】新教材2023-2024学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版2019）

第2课时　基因工程的操作步骤与PCR技术及电泳鉴定 1.阐明基因工程的基本操作程序。 2．掌握基因工程中各操作步骤的要点。 3．认识PCR是扩增DNA片段的基本方法，尝试扩增DNA片段，学会PCR的基本方法。 [主干知识梳理] 一、基因工程的操作步骤 1．获取目的基因 (1)目的基因：人们感兴趣、想研究的基因，如人胰岛素原基因、植物的抗病基因等。 (2)真、原核生物基因结构比较 项目 真核生物 原核生物 基因结构 包括启动子、外显子、内含子及终止子 启动子、终止子 mRNA是否 需要加工 需要 不需要 [微提醒] 内含子与外显子所对应的基因序列均会被转录，但是内含子对应的部位需要修饰切去，连接外显子对应部位，从而形成成熟mRNA。　　 (3)目的基因获取方法及比较 方法 化学合成法 建立cDNA文库 聚合酶链式反应 序列 特点 序列已知，相对较短 序列未知 序列已知 具体 操作 将核苷酸按照特定的顺序一个一个地连接起来，直接合成目的基因 利用成熟的mRNA在逆转录酶等酶的作用下合成互补DNA(即cDNA)，借助载体构建cDNA文库 在DNA聚合酶的作用下，在体外进行DNA大量扩增，主要包括变性、退火、延伸三步 续表 方法 化学合成法 建立cDNA文库 聚合酶链式反应 应用 合成较短序列，成本高 不同组织细胞cDNA文库存在差异，需针对不同的表达产物构建特定的cDNA文库 该技术具有简便、快速、灵敏等特点，广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面 2.构建重组DNA分子 (1)克隆载体与表达载体 克隆 载体 用于大量扩增外源DNA的载体 表达 载体 使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体，包含适当的转录和翻译信号 (2)重组DNA分子的形成 ①通常用相同的限制性内切核酸酶分别剪切含有目的基因的DNA片段和表达载体，以形成相同的黏性末端或平末端。 ②用DNA连接酶将目的基因和表达载体连接在一起，形成重组DNA分子。 3．将目的基因导入受体细胞 受体细胞 处理方式 细菌 常用CaCl2溶液制备感受态细胞，低温下将感受态细胞与重组DNA分子混合，短暂热刺激处理，使外源DNA转入细胞 动物细胞 常用显微注射法将目的基因导入动物细胞 植物细胞 常使用农杆菌转化法，具体操作为：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA中，用重组Ti质粒转化农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞，目的基因随T-DNA整合到植物染色体DNA中 4.检测目的基因及其表达产物 目的基因及其表达产物的检测和鉴定可以从DNA、RNA、蛋白质、个体性状四个方面进行。 (1)通过检测DNA可确定目的基因在受体细胞内是否稳定存在。 ①借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。 ② PCR和核酸分子杂交技术可鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。 (2)检测RNA和蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状，可得知目的基因是否正确表达。 ①运用核酸分子杂交技术可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。 ②运用抗原-抗体杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。 ③观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。 二、PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 1．PCR扩增DNA片段 原理 ①在高温加热作用下，打开DNA双链，以两条DNA单链作为模板；②以4种脱氧核苷三磷酸为原料，合成子链；③在引物作用下，Taq_DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链 步骤 变性→退火→延伸 扩增结果 PCR过程包括多次循环，每一次循环后DNA的量可增加一倍，DNA呈指数形式扩增 2．凝胶电泳鉴定的流程 [预习效果自评] 1．判断下列说法的正误 (1)质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接。(×) 提示：抗生素抗性基因用于筛选含目的基因的受体细胞。 (2)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。(×) 提示：应用DNA探针技术，可以检测受体细胞是否转入了目的基因，运用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达。 (3)在宿主细胞中检测到目的基因存在，说明转基因技术操作成功。(×) 提示：导入受体细胞的目的基因未必能正常表达，若不能正常表达对于基因工程而言是不成功的。 (4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(×) 提示：将人的血清白蛋白基因导入了受精卵细胞中，目的基因在乳腺细胞中表达。 (5)PCR技术需要利用限制性内切核酸酶打开DNA双链。(×) 提示：PCR扩增DNA时，通过热变性使DNA双