备课素材：质粒及其应用-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

质粒及其应用 2019版高中生物学选择性必修三提到，通常是利用质粒（plasmid）作为载体（vector），将基因送入细胞： 那么，质粒是什么？结构怎样？有哪些用途？ 质粒是在细菌和其他细胞中发现的一种小型、环状DNA 分子。通常只携带少量基因，特别是一些与抗生素耐药性有关的基因；可以在不同的细菌细胞之间传递。 十九世纪四十年代，科学家们发现一种可以在细胞之间互相转移的细胞质遗传因子，并提出了多种猜测，包括寄生虫、共生体、基因等。但命名始终未得到最终的确认。 直到1952 年，Joshua Lederberg 开始着手阐明这些细胞质遗传因子的分类，并首次提出了“plasmid”这个名称。“plasmid”是“cytoplasm” 和“id” (拉丁语中的‘it’)的整合体，并将其作为“任何染色体外遗传决定因子”的通用术语。然而，Joshua Lederberg的定义石沉大海。几年后，Élie Jacob 和 François Wollman 提出了一个单独的术语“episome”，定义为“可以自主存在或整合到染色体中的非必需遗传元素”，并成为这些元素的广泛采用的名称。值得一提的是，Ester Lederberg在 1952年发现Fertility/F因子可以在某些情况下整合到大肠杆菌染色体中，辅证了该名称的合理性。 1960年代，转折点再次出现。科学家们发现Resistance/R因子可以在细菌之间转移，然而与F因子不同，R因子并不能整合到染色体中。从此，“plasmid”代替“episome”重新步入了历史舞台。 十九世纪七十年代，限制性内切酶、DNA 连接酶和凝胶电泳技术的发展使得DNA片段的转移成为可能。DNA片段与质粒或载体 DNA 骨架的组合产生重组DNA分子，为基因功能的研究提供了新手段。 质粒的结构是什么样的？ 质粒模式图 复制起始位点：通过募集复制相关蛋白在质粒内启动复制。 抗生素抗性基因：筛选含有质粒的细菌，例如：Ampicillin，Kanamycin。质粒含有抗生素抗性基因，而没有质粒 DNA 的细菌将无法在含有抗生素的LB培养板中存活。 多克隆位点：包含数个限制性酶切位点，可通过限制性酶消化和连接轻松插入目的DNA。在表达质粒中，MCS 通常位于启动子的下游，因此当基因插入 MCS 时，其表达将由启动子驱动。一般而言，MCS 中的限制性位点是独一无二的，并不位于质粒骨架的其他位置。因此，酶切时并不会破坏质粒载体其他部位的结构。 插入片段：插入片段是克隆到 MCS 中的基因、启动子或其他 DNA 片段，通常是人们所希望研究的遗传元件。 启动子：驱动目标基因的转录。启动子的选择需要与质粒表达的物种相匹配。例如：如果打算在人细胞中使用质粒，则启动子将是人或哺乳动物启动子序列。而在大肠杆菌中使用质粒，则将是原核生物启动子序列。选择组织特异性启动子，则可以实现目的基因的组织特异性表达。启动子的强度与目的基因的表达水平密切相关。 选择性标记：筛选已经成功摄取质粒的细胞。注意该选择性标记区别于细菌中的抗性筛选。细菌抗性基因筛选用于质粒扩增过程，选择性标记用于筛选或标记转染后的细胞。选择性标记通常是抗性筛选或者荧光蛋白。 引物结合位点：短的单链 DNA 序列，用作 PCR 扩增或测序的起始，验证质粒序列。 质粒有哪些分类和用途？ Cloning Plasmids 克隆质粒：用于促进 DNA 片段的克隆。克隆载体往往非常简单，通常只包含细菌抗性基因、复制起点和 MCS。 Expression Plasmids 表达质粒：用于基因表达（基因功能的研究）。表达载体必须包含启动子、转录终止子序列和插入基因。启动子驱动插入DNA 转录生成RNA，合成的RNA上的终止子序列发出停止转录过程的信号。表达载体可以通过增强子序列增加蛋白质或RNA的产量。表达载体可以在各种细胞类型（哺乳动物、酵母、细菌等）中驱动表达，这在很大程度上取决于用于启动转录的启动子。 Gene Knock-Down Plasmids 基因敲减质粒：用于减少内源基因的表达。通过表达靶向目的基因 mRNA的shRNA来实现。这些质粒具有可以驱动短 RNA 表达的启动子。 Genome Engineering Plasmids 基因工程质粒：用于靶向和编辑基因组。通常使用 CRISPR 技术完成。 Reporter Plasmids 报告质粒：用于研究遗传元件的功能。这些质粒包含一个报告基因（例如，荧光素酶或GFP），可提供遗传元件活性的读数。 Viral Plasmids 病毒质粒：通过修饰的病毒基因组，有效地将遗传物质递送到靶细胞中。可以使用这些质粒来制造病毒颗粒，例如慢病毒、逆转录病毒、AAV 或腺病毒颗粒，从而高效感染靶细胞。 拷贝数是什么？ 拷贝数是指