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第二节 基因工程的基本操作程序 人教版高中生物学教材《生物技术与工程》(选择性必修三)第三章 大家好,今天我们一起进行高中生物选择性必修三第三章第二节基因工程的基本操作程序内容的学习 1 问题探讨 苏云金杆菌 培育转基因抗虫棉需要哪几步? Bt基因 表达 苏云金伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 摄食 害虫死亡 2 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 (无抗虫特性) 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 问题探讨 3 基因工程的基本操作程序(4个步骤) 1 2 3 4 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 4 目的基因的筛选与获取 一、目的基因 (1)概念: 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因; 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。(Bt抗虫蛋白基因:转基因抗虫棉)。 主要是编码特定蛋白质的基因 (2)实例: 苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因(抗病毒、抗细菌)、种子贮藏蛋白基因及人胰岛素基因等。 5 目的基因的筛选与获取 二、筛选合适的目的基因 方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 越来越多基因的功能和结构被分析。 随着测序技术的发展,以及序列数据库(如GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等的应用,越来越多的基因的结构和功能为人们所知,为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。 认识基因结构和功能的技术方法:DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。 6 PCR技术:PCR是_的缩写,是一项根据_ 的原理,在_提供参与DNA复制的_与_,对_进行_的技术; 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外(PCR扩增仪/PCR仪) 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 特异性地快速扩增目的基因 原理 操作环境 目的 优点: 目的基因的筛选与获取 三、目的基因的获取 DNA复制所需的基本条件: 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 打开DNA双链 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 (体外用耐高温的DNA聚合酶) (体外用高温代替) (2种) 引物是一小段能与_的一段碱基序列_的_ DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 子链延伸 子链延伸 PCR条件 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) DNA模板 引物(2种) 稳定的缓冲溶液 (一般添加Mg2+) 四种脱氧核苷酸 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 PCR条件 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ A.变性 当温度上升到90 以上时,双链DNA解聚为单链 B.复性 当温度下降到50 左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 C.延伸 当温度上升到72 左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ PCR过程 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考: 1.PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因? PCR过程 思考:2. PCR技术最终哪部分被大量复制了? 引物对之间的部分 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 思考:3. PCR引物设计应遵循哪些原则? 引物自身及引物之间不应存在互补序列等 思考:4.一个DNA,一对引物(A与B),通过PCR扩增n次: 复制过程中共需引物_个 2n+1 - 2 PCR过程 基因表达载体的构建 一、基因表达载体的目的 (1)? (2)? 二、基因表达载体的组成 位置: 功能: RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质。 基因的上游(一段有特殊结构的DNA片段) 人们所需要的基因 位置: 功能: 基因的下游(一段特殊的DNA片断) 终止mRNA的转录 用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞 13 基因表达载体的构建 三、基因表达载体的构建过程 基因表达载体构建模式图 载体 (质粒) DNA分子 (含目的基因) 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 (重