2024届高三生物一轮复习课件PCR专题

PCR微专题 1、RT-PCR RT(reverse transcription)-PCR即反转录 聚合酶链反应,是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩 增 (PCR) 相结合的技术 RNA单链 DNA单链 RNA逆转录 SARS-CoV-2 RNA单链 逆转录酶 DNA单链 DNA单链 DNA聚合酶 DNA单链 cDNA扩增 2、实时(realtime)荧光定量PCR——rRTPCR 反向引物 R 正向引物 Q 反向引物 正向引物 Q R 步骤3 探针被切断 步骤4 聚合完成 反向引物 报告(荧光)基团 淬灭基团 Q R 正向引物 Q R 步骤1 聚合 反向引物 正向引物 Q R 步骤2 链取代 2019-nCoV 核酸检测 优点:早期诊断、灵敏度和特异性高,判断是否感染新冠病毒的直接接证据。 rRT-PCR可以分两部分来看,其中r代表实时(real-time),主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,即时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 ;RT表示逆转录(reverse transcription)。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。 2、实时(realtime)荧光定量PCR——rRTPCR “实时荧光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃,通常在l~2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针(如图1),其5末端连接荧光基团(R),3末端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时,R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中,当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答: 习题精练 (1)这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点,主要与试剂盒中的 、 有关。 (2)新冠病毒(nCoV-2019)是冠状病毒大家庭中的新的一员,其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性,与流感病毒碱基相似度也较高,但nCoV-2019有部分特有序列,那么实时荧光定量RT—PCR中引物、 TaqMan探针中碱基序列的设计应主要依据 ,以避免假阳性的出现。 引物 TaqMan探针 nCoV-2019特有序列 习题精练 (3)在实时荧光定量RT—PCR过程中,通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如下图)。最初数个循环里,荧光信号变化不大,设置为基线;之后进入指数增长期,在这个时期设置一个荧光阈值线;CT值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则CT值越小,起始模板量越 . 从而实现对起始模板的相对定量分析。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a,则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与 、 有关。 指数扩增期 平台期 大 扩增次数 病毒RNA初始数量 习题精练 变式2 (2022 扬州考前模拟节选)新冠病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(见图甲),通过实时荧光PCR检测新冠病毒感染时,检测到的荧光强度变化见图乙。 甲 乙 习题精练 举 题 固 法 (1)与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,原因有_。 (2)Ct值的含义:在PCR扩增过程中,每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此,当样本中初始模板越多时,Ct值就_。 (3)某新冠病毒核酸检测说明书标明,Ct≤37判定为阳性,Ct>40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为_。 (4)阴性结果也不能排除新冠病毒感染。可能产生假阴性的因素有_。 a.取样太早,样本中病毒量少,达不到实时荧光PCR检测阈值 b.样本被污染,RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 TaqDNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降 越小 阳性 abc 习题精练 举 题 固 法 (2022 扬州市高三期中)实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是:在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是( ) 习题精练(学案3.