2024年高中生物竞赛课件 第五章 DNA分子克隆(14生技版)

DNA分子克隆的一般过程 目的基因的获取 体外重组 导入到宿主细胞中进行扩增或表达 从众多的转化子中筛选和鉴定阳性克隆 第一节 目的基因的获取 首先是获得含目的基因在内的DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA分子； 已知的基因序列且比较小,可用人工化学直接合成； 如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因 一、PCR技术获取目的基因 1. cDNA的合成 cDNA 的合成可用 RT-PCR(reverse transcription PCR)法。也称反转录PCR。它是一种酶促合成法，即以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cDNA)，再经复制后即成双链DNA。 从真核生物中提取mRNA，由于mRNA后有80-200 bp的Poly(A)，用互补的12-18个核苷酸的Oligo (dT)合成的一种组织中所有mRNA对应的cDNA第一链。然后使用末端转移酶在cDNA第一链末端加上多聚C，经变性和水解mRNA后，加入末端为多聚G的引物合成其互补链(第二条链)，再经PCR进行大量扩增 因为真核生物的基因由编码的外显子和大量不编码的内含子两种序列组成，用这种方法得到的基因没有内含子，不具有启动子和终止子，所以缺乏功能活性。如果外接一段调节序列，就能在受体细胞中表达，所以此法是克隆真核生物基因的有效方法 自从1970年Temin等发现反转录酶以来，此法已广泛应用于人、猪、田鼠 、鸭的基因克隆 2.通过反向PCR进行基因组DNA片段的克隆 从基因组通过PCR克隆DNA片段关键是引物的设计，一般可以根据已经发表的DNA序列设计引物，也可以根据已有的cDNA或EST序列 设计引物。如果根据cDNA序列设计引物扩增gDNA(genome DNA)，设计引物时应该考虑到cDNA无内含子，而gDNA有内含子，设计的引物不应落在外显子的拼接点上。设计引物时，经常会在引物的末端加上一个酶切位点，以利于DNA片段和载体的连接 反向PCR是一种根据已知序列扩增其旁侧序列的方法，利用这种方法可以进行染色体步移 (chromosome walking)。反向PCR (I-PCR)是Triglia等1988年设计的一种方法(原理见图)。首先将基因组DNA用限制性内切酶切割，选择的限制酶应在已知序列中没有“切点”。然后通过连接酶将酶切片段连接，在连接产物中，那些包含已知序列的环状DNA会得到扩增，从而获得已知DNA片段的旁侧序列。I-PCR被用于从酵母基因组DNA中分离YAC克隆末端，从植物基因组DNA中分离转座子侧翼的特异区域；也被成功地应用于探测乙肝病毒(HBV)和T淋巴病毒(HTLV)的结合部位。然而I-PCR也存在着若干问题，比如环化反应难以控制，存在分子间的连接而形成大量的线状串联体，这导致非特异扩增，如果酶切片段太长，也会使扩增效率下降 染色体步移技术（genome walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。 8 3.锚定PCR与基因克隆 经RT-PCR得到的大量双链cDNA以后，如果要筛选出特定的目的基因，除了利用cDNA文库筛选外，还可利用锚定PCR得到。这种方法的特点是有一个特异性的引物, 适合于扩增那些只知道一段序列的目的DNA。如对一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给cDNA第一链末端加上一端多聚dC尾巴，然后加入1个多聚dG的特异引物。 其关键是5’引物，3’引物是通用锚定引物。5’引物决定了扩增的特异性，5’引物可以根据已知序列设计，也可以根据已知的蛋白序列设计 锚定PCR：anchored PCR, A-PCR 10 锚定PCR在生物遗传变异研究中已有初步应用。随着分子生物学的发展，锚定PCR有望成为研究生物遗传变异、种系发生、物种分类以及分子流行病等的有用工具 4.热不对称PCR 第二轮PCR则是以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物 第三轮PCR则是以AP1 Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物 最后切胶回收清晰的电泳条带，以SP3 Primer 为引物对PCR产物进行测序 解释清嵌套PCR、热不对称PCR、非特异条带、产物稀释100-1000倍是为什么？ 13 构建文库是先将细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将之与适当的载体进行体外重组；再引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA