2024年高中生物竞赛课件 第四章 基因工程主要技术及原理3诱变、DNA-蛋白质互作(tk)

第六节 基因定点诱变 （Site-directed mutagenesis ） 基因定点诱变指是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术，包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等 M.Smith（加拿大生物化学家） 1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术，1993年诺贝尔化学奖。 利用寡核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用 寡核苷酸定点诱变技术 一、盒式诱变（cassette mutagenesis ） 盒式诱变是一种定点突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代，又称DNA片断取代法。盒式诱变包括简单的盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 简单的盒式取代诱变是通过限制性内切酶切除特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接，得到取代突变，是一种定点诱变。 如果用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。 盒式取代诱变 使用化学合成含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分。 寡核苷酸引物需满足的条件(见何水林本P90) 二、寡核苷酸引物诱变 三、PCR定点诱变 1.同源重组法     引物 1和3 为致突变引物，引物 2和4 为准确配对引物。      作用原理如图 ，过程包括：     ① 以 1、2 和 3、4 分别为引物进行 PCR ，得到引入了突变的线状 DNA 分子。     ② 线状 DNA 分子转化同一宿主。     ③ 同源重组得到环状的引入了突变的目标 DNA 。 同源重组法定点诱变原理图 2.Dpn I 法 Dpn I 是一种限制酶，可切割甲基化的识别序列 作用原理如下图 所示，作用过程包括：      以野生型 DNA 为模板，致突变引物扩增出目标分子。   依赖甲基化的限制性内切酶 Dpn I 特异性降解模板 DNA （模板DNA在宿主体内的内源性Dam甲基化酶作用下已完全甲基化）。   扩增产物连接，转化大肠杆菌，得到大量复制。 Dpn I 法定点诱变原理图 Dpn I 识别序列及切割位点： 5' ... G A ^ T C ... 3' 3' ... C T ^ A G ... 5' 来源: 重组E. coli菌株，包含克隆于Diplococcus pneumoniae G41 (S. Lacks) 的Dpn I 基因。热失活； 80℃ 下20分钟。 注意：只有当识别位点被甲基化时，Dpn I 才能切割。从dam+菌株纯化而来的DNA才能成为Dpn I切割的底物。 #R0176V 500 units 310.00 元 #R0176S 1,000 units 696.00 元 #R0176L 5,000 units 2,784.00 元 CH3 CH3 3.重叠延伸（Overlap  extension） 对于两个具有部分重叠序列的 DNA 片段，在经过变性和复性后，两个 DNA 片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在 DNA 聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导 DNA 的合成，从而形成杂合 DNA 双链 大引物诱变:核心是第一轮PCR产物为第二轮PCR引物; 大引物提高了Tm值故过程简化了 PCR定点诱变法的优缺点 优点：获得目的突变体效率高（100%） 缺点：① PCR产物必需连接到载体分子上，才能实现转录和翻译等； ② Taq DNA聚合酶会出现错配，故结果必须测序验证，防止出现非目标突变 第七节 DNA-蛋白质相互作用 凝胶阻滞试验 DNaseⅠ足迹试验 甲基化干扰试验 体内足迹试验 酵母杂交系统 染色质免疫沉淀技术 蛋白质与DNA互作分析方法有很多： 凝胶阻滞试验 DNaseⅠ足迹试验 甲基化干扰试验 体内足迹试验 酵母杂交系统 染色质免疫沉淀技术 噬菌体展示技术 核酸适体技术 生物信息学方法 蛋白质芯片技术 纳米技术 一、凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验，DNA mobility shift assay） 1.原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。 若DNA分子与某蛋白质结合，总分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞在特定电压