2024年高中生物竞赛课件 第四章 基因工程主要技术及原理2 PCR 、DNA测序(tk)

第 四 章 基因工程的主要技术及原理 (polymerase chain reaction, PCR) 聚合酶链式反应 第 四节 一、什么是PCR ? 是体外核酸扩增技术。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的K.B. Mullis 等发明的，因此于1993年获诺贝尔化学奖。 DNA是由四种碱基按互补配对原则组成的螺旋双链。在细胞内， DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，RNA聚合酶合成一小段引物（primer）结合到DNA模板上，最后， DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链 PCR就是在体外模拟DNA复制的过程，它用加热的办法让DNA片段变性变成两条单链，让人工合成两个引物结合到DNA模板两端， DNA聚合酶即可以大量复制该模板。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点 AGAACTT TCTTGAA AGAACTT TCTTGAA TCTTGAA AGAACTT 亲代DNA 子代DNA 二、 PCR的基本原理 DNA的复制 (replication) 由亲代DNA合成两个相同的子代 DNA的过程 （一）原理 在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应 PCR反应扩增的是一对引物之间的DNA片段 （二）基本过程 变性：加热使双链DNA变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部 形成杂交链 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应 （三）PCR基本反应 以DNA为模板的反应 反应体积：50~100μL buffer 引物一对 底物：4种dNTP 模板：102~105拷贝 耐热DNA聚合酶（ TaqDNA聚合酶、） 矿物油 模板DNA的用量可根据其分子量的大小调整 PCR缓冲液 在PCR体系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl （pH8.3-9.0），其中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心， Mg2+的浓度可影响PCR扩增产物的特异性。 K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火 明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用 循环参数 变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94 ℃ ，1min；95 ℃ ，30 s ；97 ℃ ，15 s ； 退火温度和时间：45~55 ℃ ，30 s~1 min 延伸温度和时间：72 ℃ ，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3~4kb,3~4min 循环次数：25~35次，视最初靶分子浓度而定 PCR过程中片段增殖的计算 Cycle number Long strands Short strands 0 2 0 1 4 0 2 6 2 3 8 8 4 10 22 5 12 52 6 14 114 20 42 221 X 2（X+1） 2（X+1）-2（X+1） 单击此处编辑母版文本样式 第二级 第三级 第四级 第五级 （一）PCR引物设计 PCR效率和特异性取决于两个方面：一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。 5′引物和3′引物 设计引物时，通常以信息链为基准，5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成；3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成 三、PCR相关知识 PCR引物设计原则 1.引物长度一般15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物成本增加 2.引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54℃ 3.引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。一般引物自身存在的连续互补序列，不超过3bp 4.两引物之间不应存在互补序列，尤其是3′端 5.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6.引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们