2024年高中生物竞赛课件 第三章 基因工程的载体(tk)

《基因工程》之 第三章 基因工程的载体 ◆ 载体的功能及其特征 ◆ 质粒载体 ◆ 噬菌体载体 ◆ 其他载体 1 一、什么是基因工程载体？ 基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞进行扩增和表达的DNA分子 如质粒载体、噬菌体载体、细菌人工染色体载体及酵母人工染色体载体等 1 2 3 概 述 二、载体的功能 A.运送外源基因高效转入受体细胞 B.为外源基因提供复制能力或整合能力 C.为外源基因扩增或表达提供条件 pUC18 DNA sequence 载体的功能及特征 1.具有对受体细胞的可转移性 2.在特定受体细胞中有合适的整合位点或自身有功能完整的复制起点 3.具有多种单一的酶切位点 4.具有合适的选择性标记 5.长度尽可能小，以提高其载装能力 6.有较高拷贝数，如松驰型质粒 载体的功能及特征 三、载体应具备的条件 1 2 3 4 可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒 第一节 克隆载体 1 2 3 4 一、质粒载体 克隆载体 （一）质粒的基本特性 A 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶 B 可扩增性 　 质粒按复制方式分为两类：松弛型复制及严紧型复制 氯霉素扩增 C 不相容性 野生型质粒及其衍生的重组质粒属不相容质粒 D 转移性 据tra基因有无： 接合型质粒 非接合型质粒 克隆载体 1 2 3 4 基因工程由于使用非接合型质粒因此质粒的转移需人工条件：化学的（氯化钙）、物理的（电击）、其它方法（脂质体）改变细胞膜特性。 1 2 3 4 质粒在自然条件下可从宿主菌中消失，或在人工条件下消失，叫做质粒的消除，俗称丢失。 可致质粒丢失的因素：吖啶橙、结晶紫、溴化乙锭、利福平、SDS、紫外线等 常见质粒特性及复制子类型 质粒 复制子类型 拷贝数 用途 pBR322 pMB1 15～20 早期克隆载体 pUC系列 pMB1（改良） 500～700 常规克隆载体 pET系列 pMB1 15～20 常规表达载体（T7） pGEM系列 pMB1（改良） 300～700 克隆与表达载体（T7） pSP系列 pMB1（改良） 300～700 克隆与表达载体（T7） 克隆载体 1 2 3 4 人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 　　1)测序质粒 　　2)整合质粒 　　3)穿梭质粒 含有两个不同的复制子 　　4)表达型质粒 可使宿主呈现新性状，也称显性质粒 　　5)探针质粒 克隆载体 1 2 3 4 关于穿梭质粒 克隆载体 1 2 3 4 早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌-牛乳头瘤病毒 迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体 pBR322 Plasmid （要小写） 实验编号 （二）质粒载体的命名 实验者或实验室名(需大写) 克隆载体 1 2 3 4 在这里“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母，“322'’系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别 ★ pBR322质粒图谱 ① ② ③ ④ 克隆载体 1 2 3 4 分离质粒DNA的方法：SDS裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般用碱变法制备质粒DNA：培养收集菌体——用溶菌酶或SDS裂解细胞———将质粒DNA和染色体DNA分开，苯酚和氯仿抽提除去Pr和用RNase消化掉RNA。（注：纯化DNA有利于后面对该DNA的操作） 用琼脂糖凝胶电泳检测不同相对分子量的DNA。不同构型的也会出现差异： l-DNA 最靠后， oc-DNA次之，ccc-DNA会最靠前沿 克隆载体 1 2 3 4 （三）质粒DNA的制备 SDS碱裂解法： 　 （1）将菌体悬浮在含有EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)的缓冲液体中 　　（2）加溶