3.2基因工程的基本操作程序第2课时课件2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

二、基因表达载体的构建（核心工作） 获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？ 不能，因为目的基因很难在受体细胞中稳定存在。 基因工程的基本操作程序 1.基因表达载体的作用 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代 ②使目的基因在受体细胞中能够表达和发挥作用 2.基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 便于重组DNA的筛选 DNA聚合酶结合位点 保证目的基因能在受体细胞中自我复制 供目的基因插入载体中 基因工程的基本操作程序 2.基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。 位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。 启动子和终止子都是有特殊序列结构的DNA片段 基因工程的基本操作程序 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 诱导型启动子 激活或抑制目的基因表达 2.基因表达载体的组成 基因工程的基本操作程序 启动子与终止子分别位于目的基因的首尾端， 作用：起始和终止转录过程。 起始密码子与终止密码子分别位于mRNA分子的首尾端， 作用：起始和终止翻译过程。 2.基因表达载体的组成 区别启动子、终止子、起始密码子、终止密码子 基因工程的基本操作程序 3.基因表达载体的构建过程 限制酶 限制酶 同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割 DNA 连接酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 限制酶切割位点 质粒 重组 DNA分子 基因工程的基本操作程序 3.基因表达载体的构建过程 限制酶 限制酶 DNA 连接酶 质粒 重组 DNA分子 第1步： 用同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。 第2步： 用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 基因工程的基本操作程序 拓展：“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体 用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段 构建基因表达载体 1.单酶切 a b c d a、b、c、d四个黏性末端相同。 限制酶切割 DNA连接酶连接 启动子 方向 目的基因转录方向 思考：单酶切有什么缺点？ 基因工程的基本操作程序 单酶切有什么缺点？ 缺点1： 在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 DNA连接酶连接 基因工程的基本操作程序 9 单酶切有什么缺点？ 缺点2： 在DNA连接酶的作用， 目的基因被环化。 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 DNA连接酶连接 基因工程的基本操作程序 10 单酶切有什么缺点？ 缺点3： 在DNA连接酶的作用，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 反向连接重组DNA 基因工程的基本操作程序 11 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 缺点1 缺点2 缺点3 思考：如何克服以上缺点？ 单酶切的缺点 反向连接重组DNA 质粒重新环化 目的基因被环化 基因工程的基本操作程序 12 2.双酶切 用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段 构建基因表达载体 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。 基因工程的基本操作程序 2.双酶切 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 质粒不会重新环化 目的基因 不会被环化 优点1 优点2 优点3 目的基因与质粒 不会发生反向连接 基因工程的基本操作程序 1.构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 基因工程的基本操作程序 2.选择哪些限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段? 使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、含目的基因的DNA片段。 基因工程的基本操作程序 1.区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子：启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 2.图解限制酶的选择原则 核心归纳 基因工程的基本操作程序 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Ps