备课素材：细胞培养的常见污染类型-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

细胞培养的常见污染类型 由于缺乏机体免疫系统等的保护，体外培养的细胞没有对微生物的防御能力。在体外培养环境中，有些微生物在摄取营养物质方面有竞争优势，并在短时间内排出大量代谢产物；有些微生物则附着在细胞表面或进入细胞内部。因此，微生物污染会对体外培养细胞的正常生存、生长及功能活动造成极大干扰，严重的可致细胞死亡。同时，实验结果的准确性和可靠性也大打折扣。所以，保持细胞生存环境无微生物污染是体外实验的前提条件。良好的无菌操作可大大降低细胞培养中的微生物污染风险。 微生物对细胞的影响因污染物和细胞种类的不同而表现各异，一般当污染物持续存在时，轻者细胞增殖生长缓慢，分裂相减少，细胞变粗糙，轮廓折光增强；重者细胞停止增殖，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或从瓶壁脱落。 若发生微生物污染，一般应及时将被污染的培养物及相关试剂在灭菌后按正规程序丢弃，与被污染培养物接触过的器材也应及时消毒灭菌，防止污染的再次发生。微生物污染的消除非常困难，且应保持隔离并严密监控，因此不要轻易尝试消除污染，除非细胞至关重要且不可替代。由此可见微生物污染的预防十分重要。为此，首先介绍如何判断常见的污染。 常见污染细胞的微生物有细菌、真菌、支原体、病毒等，不同污染物对细胞的影响有区别，真菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内（如48 h）压制细胞生长或产生有毒物质，而支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的。细菌、真菌的污染可通过肉眼和常规显微镜观察到，支原体、病毒污染的确定则一般需借助其他检测方法。 ㈠细菌污染 细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5 μm，长度约0.5 ~ 5 μm）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分类方式繁殖和水生性较强的原核微生物。细菌增殖速度很快，能短时间在培养系统内产生大量细菌，从而导致培养基浑浊（有时静置的培养基初看不浑浊，但稍加振荡，就有很多浑浊物漂起；有时在培养基表面会出现轻微的薄膜或泡沫，或在培养物生长表面出现点状物，移动培养器皿时则消散）并变为黄色（细菌污染后大多能改变培养基pH）。用倒置相差显微镜观察，视野内可见点状的细菌颗粒，并可能出现由细菌迁移引起的闪动，一些细菌会成团或结合培养的细胞。 在细菌污染初期，若使用了抗生素，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置相差显微镜也不易观察、判断，此时若怀疑有细菌污染，可用无抗生素的培养液常规培养观察。若未使用抗生素，培养液改变不明显，但又疑有污染，可取一份培养基样本接种到营养琼脂培养检测。 需注意细菌污染有时可能会和培养基组分的沉淀或细胞碎片混淆，但细菌形态一致，而沉淀或碎片则形态不同，并且通常大小不一；细菌团可能与沉淀的蛋白质混淆，但细菌团内可见很多单个或成串的细菌（特别是晃动后），蛋白质沉淀则不然。 细菌数量较多时会使原先清晰的培养背景变得模糊，甚至覆盖培养物，对培养物的生存构成直接的威胁。迅速增殖的细菌，会消耗营养液和产生毒素从而抑制细胞生长，毒性大的细菌会很快导致细胞崩解死亡。 ㈡支原体污染 支原体是介于细菌和病毒之间能独立生活的最小微生物，无细胞壁，形态多变，大小介于0.2 ~ 2 μm之间，多吸附在细胞表面或散在于细胞之间。不同支原体的生物学性状有很大差别，一般对热敏感，对青霉素普遍有抗药性。由于支原体无致死细胞毒性且可与细胞长期共存，故培养基一般不发生浑浊，无明显变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。除了细胞培养状况不佳，采用常规显微镜并不容易观察支原体污染，其检出需借助荧光染色、PCR、ELISA、免疫染色、放射自显影术、微生物学分析等方法，其中采用核酸荧光染料进行DNA染色是最简单和最可信的方法之一。 当进行荧光染色时，在40×或100×物镜下支原体可被显示为细胞质上明确的微粒或丝状染色，一般大小、性质一致，此时同样被亮染的培养细胞的细胞核可作为阳性对照。确定是否存在支原体污染需尽可能多地观察染色样本，因为不是所有培养的细胞都会被污染。 用荧光染色法进行支原体检测时，培养物的细胞碎片可能会造成假阳性结果，但细胞碎片不会出现清晰的点状或丝状支原体形态。若仍不能确认，可吸取适量待检培养基与指示细胞（为已明确无支原体污染且是支原体的适宜宿主，同时生长良好，有足够的细胞质以显示粘附的支原体，如MDCK细胞）共培养，然后荧光染色来观察指示细胞表面是否有支原体，从而避免误判。 运用荧光染色法有时会观察到细胞质存在均匀亮染，这可能是由RNA引起的，这类荧光会逐渐变暗，可将染色样本干燥避光保存后在第2天观察。如果对荧光检测的结果存在怀疑，可重复检测或采用其他方法再次检测。 支原体可黏附在宿主细胞表面，从细胞膜获取脂质和胆固醇，造成细胞膜损伤。支原体能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞抗原性，导致染色体畸变，干扰病毒复制以及具有类似病