第10单元 第44讲 基因工程的基本工具与基本操作程序（word教参）-【正禾一本通】2024高考生物高三一轮总复习高效讲义（多选版,新教材新高考）

第44讲　基因工程的基本工具与基本操作程序 【课标要求】1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定这四个步骤。3.探究·实践：DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定。 　　考点1　重组DNA技术的基本工具 梳理必备知识 1．基因工程 (1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀” ①来源：主要是原核生物。 ②种类：迄今分离的限制酶有数千种。 ③特性：具有专一性。 ④作用：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ⑤作用结果：产生黏性末端或平末端。 [提醒]a.限制酶识别序列都可以找到一条中轴线，中轴线两侧的碱基呈中心对称(如图所示)。 b．判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的。 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” 常用类型 E.coli_DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，连接DNA片段，如图： (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②常用载体：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 ③特点及作用 特点 作用 能自我复制或整合到受体DNA上 保证外源DNA能够复制 有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段插入 有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选 【易错辨析】　 1．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。(×) 提示：DNA连接酶形成的是磷酸二酯键。 2．限制酶只能用于切割目的基因。(×) 提示：限制酶既能切割目的基因也能切割载体。 3．重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(×) 提示：重组DNA技术所需要的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，载体是工具，不是酶。 4．在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(√) 提升关键能力 限制酶的选择方法 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因。 ③可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，或者有相同的末端)，以避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接。 (2)根据载体的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因。 ③所选限制酶切割位点不应位于复制原点处，以防破坏复制原点。 ④尽量不选切割位点不止一个的限制酶，否则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含载体必备的结构，则切割重组后的片段不能进入受体细胞，或进入受体细胞后不能执行其功能。 ⑤所选限制酶，其切割位点应位于启动子与终止子之间。 ⑥若载体为Ti质粒，则所选限制酶切点应位于T－DNA区段。 【新情境·应用】 某个目的基因所在的DNA片段和载体限制酶切割位点分别如图所示(图中限制酶的识别序列及切割形成的末端均不相同)，分析并回答下列问题： (1)若只选用一种限制酶切割目的基因，应该选PstⅠ，原因是_PstⅠ的切割位点位于目的基因的两端，可以将目的基因“切出”，同时不破坏目的基因。 (2)若选用两种限制酶切割目的基因，应该选 PstⅠ和EcoRⅠ，原因是_既能将目的基因“切出”，又不会破坏目的基因。 (3)图2中可以用来切割质粒的限制酶是NdeⅠ、BamHⅠ，理由是其切点应位于启动子与终止子之间。 (4)XbaⅠ不能用来切割图2中的质粒，原因是_XbaⅠ在质粒上有不止一个酶切位点，可能会切去终止子。 (5)两种不同限制酶切割后末端可以连接的原因是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中限制酶的识别序列及切割形成的末端均不相同，欲让该抗病基因插入质粒，应在用PCR扩增该抗病基因时，在抗病基因两端分别引入NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列。 落实素养题组 题组1　重组DNA技术的工具 1．(2022·湖北武汉二