第七单元 第34讲 基因工程-【金版教程】2024高考生物一轮复习解决方案全书word（新教材，经典版）

第34讲　基因工程 一　基因工程的概念及基本工具 1．基因工程概念 (1)手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 基因工程的理论基础 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称：限制酶) ①本质：蛋白质。 ②来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ③作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ④结果：产生黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。 ②类型 常用 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 只“缝合”黏性末端 “缝合”黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 (3)载体 二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR特异性地快速扩增目的基因 PCR含义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNA半保留复制 要求 模板 目的基因两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 PCR反应过程 变性 当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72 ℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 扩增方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 方式 指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数) 结果 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 1．在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2．引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 3．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心工作 (1)操作目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)组成 (3)构建过程 1．目的基因应插入启动子和终止子之间。 2．若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用两种限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 3．将目的基因导入受体细胞 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物 细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞(受精卵) 显微注射技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞(原核细胞) Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境