备课素材：融合PCR-2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3

融合PCR 先看一道试题： 融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来构建融合基因的方法，其过程如下图1所示。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入小鼠细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光如图2所示  （1）图1第一阶段中PCR至少进行_____________次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 （2）若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来，需要设计________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有________种。 （3）图1所示的第二阶段的2次PCR应该分别如何选择引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。 引物1 引物2 引物3 引物4 PCR1 PCR2 （4）绿色荧光蛋白在图2研究中的主要作用是（________） A．追踪目的基因在细胞内的复制过程 B．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 C．追踪目的基因插入到染色体上的位置 D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构 （5）图2中载体上的Neo基因是一种抗生素抗性基因，图中步骤③所用的G418是一种抗生素(对细胞有毒害作用)，添加G418的目的是____________________。 （6）图2中步骤⑤要将细胞注射入图中囊胚的________位置。 （7）图中所用的胚胎干细胞在形态上具有________________________的特性 （8）图2中分娩出的小鼠C所有体细胞中的核基因________（是/否）相同。 【答案】 （1）2    互补配对    （2）6    4 （3） （4）B   （5）筛选出导入目的基因的胚胎干细胞  （6）内细胞团  （7）细胞体积小，细胞核大，核仁明显  （8）否 【解析】 （1）DNA分子具有半保留复制的特点，通过画简图可推知图1第一阶段中PCR至少进行2次循环，才能获得双链等长的DNA；第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。 （2）若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来，启动子与目的基因连接需要2种引物，同样目的基因和终止子连接也需要2种引物，同时在搭建而成的长的DNA分子的两端各需要1种引物，所以最终需要设计1＋2＋2＋1＝6种引物，其中两端的2种引物不能起“搭桥'的作用，因此能够起着“搭桥”作用的引物有6－2＝4种。 （3）根据题意和图解可知，引物2与引物3部分碱基具有互补配对关系，使得两DNA能成功“搭桥”连接起来，故PCR1不再另外需要引物即可完成；PCR2是AB基因融合后，进行的PCR扩增，需要引物1和引物4。 （4）将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，将该融合基因转入小鼠细胞内，表达出的蛋白质带有绿色荧光，从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布，故B项正确，A、C、D项错误。 （5）图2中载体上的Neo基因（一种抗生素抗性基因）相当于标记基因，图中步骤③添加G418（对细胞有毒害作用）的目的是筛选出导入目的基因的胚胎干细胞。 （6）图2中步骤⑤要将细胞注射入图中囊胚的内细胞团（将来发育成胎儿的各种组织）位置。 （7）胚胎干细胞在形态上具有细胞体积小、细胞核大、核仁明显的特性。 （8）据图2可知，小鼠C中只有后来转入到囊胚中的部分转基因胚胎干细胞发育成的组织细胞内含有融合基因，而受体囊胚中其他内细胞团细胞发育而成的组织细胞内没有融合基因，故图2中分娩出的小鼠C所有体细胞中的核基因不相同。 这道试题以融合PCR为情境考查PCR技术、基因工程、胚胎工程。 那么，什么是融合PCR技术? 一．什么是融合PCR技术： 融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。 传统的融合基因重组构建是以限制性内切酶和DNA连接酶为基础，即通过限制酶将两个DNA分子进行酶切后，用连接酶将两个具有相同末端酶切位点的DNA片段进行连接。这不仅需要对DNA片段的限制酶切位点有所了解，而且对于过片段连接有时很难找到合适的内切酶对DNA片段进行酶切，对于过短的片段又增加了连接和鉴定的难度，同时在连接过程中还引入了不必要的酶切位点碱基序列，因此，在某种程度上限制了该方法的应用。 二．融合PCR技术的原理： 通过在上游引物的 5’端添加一段帽子序列,这 段帽子序列与靶 1 序列同源;而此引物的 3’端序列与靶 2 序列同源。这样,在第一个 PCR 反应中,以靶 2 序列为模板