专题九 精研重难点(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建(Word教师用书)-【新高考方案】2023高考生物二轮复习专题增分方略（新教材Ⅱ）

精研重难点(二)　 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建 从“高度”上研究高考 [典例]　(2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： (1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为__________。 (2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用____________酶将载体P切开，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coli DNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的____________和______________。选用____________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_____________ ____________________________________________________________。 [解析]　(1)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于A位点和B位点的外侧。(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入Xho Ⅰ和Pst Ⅰ两个酶切位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。 [答案]　(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4 DNA　②启动子　终止子　Xho Ⅰ和Pst Ⅰ　钙　(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 从“深度”上提升知能 1．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙) (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) 2．基因表达载体的构建过程 从“宽度”上拓展训练 1．如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列(　 ) A．NdeⅠ和BamHⅠ　　　B．NdeⅠ和XbaⅠ C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ 解析：选A　构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。 2．为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合(如图)，然后导入棉花细胞。下列相关叙述错误的是(　 ) A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因 B．与只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ同时处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．在含卡那霉素培养基上可