3.2 基因工程是一种重组DNA技术（教学课件）生物沪科版选择性必修3

第二节 第3章 基因工程 选择性必修3 基因工程是一种重组DNA技术 学 习 目 标 1.在准确阐述重组DNA技术三大基本工具的基础上，能领会并运用 DNA分子操作的基本原理；结合限制性内切核酸酶的科学发现过程，提升科学思维。 2.在完整阐述基因工程四大操作步骤的基础上，能从PCR获取目的基因以及目的基因表达产物检测和鉴定中举例总结科学探究的基本程序，并能对给定的基因工程项目提出合理的设计操作方案。 基因工程流程： 基因工程是如何实现人胰岛素大规模生产的呢？首先必须获取人胰岛素基因（目的基因），其次将之安装在合适的载体上，然后把重组好的 DNA 分子（表达载体）导入合适的受体细胞中，并对目的基因及其表达产物进行鉴定，最后借助这种含重组 DNA 分子的受体细胞大量生产重组人胰岛素。 由此可见，重组 DNA 技术的基本操作包括获取目的基因、构建表达载体、导入受体细胞、筛选和鉴定含目的基因的受体细胞等基本步骤。 如何才能将人胰岛素基因与另一种 DNA 分子（载体DNA）重组在一起呢？让我们按照下列方法模拟DNA重组的基本过程。 材料准备：代表人类染色体 DNA 的纸条（长 10 cm、宽 0.5 cm），在上面画出长 2 cm 的红色区域，代表人胰岛素基因；代表另一种 DNA 分子的环形纸条（即载体，直径 5 cm、宽 0.5 cm）。 实践操作：尝试将人胰岛素编码基因拼接至载体DNA 特定位点处。 材料阅读：模拟 DNA 重组 思考与讨论： 为完成上述重组操作，哪些步骤和工具是必需的？ 1．DNA重组需要三种基本工具 限制性内切核酸酶 ①作用：识别双链DNA特定的序列（长度通常为4～8个碱基对），能断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，从而切开DNA分子的两条链。 ②例子：EcoRI限制酶能专一识别5'-GAATTC-3'序列，并在G和A之间将这段序列切开。 无论 EcoRⅠ还是 PstⅠ，切割后形成的双链 DNA 片段末端会呈单链突出，但两种酶切产物的单链突出方向有所不同。 如果线形 DNA 分子两个端点的单链突出部分呈序列互补性且方向相同，那么它们便能在较低温度下重新“粘”在一起（即互补碱基之间形成氢键），这样的单链末端称为黏性末端。 限制性内切核酸酶 载体 （1）定义：任何具备在受体细胞中独立复制的 DNA 分子。 （2）种类：存在于微生物细胞内的质粒DNA（双链环状DNA分子）、大多数生物内的病毒DNA。 质粒并非其宿主正常生长所必需，但大都携带抗生素抗性等基因，因而能帮助宿主抵御环境不利因素的影响。 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制，还能通过感染将其 DNA 高效导入宿主细胞中。 电子显微镜照片显示一个细菌破裂后拟核 DNA 和质粒的透射电子显微镜照片（2700×，左上角为单个质粒的放大图） 载体 （3）特点： a.能在受体细胞中复制并稳定保存，当中的基因能进行转录； b.有适宜的限制酶切点,能装载目的基因； c.带有某些标记基因，便于筛选。 比较几种酶的作用 2．PCR 是获取目的基因的主要方法 1.获取目的基因的方法： ①如果目的基因的部分序列已知，可采用聚合酶链式反应（PCR），这是获取目的基因的主要方法。 ②如果目的基因的完整序列已知，可采用化学合成法 。 ③如果基因序列未知，采用大规模筛选的方法。 化学合成法 PCR技术 ①定义：模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术 ②特点：微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域DNA序列 ③前提条件：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成DNA引物 PCR技术 ④要求： DNA模板：目的基因两条链 原料：四种脱氧核苷三磷酸，即dCTP、dATP、dGTP、dTTP 酶：耐热 DNA 聚合酶 引物：人工合成的与模板DNA发生碱基互补配对的单链核酸。 PCR技术 补充：PCR扩增技术为什么要使用引物和耐热DNA聚合酶？ 迄今为止，几乎所有生物体内发现的 DNA 聚合酶都不能以单个脱氧核苷酸为起点，将游离的脱氧核苷酸从头聚合形成多核苷酸链，而只能将脱氧核苷酸掺入到一段已存在的核苷酸链上。就大多数生物而言，引物通常为 6 ～ 8 个碱基长度的单链 RNA 分子。 由于引物是根据碱基互补配对原理“搭在”DNA 模板特定区域上的。在较低的温度下，引物可能会与不完全配对的 DNA 模板区域结合，造成 PCR 扩增产物的多样化。随着扩增轮数的递增，DNA 扩增产物的浓度急剧上升，严重影响 PCR 系统中的分子扩散，直至过早终止扩增反应。PCR 的连续多轮循环必须在高温条