3.2 基因工程是一种重组DNA-2023-2024学年上海地区高二生物同步备课高效课件（沪科2020选择性必修3）

选修3 生物技术与工程 第3章 基因工程 第2节 基因工程是一种重组DNA技术 本节重点 1、简述DNA重组技术所需的三种基本工具 2、简述重组 DNA 技术的基本操作 什么是DNA重组？包括哪些类型？ 观看《DNA重组》视频 每一种限制性内切核酸酶识别双链DNA特定的序列， 20世纪60～70年代，限制性内切核酸酶的发现使人们能够对双链DNA分子进行精确切割。 目前，在细菌中已发现了上千种限制性内切核酸酶， 长度通常为4～8个碱基对（bp），称为识别序列。 例如，限制性内切核酸酶EcoRⅠ的识别序列为5'-GAATTC-3'； 而PstⅠ的识别序列则为5'-CTGCAG-3'。 从而切开DNA分子的两条链。 如图所示，当限制性内切核酸酶与双链DNA的识别序列结合后， 便能断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间（即切割位点）的化学键， 那么它们便能在较低温度下重新“粘”在一起（即互补碱基之间形成氢键） 但两种酶切产物的单链突出方向有所不同, 无论EcoRⅠ还是PstⅠ，切割后形成的双链DNA片段末端会呈单链突出， 这样的单链末端称为黏性末端。 从图中还可以看到，如果线形DNA分子两个端点的单链突出部分呈序列互补性且方向相同， 两种不同的限制性内切核酸酶产生的黏性末端相同 因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 黏性末端之间在低温下形成的氢键并不牢固， 便需要使用另一种工具：DNA连接酶。 若要使两个黏性末端牢固地连为一体， 大多数生物的DNA连接酶能封闭双链DNA分子中的单链“缺口” 即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键） 因为缺少复制所必需的特定DNA序列。 将外源基因导入受体细胞中，为什么要使用载体呢？ 这种复制能力一般情况下也难以在受体细胞中正常发挥。 因此，要让外源DNA在受体细胞中复制，就需要一种合适的运载工具 也就是说，任何具备在受体细胞中独立复制性能的DNA分子，理论上均可用作基因工程的载体。 大部分DNA片段（尤其是目的基因）并不具备可遗传的自我复制能力， 而且，即便一个DNA片段能在原供体细胞中复制， 为其提供在受体细胞中复制的能力，这种用于重组DNA技术的运载工具称为载体。 即广泛存在于微生物细胞内的质粒DNA以及存在于大多数生物体内的病毒DNA。 生物界至少存在两大类能独立于拟核DNA或染色体DNA而自主复制的小型DNA分子， 观看《质粒》视频 即广泛存在于微生物细胞内的质粒DNA以及存在于大多数生物体内的病毒DNA。 大多数质粒是一类双链环状DNA分子。 因而能帮助宿主抵御环境不利因素的影响。 还能通过感染将其DNA高效导入宿主细胞中。 生物界至少存在两大类能独立于拟核DNA或染色体DNA而自主复制的小型DNA分子， 质粒并非其宿主正常生长所必需， 但大都携带抗生素抗性等基因， 病毒不仅能在宿主细胞中自主复制， 采用何种方法分离获得特定的目的基因，取决于我们对目的基因背景知识的了解程度。 目的基因是人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。 例如，在规模化生产人胰岛素的基因工程中，人胰岛素基因就是目的基因。 也是基因工程项目实施的首要阶段。 如果基因序列未知，则采用基于大规模筛选的方法获得。 从供体生物的DNA中有效分离和克隆目的基因是基因工程各项产业化应用的前提， 如果目的基因的部分序列已知，可采用聚合酶链式反应(PCR）； 如果目的基因的完整序列已知，可采用化学合成法； PCR是一项模拟细胞内DNA复制过程的DNA体外扩增技术， 利用这项技术可由微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列。 观看《PCR》视频 采用PCR扩增技术获取目的基因需要DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）以及缓冲液系统。 由于几乎所有生物来源的DNA聚合酶只能在一段与模板DNA发生碱基互补配对的单链核酸（称为引物）存在的条件下，才能催化DNA链的延伸聚合反应。 因此，PCR扩增目的基因的前提条件是目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成DNA引物。 系统温度缓慢降至55～68℃，使两条不同的引物分别与两条单链DNA模板结合； PCR的基本程序如下： 系统温度升至95℃，使待扩增双链DNA样品变性， 形成单链模板； 系统温度升至75℃左右，DNA聚合酶催化从两条引物的一端以相反方向合成新的DNA子链。 上述系统温度升降均由PCR扩增仪自动完成。 （1）变性： （2）退火： （3）聚合： 重复上述操作n次，理论上即可从1分子的双链DNA模板扩增至2n个分子。 将PCR扩增获得的目的基因和合适的载体用相应的限制性内切核酸酶切割出黏性末端（简称“切”）， 因而可在较低温度下（一般在4～26℃）“粘”在一起， 形成含目的基因且能表达的表达载体，该过程称为表达