1.2基因工程的基本操作步骤基础知识2021-2022学年高二下学期生物人教版选修3

第2节—基因工程的基本操作步骤 基本操作步骤为：提取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与表达 考点一、目的基因的获取 获取目的基因是实施基因工程的第一步。 1、目的基因 主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作 用的因子。 2、获取目的基因的三种常用方法 （1）从基因文库中获取目的基因 ①基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片 段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种 生物的不同的基因，称为基因文库。 ②基因文库的种类 a.基因组文库：包含一种生物所有的基因。 b.部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。 说明：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫这种生物的CDNA文库。 ③cDNA文库与基因组文库的区别 文库类型 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 cDNA 文库 小 无 无 某种生物的部分基因 基因组文库 大 有 有 某种生物的全部基因 真核生物与原核生物的基因有以下区别： a.原核生物的基因组成：原核生物基因分为编码区、非编码区，如下图： 编码区与非编码区的定义： 编码区指基因上能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成的部分，即能够编码蛋白质的部分。 非编码区则相反，不能编码蛋白质，但是其对遗传信息的表达必不可少，其上有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子和终止子。 编码区与非编码区的位置： 非编码区位于编码区的上游及下游。在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的启动子，它在目的基因的首端，能与RNA聚合酶识别并结合，驱动目的基因转录出mRNA的一段具有特殊序列的DNA片段。 b.真核生物的基因组成：真核细胞的基因也由编码区、非编码区组成，但比原核细胞的基因复杂些，如下图： 真核细胞基因在非编码区上，同样有具调控作用的启动子和终止子，与原核细胞基因的不同之处在编码区，其编码区是间隔的、不连续的，被不能编码蛋白质的序列（编码区上能够编码蛋白质的序列叫做外显子，不能编码蛋白质的序列叫做内含子）分隔开来成为一种断裂的形式。 注意：真核生物的cDNA文库中的目的基因是根据mRNA反转录获得的，不含有启动子、内含子序等， 而基因组文库中的目的基因是直接从生物中得来的，含有启动子、内含子序列等。 （2）利用PCR技术扩增目的基因 ①PCR技术：PCR是多聚酶链式反应的缩写，它是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 ②PCR原理：DNA双链复制。 ③前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列（以便根据这一序列合成引物）。 ④条件：热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、模板DNA、引物、四种游离的脱氧核苷酸 ⑤扩增过程：目的基因DNA受热变性后解旋为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在热稳定性 DNA聚合酶（Taq酶）作用下进行延伸，如此重复循环多次。如图所示。 ①变性：双链DNA片段在90-95℃下解聚为单链； ②复性（退火）：两种引物在适当温度（55-60℃）下，与模板DNA的目的序列通过碱基互补配对形成氢键，而结合； ③延伸：温度为热稳定DNA聚合酶的最适温度（70-75℃），在模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸（原料）、适宜缓冲液（Mg2＋）构成反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对引物（引物1、引物2）所界定的DNA片段进行扩增。 要点诠释： ①PCR技术扩增DNA片段是通过上述三步反应的不断循环完成的。由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式增加，理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍。如经过20个循环后，特定DNA片段的数量在理论上可增加约106倍，从而实现了体外DNA分子的大量迅速扩增。 ②在开始几个循环中含有长短不一的产物，但在以后的循环直至最终产物均是以两个引物界定的DNA第3个循环开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（两个引物界定长度的DNA片段） 片段为主。图示如下： 注意：利用PCR技术扩增目的基因可以在PCR 扩增仪中自动完成。 （3）人工合成目的基因 化学合成法：基因比较小，且核苷酸序列可知时，可用化学方法来人工合成。可以获得自然界没有 的新基因。 反转录酶法：经反向转录酶的作用，以mRNA为模板获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制 形成双链DNA（cDNA）。反转录操作步骤如下： 要点二、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 1.操作目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥