2022届高三生物一轮复习必背知识点选修1专题五 DNA和蛋白质技术

2022高考必背知识点【人教版】 《选修一 生物技术实践》 专题五 DNA和蛋白质技术 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 1.蛋白质分离的方法：凝胶色谱法和电泳法 2.凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质，移动速度慢，后洗脱出来；相对分子质量较大的蛋白质，移动速度快，先洗脱出来。 3.缓冲溶液 (1)作用：在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 (2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 4.电泳法(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 (2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷相反的电极移动。电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 (3)分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能消除净电荷对迁移率的影响，SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。（小分子走在前，大分子滞后） 5. 蛋白质的提取和分离步骤： （1）样品处理：包括红细胞的洗涤（目的是去除杂蛋白），血红蛋白的释放，分离血红蛋白溶液。 红细胞洗涤干净的标志：上清液不再呈现黄色 蒸馏水作用：使红细胞吸水涨破，释放血红蛋白。 甲苯：溶解细胞膜磷脂，加速细胞破裂。 分离血红蛋白溶液的结果：第1层最上层：甲苯层无色透明, 第2层中上层：脂溶性物质沉淀层白色薄层固体, 第3层中下层：血红蛋白的水溶液层红色透明液体, 第4层最下层：杂质沉淀层暗红色 （2）粗分离：透析（目的除去分子量较小的杂质） ①原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内 ②过程：血红蛋白溶液装入透析袋→将透析袋放入磷酸缓冲液中(模拟细胞内的PH环境，保持血红蛋白的正常结构和功能)→透析12h （3）纯 化：凝胶色谱法（目的除去分子量较大的杂质蛋白） （4）纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，鉴定纯化后的蛋白质的纯度。 6.凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作。 准备材料→加工橡皮塞→安装玻璃管。 ②凝胶色谱柱的装填。 ⅰ.材料：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。 ⅱ.方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。 ⅲ.注意事项 a．商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀； b．装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀； c．不能有气泡存在，防止其搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果； d．不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 ⅳ.检验：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。 ③样品的加入与洗脱 调整缓冲液面：与凝胶面平齐 　 ↓ 滴加透析样品： ↓ 样品渗入凝胶床：打开下端出品，使样品渗入凝胶床内 　 洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 ↓ 收集 (待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，,每5 mL收集一管，连续收集) 7.操作提示 （1）红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 （2）色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。 （3）凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 （4）蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。 学科网（北京）股份有限公司 $