【名师原创】2013-2014学年高中生物选修一 5-3 血红蛋白的分离和提取 课件+实验视频（3份）

课题3 血红蛋白的提取和分离 一、基础知识： （一）蛋白质提取和分离原理 （二）蛋白质提取和分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法 （三）缓冲液的作用 二、实验操作－－实验步骤 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白 样品处理 和粗分离 纯 化 纯度鉴定 蛋白质提取与分离的依据－－ 蛋白质的物理化学性质差异： 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力 1.凝胶色谱法 （1）原理： （2）材料：凝胶 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道. 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法 概念： 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 2．凝胶电泳法： 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 2）影响蛋白质分子运动速度的因素 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 影响蛋白质分子运动速度的因素 √ √ √ √ √ √ √   决定 运动方向 电场 作用力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 （4）缓冲溶液－－洗脱剂 作用： 配制： 调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 （模拟生物体内的过程） 思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？ 血液组成成分 阅读思考： 血液由______和________两部分组成。 血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。 该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。 血浆 血细胞 红细胞 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？ 血液 100mL 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 2.释放血红蛋白 阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 蒸馏水的作用是______________________________。 加入甲苯的作用是____________________________。 充分搅拌的目的是____________________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞 混合液 烧杯 有机溶剂 血红蛋白 滤纸 过滤 脂类物质 高速离心 10min 离心管 4.透析血红蛋白 透析的目的是什么？ 去除血红蛋白中的小分子杂质 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL 1mL 纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？ 步骤 操作要求 ① ② ③ ④ ⑤ 注意： 色谱柱不能内不能有气泡； 装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶是凝胶装填紧密 3