第3章 第2节 基因工程的基本操作程序(Word教参)-【优化指导】2020-2021学年新教材高中生物选择性必修3 生物技术与工程(人教版)

第2节　基因工程的基本操作程序 课程内容标准 核心素养对接 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测与鉴定等步骤。 1．结合生产实际，举例说出基因工程的基本操作程序。(科学思维) 2．针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。(科学探究) 完整的基因工程流程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 一、基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的筛选与获取 1．目的基因 (1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。 (2)类型：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 2．筛选合适的目的基因 (1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (2)随着测序技术的发展，以及遗传序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 3．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)由来：是聚合酶链式反应的缩写 (2)原理：DNA半保留复制的原理 (3)发明者：穆里斯等人 (4)反应体系： ①一定的缓冲溶液 ②DNA模板 ③分别与两条模板链结合的2种引物 ④4种脱氧核苷酸 ⑤耐高温的DNA聚合酶 ⑥控制温度 (5)过程：每次循环分为变性、复性，延伸三步。 ①变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 ②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。 (6)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n) (7)反应场所及产物检测 上述过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 4．通过构建基因文库获取目的基因。 第二步：基因表达载体的构建 1．基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1．受体细胞为植物细胞 (1)花粉管通道法 将目的基因导入受体细胞有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 (2)农杆菌转化法 ①转化(transformation)是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 ②转化对象：双子叶植物和祼子植物。 ③特点：农杆菌细胞内的Ti质粒上的T－DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。 ④过程： 农杆菌转化法示意图 2．受体细胞为动物细胞 (1)常用方法：显微注射技术。 (2)常用受体细胞：受精卵。 3．受体细胞为原核细胞 (1)用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 (2)受体细胞：使用最广泛的是大肠杆菌。 第四步：目的基因的检测与鉴定 1．分子水平的检测 (1)通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA； (2)从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质。 2．个体生物学水平的鉴定 例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 二、DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 (1)扩增原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 (2)电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率