DNA的琼脂糖凝胶电泳PDF

DNA 的琼脂糖凝胶电泳 实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习 DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方 法以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混 合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的 电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的 影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速 度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子 （cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电 泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5 是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷 酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而 磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大 致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链 DNA 与等长的双链 DNA 的泳 动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但 是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率， 然后进行 DNA 分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知 分子的长度大小。 DNA 分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA 但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出 现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。 含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分