微难点05 6类特殊PCR技术拓展（专项训练）（6角度6重难）（江苏专用）2027年高考生物一轮复习讲练测

微难点05 6类特殊PCR技术拓展（专项训练） 考情速览 深刻剖析真题，探寻命题立意 重难研析 重难知识研析，疑难困惑一网打尽 重难01 反向PCR——测定未知DNA区域 重难02 重叠延伸PCR——获得突变基因、融合基因 重难03 大引物PCR——PCR定点突变技术 重难04 实时荧光定量PCR（qPCR）+反转录PCR（RT-PCR） 重难05 巢式PCR 重难06 不对称PCR 典题精练 揭秘高考动向，零距离练透重难 3年考情精析 特殊PCR（反向PCR、重叠延伸PCR、大引物PCR、qPCR、RT-PCR、巢式PCR、不对称PCR）是江苏高考基因工程板块的高频热点，选择题、非选择题均常涉及，分值占比约6~10分。命题常以PCR流程图、引物设计、循环扩增产物计数、荧光定量曲线为载体，结合定点突变、基因敲除、核酸检测等真实情境，重点考查工程思维、科学推理与实验分析，是区分度较高的模块之一。 3类热考角度 PCR与细胞内DNA复制的比较辨析；PCR过程模型与引物计算（循环轮数、引物数量、产物长度）；PCR在基因工程、疾病检测、物种鉴定、定点突变中的应用；侧重过程推导、定量计算、长句原因解释，区分度高。 5大命题预测 （1）重原理辨析：以反向PCR、重叠延伸PCR、大引物PCR为载体考查引物设计与模板处理逻辑；（2）重定量计算：考查n轮循环后目的片段数、引物消耗数、等长片段数，常与图中引物方向结合；（3）重荧光定量：以qPCR荧光曲线、Ct值为情境，考查起始模板量推断与基因表达相对定量；（4）重RT-PCR应用：结合RNA病毒检测、基因表达分析，考查逆转录与PCR的衔接；（5）重真实情境：结合定点突变改造酶、基因融合、核酸探针制备等科研情境，考查技术应用与方案评价。 3大高效备考策略 （1）抓本质区分：厘清反向PCR（环化+背向引物）、重叠延伸PCR（重叠区搭桥）、大引物PCR（突变引物）在引物方向、模板处理、产物类型上的差异；（2）固化解题模板：针对“循环数—产物数—引物数”建立固定公式，面对图像题先判引物3′端延伸方向再数产物；（3）强化情境迁移：以定点突变、核酸检测、基因表达定量为锚点，训练从流程图和数据曲线中提取关键信息、规范作答长句。 重点1 反向PCR——测定未知DNA区域 1．原理： 反向PCR（inverse PCR）用于扩增已知序列两侧的未知DNA区域。 基本流程为：先用限制酶切割基因组DNA，获得含已知序列及其两侧未知序列的线性片段，再用DNA连接酶将该片段自身环化，最后设计一对方向相反的引物（背向引物），以环化DNA为模板向已知序列的两侧延伸，从而扩增出已知序列两侧的未知区域。 2．关键步骤： ①酶切：选择在已知序列内部无识别位点的限制酶，避免切断已知序列； ②环化：用DNA连接酶将含已知序列的线性片段首尾相连成环； ③反向PCR：设计一对“背向”引物（3′端分别朝向未知区外侧），以环状DNA为模板进行扩增。 【典例】反向PCR是一种用已知DNA序列扩增外侧未知区域的技术，通过环化DNA模板，将引物设计在已知序列内部，PCR扩增，从而研究外侧未知序列，其过程如下图所示。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为5'AACTATGCG…GTAGCCTCT3'。下列说法错误的是（　　） A．切割两侧未知序列的限制酶可以相同也可以不同 B．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 C．两种引物部分序列分别是5'AACTATGCG3'和5'AGAGGCTAC3' D．PCR产物是包含两个完整未知序列和部分已知序列的链状DNA分子 解题通法： 1.见“环化”“背向引物”“扩增未知侧翼序列”→锁定反向PCR：先酶切→再环化→后PCR，模板为环状DNA。 2.判断引物方向：子链只能从引物3′端延伸（5′→3′），反向PCR引物3′端朝向未知区外侧，据此在图中选引物组合。 3.环化前必须用限制酶切开线性DNA（切口在已知区两端外侧），环化后已知区两侧未知区首尾相接。 4.反向PCR的用途：确定T-DNA/转座子插入位点、克隆基因启动子等调控序列、测定未知侧翼序列。 重点2 重叠延伸PCR——获得突变基因、融合基因 1．原理： 重叠延伸PCR（SOE-PCR）通过设计带有互补重叠序列的引物，使两段DNA片段经重叠区互补配对、互为模板延伸而拼接，可实现对基因的定点突变或获得融合基因。 2．定点突变流程： ①设计突变引物：在欲突变位点引入突变碱基，且使引物两端含与相邻片段互补的重叠序列； ②第一轮PCR：分别用两对引物扩增出两个含突变位点及重叠末端的分段（产物a、产物b）； ③第二轮PCR（拼接）：将产物a、b混合变性退火，重叠区互补配对互为模板，延伸拼接成完整含突变基因； ④第三轮PCR（扩增）：用两端外侧引物扩增拼接产物。 3．获得融合基因： 将两个基因的编码序列通过重叠引物连接，使重叠区互补后拼接，从而获得两个基因融合、可表达融合蛋白的融合基因。 【典例】重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB 基因和ST1基因片段，并用重叠延伸PCR 技术构建了LTB -ST1 融合基因（如图）。下列有关叙述正确的是（　　） A．可在同一个反应体系中进行LTB基因和ST1基因的扩增 B．PCR过程中，第2次循环获得目的链L时所用的引物为P1 C．图中的引物P2与引物P3的碱基序列均不能互补配对 D．杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因时需要加入引物P1和P4 解题通法 1.重叠延伸PCR的核心是“重叠区搭桥”：两片段末端设计互补重叠序列，靠互补配对互为模板延伸拼接。 2.定点突变：突变碱基位于引物中间，不能放在3′端末尾（否则延伸可能失败），且需确保引物与模板正常配对。 3.拼接阶段无需额外引物，靠重叠区自发退火延伸；后续大量扩增才需外侧引物。 4.优点：无需限制酶和DNA连接酶，即可精确定点突变或融合基因，且可一次引入多点突变。 重点3 大引物PCR——PCR定点突变技术 1．原理： 大引物PCR是定点突变技术，利用一条含突变碱基、长度较长的“大引物”作引物，经两轮PCR将突变引入全长基因。 2．基本流程： ①设计三条引物：一条突变引物（含突变位点，长度约30~40个核苷酸，中间含突变碱基）、一条上游引物、一条下游引物；②第一轮PCR：用突变引物与一端侧翼引物扩增，得到含突变位点的双链短片段——即“大引物”；③第二轮PCR：以大引物为引物，与另一端侧翼引物一起，以野生型基因为模板延伸，获得含突变的全长基因。 【典例】抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA），可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。下列叙述错误的是（     ） A．要获得改良的目的基因，至少需要经过3轮PCR B．若要实现上述目的，需要将转录模板链的第154位碱基由G替换为T C．过程2的产物包括改良的抗菌肽基因和诱变前的抗菌肽基因 D．通过过程3快速扩增目的基因时应选用引物1和引物2 解题通法 1.大引物PCR共需3条引物（突变引物+上游引物+下游引物），其中第一轮用突变引物与一条侧翼引物，第二轮用大引物与另一条侧翼引物。 2.“大引物”既含突变碱基，又作为第二轮扩增的引物，需与模板互补配对，因此其碱基组成要能特异性结合目标区。 3.突变位点设计在引物中间（距3′端有一定距离），保证引物能正常延伸并引入突变。 4.与重叠延伸PCR的区别：大引物PCR靠“长引物直接引入突变”，重叠延伸PCR靠“两片段重叠区拼接引入突变”。 重点4 实时荧光定量PCR（qPCR）+反转录PCR（RT-PCR） 1．RT-PCR（反转录PCR）： 以RNA为模板，在逆转录酶催化下合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。RT-PCR可检测基因的转录水平（mRNA表达量）、检测RNA病毒、制备目的基因cDNA。反应体系中需同时含逆转录酶和耐高温DNA聚合酶（Taq酶）。 2．qPCR（实时荧光定量PCR）： 在PCR体系中加入荧光染料（如SYBR Green）或荧光探针（如TaqMan探针），实时监测荧光信号强度，依据达到设定荧光阈值所需的循环次数（Ct值）对起始模板量进行定量。Ct值与起始模板量呈反相关：起始模板量越多，Ct值越小。 3．RT-qPCR： 将RT-PCR与qPCR结合，先逆转录得到cDNA，再实时荧光定量，可相对定量某基因的mRNA表达水平，广泛用于基因表达分析、病原体核酸定量检测。 【典例】荧光定量PCR是通过在PCR体系中添加荧光染料来记录PCR产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。CT值表示每个反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。通常情况下将已知浓度的DNA标准样品经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到一系列的CT值，以梯度稀释后的浓度对数值作为横坐标，浓度所对应的CT值为纵坐标绘制曲线，即可得到一个标准曲线，如下图所示，下列叙述错误的是（　　） A．荧光定量PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶 B．荧光定量PCR可以用于检测样品中待测病毒核酸的浓度 C．荧光定量PCR的初始样品浓度越高，CT值越低 D．若标准样品的DNA出现降解，则利用所得的标准曲线分析，待测样品所测CT值偏低 解题通法 1.读“Ct值”→qPCR：Ct值越小，起始模板量越大（注意与常见的“越大越多”相反，是高频陷阱）。 2.读“检测mRNA/基因表达/RNA病毒”→RT-PCR：RNA→cDNA需逆转录酶，再PCR需Taq酶，两步两种酶。 3.TaqMan探针：探针带荧光基团和淬灭基团，Taq酶催化子链延伸到探针处时利用5′→3′外切酶活性水解探针，荧光基团释放发光，每扩增一次产生一个荧光信号，可与模板量正相关。 4.qPCR用于定量DNA（或cDNA）含量，RT-qPCR用于定量基因表达（mRNA水平）；二者均不能直接测蛋白质（翻译）水平。 重点5 巢式PCR 1．原理： 巢式PCR（nested PCR）使用两对引物进行两轮PCR扩增，以提高特异性和灵敏度。第一轮用外引物对扩增出较长片段；第二轮以第一轮产物为模板，用位于第一轮产物内部的内引物对进行二次扩增，获得更短的特异性片段。 2．优点： 两轮特异性扩增可显著减少非特异性产物，提高检测的灵敏度和特异性，适用于微量模板、低拷贝基因、病原体（如病毒核酸）检测、法医痕量样本分析等。 【典例】巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（    ） A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定 C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 解题通法 1.巢式PCR两轮两对引物：外引物对→扩出较长片段；内引物对（位于第一轮产物内部）→二次扩增得到更短特异片段。 2.第二轮模板是第一轮PCR产物（不是原始模板），引物为内引物对。 3.优势：提高特异性（避开非特异性产物）、提高灵敏度（适合微量/低丰度样本）。 4.读图判断：内引物结合位点必然位于外引物扩增片段之内，据此判断引物组合与产物长度。 重点6 不对称PCR 1．原理：不对称PCR是指PCR体系中两种引物浓度不相等（通常其中一条引物与另一条引物比例为50∶1～100∶1），使反应前若干循环进行双链指数扩增，当浓度低的引物消耗殆尽后，浓度高的引物继续进行线性扩增，最终产生大量单链DNA（ssDNA）。 2．应用：单链DNA可作DNA测序模板、制备核酸杂交探针、用于单链构象多态性分析（SSCP）等。 【典例】不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物，数量较少的为限制性引物，数量较多的为非限制性引物。假设体系中模板DNA数量为a，在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，限制性引物耗尽，非限制性引物继续引导合成大量目标DNA单链。下列说法正确的是（    ） A．若B链为所需的DNA探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ B．两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72℃左右 C．如果总共进行25次循环，最终获得的单链探针数为15×210a D．因为双链DNA和单链DNA的长度相同，不能通过电泳方法将其分离 解题通法 1.抓“引物浓度不等”“产生单链DNA”→不对称PCR；普通PCR两引物等量，产物为双链。 2.两轮扩增：前期双链指数扩增→后期低浓度引物耗尽、高浓度引物线性扩增→大量单链。 3.应用场景：制备单链探针、测序模板、SSCP突变分析；而非用于直接克隆双链片段。 4.区分：重叠延伸PCR靠重叠区搭桥，不对称PCR靠引物不等量产单链，两者原理完全不同。 一、单选题 1．常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者不能互补配对 B．环化阶段，可选E．coli DNA连接酶而不能选T4DNA连接酶 C．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 2．如图为利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的原理示意图(图中已标出各链的5′、3′端，引物1～4的结合位置，以及拟突变位点在两条链上的碱基)，下列叙述正确的是（　　） A．PCR3中，链②与链③可在重叠区退火后互为引物、互为模板，延伸得到改造后的目的基因 B．若PCR1中以一个DNA分子为模板循环20次，理论上参与子链合成的引物2为个 C．若要将拟突变位点的A-T碱基对突变为C-G碱基对，则引物2相应位点的碱基为G，引物3相应位点的碱基为C D．若在含原始模板的同一反应体系中同时加入引物1～4，引物1和引物4不会以原始模板直接扩增出未突变的全长片段 3．大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，每一轮PCR包括30次循环，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物。如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变，下列叙述正确的是（    ） A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C．扩增的定点诱变产物通常需具备起始密码、终止密码等结构才能进行转录 D．可在引物的3'端设计两种限制酶识别位点有利于目的基因插入载体 4．实时荧光定量PCR(qPCR)是一种能够实时监测DNA 扩增过程的技术，其原理如图所示。反应体系中加入的荧光探针可与模板DNA的特定序列互补结合，当DNA 聚合酶延伸子链至探针处时，会降解探针使荧光基团与淬灭剂分离，从而产生可检测的荧光信号。下列叙述错误的是（　　） A．qPCR 反应需要使用耐高温的 DNA 聚合酶催化子链合成 B．荧光信号的强度与体系中扩增的 DNA 分子数量呈正相关 C．1个双链DNA 分子经过5轮qPCR 循环，共产生31个荧光分子 D．荧光探针可作为DNA 复制的引物，引导子链的延伸 5．实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述正确的是（　　） A．每个模板DNA分子含有4个游离的磷酸基团 B．在反应过程中，需要ATP为新链的合成提供能量 C．循环次数相同时，荧光值越低，证明感染的病毒越多 D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病毒的概率越大 6．巢式PCR是特殊的PCR技术，使用两对PCR引物扩增完整的DNA片段。具体过程分为两个阶段：第一阶段使用一对引物进行第一次PCR扩增，获得中间产物；第二阶段以中间产物为模板，使用另一对引物进行第二次PCR扩增，具体过程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．巢式PCR技术能降低扩增多个靶位点的可能性 B．第一次PCR扩增DNA分子应选用引物①和引物③ C．巢式PCR扩增的两个阶段应在同一试管中进行 D．PCR扩增DNA分子的过程中，复性阶段的温度最高 7．常用不对称PCR来制备单链DNA分子探针。不对称PCR中使用的一对引物的量不相等，其中少的称为限制性引物，多的称为非限制性引物，开始扩增出的是双链DNA，后来扩增出了单链DNA．图中，a链为所需的DNA分子探针，已知图示DNA有n个，前5次循环的产物为双链DNA，后10次循环的产物是单链DNA，下列有关此过程的说法正确的是（　　） A．引物A是非限制性引物，引物C是限制性引物 B．最初需要添加限制性引物的数量为32n个 C．此过程需要非限制性引物个数为（11×215－1）n D．此过程最终获得所需单链探针个数为10n×25 二、多选题 8.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100。PCR最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是（    ） A．用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列 B．进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量 C．最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致 D．不可通过电泳方法将dsDNA和ssDNA分离 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 微难点05 6类特殊PCR技术拓展（专项训练） 考情速览 深刻剖析真题，探寻命题立意 重难研析 重难知识研析，疑难困惑一网打尽 重难01 反向PCR——测定未知DNA区域 重难02 重叠延伸PCR——获得突变基因、融合基因 重难03 大引物PCR——PCR定点突变技术 重难04 实时荧光定量PCR（qPCR）+反转录PCR（RT-PCR） 重难05 巢式PCR 重难06 不对称PCR 典题精练 揭秘高考动向，零距离练透重难 3年考情精析 特殊PCR（反向PCR、重叠延伸PCR、大引物PCR、qPCR、RT-PCR、巢式PCR、不对称PCR）是江苏高考基因工程板块的高频热点，选择题、非选择题均常涉及，分值占比约6~10分。命题常以PCR流程图、引物设计、循环扩增产物计数、荧光定量曲线为载体，结合定点突变、基因敲除、核酸检测等真实情境，重点考查工程思维、科学推理与实验分析，是区分度较高的模块之一。 3类热考角度 PCR与细胞内DNA复制的比较辨析；PCR过程模型与引物计算（循环轮数、引物数量、产物长度）；PCR在基因工程、疾病检测、物种鉴定、定点突变中的应用；侧重过程推导、定量计算、长句原因解释，区分度高。 5大命题预测 （1）重原理辨析：以反向PCR、重叠延伸PCR、大引物PCR为载体考查引物设计与模板处理逻辑；（2）重定量计算：考查n轮循环后目的片段数、引物消耗数、等长片段数，常与图中引物方向结合；（3）重荧光定量：以qPCR荧光曲线、Ct值为情境，考查起始模板量推断与基因表达相对定量；（4）重RT-PCR应用：结合RNA病毒检测、基因表达分析，考查逆转录与PCR的衔接；（5）重真实情境：结合定点突变改造酶、基因融合、核酸探针制备等科研情境，考查技术应用与方案评价。 3大高效备考策略 （1）抓本质区分：厘清反向PCR（环化+背向引物）、重叠延伸PCR（重叠区搭桥）、大引物PCR（突变引物）在引物方向、模板处理、产物类型上的差异；（2）固化解题模板：针对“循环数—产物数—引物数”建立固定公式，面对图像题先判引物3′端延伸方向再数产物；（3）强化情境迁移：以定点突变、核酸检测、基因表达定量为锚点，训练从流程图和数据曲线中提取关键信息、规范作答长句。 重点1 反向PCR——测定未知DNA区域 1．原理： 反向PCR（inverse PCR）用于扩增已知序列两侧的未知DNA区域。 基本流程为：先用限制酶切割基因组DNA，获得含已知序列及其两侧未知序列的线性片段，再用DNA连接酶将该片段自身环化，最后设计一对方向相反的引物（背向引物），以环化DNA为模板向已知序列的两侧延伸，从而扩增出已知序列两侧的未知区域。 2．关键步骤： ①酶切：选择在已知序列内部无识别位点的限制酶，避免切断已知序列； ②环化：用DNA连接酶将含已知序列的线性片段首尾相连成环； ③反向PCR：设计一对“背向”引物（3′端分别朝向未知区外侧），以环状DNA为模板进行扩增。 【典例】反向PCR是一种用已知DNA序列扩增外侧未知区域的技术，通过环化DNA模板，将引物设计在已知序列内部，PCR扩增，从而研究外侧未知序列，其过程如下图所示。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为5'AACTATGCG…GTAGCCTCT3'。下列说法错误的是（　　） A．切割两侧未知序列的限制酶可以相同也可以不同 B．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 C．两种引物部分序列分别是5'AACTATGCG3'和5'AGAGGCTAC3' D．PCR产物是包含两个完整未知序列和部分已知序列的链状DNA分子 【答案】C 【详解】A、限制酶识别特定的核苷酸序列，只要能在未知序列区域找到合适的酶切位点，两侧可以选择相同限制酶（识别序列相同），也可以选择不同限制酶（各自识别对应位点），A正确； B、从图中可以看到，环化后的DNA分子，引物1和引物4是分别与两条链的互补链结合，方向相反，能实现对未知区域的扩增，B正确； C、第一条引物匹配已知链左端：已知链左端模板碱基5'AACTATGCG3'，引物和模板反向互补，引物序列应该是它的互补链3'TTGATACGC5'，书写规范调转方向为5'CGCATAGTT3'； 已知链：5'GTAGCCTCT3'，两个引物的模板不同，则另一种引物的序列应为5'GTAGCCTCT3'，C错误； D、环状 DNA 做模板做 PCR，线性扩增解开环结构：扩增区间跨过两侧两段未知序列、夹带中间一小段已知序列，最终产物是线性双链 DNA，包含两套完整未知序列 + 部分已知序列，D正确。 解题通法： 1.见“环化”“背向引物”“扩增未知侧翼序列”→锁定反向PCR：先酶切→再环化→后PCR，模板为环状DNA。 2.判断引物方向：子链只能从引物3′端延伸（5′→3′），反向PCR引物3′端朝向未知区外侧，据此在图中选引物组合。 3.环化前必须用限制酶切开线性DNA（切口在已知区两端外侧），环化后已知区两侧未知区首尾相接。 4.反向PCR的用途：确定T-DNA/转座子插入位点、克隆基因启动子等调控序列、测定未知侧翼序列。 重点2 重叠延伸PCR——获得突变基因、融合基因 1．原理： 重叠延伸PCR（SOE-PCR）通过设计带有互补重叠序列的引物，使两段DNA片段经重叠区互补配对、互为模板延伸而拼接，可实现对基因的定点突变或获得融合基因。 2．定点突变流程： ①设计突变引物：在欲突变位点引入突变碱基，且使引物两端含与相邻片段互补的重叠序列； ②第一轮PCR：分别用两对引物扩增出两个含突变位点及重叠末端的分段（产物a、产物b）； ③第二轮PCR（拼接）：将产物a、b混合变性退火，重叠区互补配对互为模板，延伸拼接成完整含突变基因； ④第三轮PCR（扩增）：用两端外侧引物扩增拼接产物。 3．获得融合基因： 将两个基因的编码序列通过重叠引物连接，使重叠区互补后拼接，从而获得两个基因融合、可表达融合蛋白的融合基因。 【典例】重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB 基因和ST1基因片段，并用重叠延伸PCR 技术构建了LTB -ST1 融合基因（如图）。下列有关叙述正确的是（　　） A．可在同一个反应体系中进行LTB基因和ST1基因的扩增 B．PCR过程中，第2次循环获得目的链L时所用的引物为P1 C．图中的引物P2与引物P3的碱基序列均不能互补配对 D．杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因时需要加入引物P1和P4 【答案】B 【详解】A、引物P2和P3存在碱基互补配对，引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行LTB 基因和STI 基因的扩增，A错误； B、DNA子链是从5 '端向3 '端延伸的，为了使杂交链引物P2的碱基末端提供3'端，需要第二次循环，该次循环使用引物P1，B正确； C、LTB基因和ST1基因能融合的关键是引物P2和引物P3部分碱基能互补配对，从而将两个基因融合在一起，C错误； D、杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端，D错误。 故选B。 解题通法 1.重叠延伸PCR的核心是“重叠区搭桥”：两片段末端设计互补重叠序列，靠互补配对互为模板延伸拼接。 2.定点突变：突变碱基位于引物中间，不能放在3′端末尾（否则延伸可能失败），且需确保引物与模板正常配对。 3.拼接阶段无需额外引物，靠重叠区自发退火延伸；后续大量扩增才需外侧引物。 4.优点：无需限制酶和DNA连接酶，即可精确定点突变或融合基因，且可一次引入多点突变。 重点3 大引物PCR——PCR定点突变技术 1．原理： 大引物PCR是定点突变技术，利用一条含突变碱基、长度较长的“大引物”作引物，经两轮PCR将突变引入全长基因。 2．基本流程： ①设计三条引物：一条突变引物（含突变位点，长度约30~40个核苷酸，中间含突变碱基）、一条上游引物、一条下游引物；②第一轮PCR：用突变引物与一端侧翼引物扩增，得到含突变位点的双链短片段——即“大引物”；③第二轮PCR：以大引物为引物，与另一端侧翼引物一起，以野生型基因为模板延伸，获得含突变的全长基因。 【典例】抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA），可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。下列叙述错误的是（     ） A．要获得改良的目的基因，至少需要经过3轮PCR B．若要实现上述目的，需要将转录模板链的第154位碱基由G替换为T C．过程2的产物包括改良的抗菌肽基因和诱变前的抗菌肽基因 D．通过过程3快速扩增目的基因时应选用引物1和引物2 【答案】A 【详解】A、得到产物1需要两轮，第三轮，利用产物1中的大引物扩增得到等长的目的基因，但只有一条链含有突变基因，第四轮以突变的链为模板可得到两条等长的含有突变位点的基因，因此至少需要4轮，A错误； B、脯氨酸密码子CCA变为苏氨酸密码子ACA，即mRNA第154位碱基C变为A，对应转录模板链第154位碱基由G替换为T，B正确； C、过程 2 中，以产物 1（含部分改良序列）作为大引物，以诱变前的抗菌肽基因为模板，则得到的产物包括改良的抗菌肽基因和诱变前的抗菌肽基因，C正确； D、PCR3 的目的是获得大量的产物2，引物应该位于目标DNA的两端，因此，快速扩增时应选用的引物是引物1和引物2，D正确。 解题通法 1.大引物PCR共需3条引物（突变引物+上游引物+下游引物），其中第一轮用突变引物与一条侧翼引物，第二轮用大引物与另一条侧翼引物。 2.“大引物”既含突变碱基，又作为第二轮扩增的引物，需与模板互补配对，因此其碱基组成要能特异性结合目标区。 3.突变位点设计在引物中间（距3′端有一定距离），保证引物能正常延伸并引入突变。 4.与重叠延伸PCR的区别：大引物PCR靠“长引物直接引入突变”，重叠延伸PCR靠“两片段重叠区拼接引入突变”。 重点4 实时荧光定量PCR（qPCR）+反转录PCR（RT-PCR） 1．RT-PCR（反转录PCR）： 以RNA为模板，在逆转录酶催化下合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。RT-PCR可检测基因的转录水平（mRNA表达量）、检测RNA病毒、制备目的基因cDNA。反应体系中需同时含逆转录酶和耐高温DNA聚合酶（Taq酶）。 2．qPCR（实时荧光定量PCR）： 在PCR体系中加入荧光染料（如SYBR Green）或荧光探针（如TaqMan探针），实时监测荧光信号强度，依据达到设定荧光阈值所需的循环次数（Ct值）对起始模板量进行定量。Ct值与起始模板量呈反相关：起始模板量越多，Ct值越小。 3．RT-qPCR： 将RT-PCR与qPCR结合，先逆转录得到cDNA，再实时荧光定量，可相对定量某基因的mRNA表达水平，广泛用于基因表达分析、病原体核酸定量检测。 【典例】荧光定量PCR是通过在PCR体系中添加荧光染料来记录PCR产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。CT值表示每个反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。通常情况下将已知浓度的DNA标准样品经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到一系列的CT值，以梯度稀释后的浓度对数值作为横坐标，浓度所对应的CT值为纵坐标绘制曲线，即可得到一个标准曲线，如下图所示，下列叙述错误的是（　　） A．荧光定量PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶 B．荧光定量PCR可以用于检测样品中待测病毒核酸的浓度 C．荧光定量PCR的初始样品浓度越高，CT值越低 D．若标准样品的DNA出现降解，则利用所得的标准曲线分析，待测样品所测CT值偏低 【答案】D 【详解】A、PCR的过程包括变性、退火和延伸。DNA的双链主要是靠氢键联系在一起，高温时，氢键很容易就被断开了，双链变成了单链，提供了PCR的模板。荧光定量PCR是反复多次进行PCR，所以需要添加耐高温的DNA聚合酶，A正确； B、根据题意和图示可知，荧光定量PCR的CT值与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，循环数越少，CT值越小，B正确； C、根据图中CT值与梯度稀释后的浓度对数值之间的关系可知，如果PCR的初始样品浓度越高，达到设定的荧光阈值时所经历的循环数越少，CT值越低，C正确； D、据图所示，DNA标准样品的浓度越高，达到设定的荧光阈值时所经历的循环数越少，CT值越小，所以，若标准样品的DNA出现降解，DNA浓度下降，则标准曲线值偏高，待测样品所测CT值偏高，D错误。 解题通法 1.读“Ct值”→qPCR：Ct值越小，起始模板量越大（注意与常见的“越大越多”相反，是高频陷阱）。 2.读“检测mRNA/基因表达/RNA病毒”→RT-PCR：RNA→cDNA需逆转录酶，再PCR需Taq酶，两步两种酶。 3.TaqMan探针：探针带荧光基团和淬灭基团，Taq酶催化子链延伸到探针处时利用5′→3′外切酶活性水解探针，荧光基团释放发光，每扩增一次产生一个荧光信号，可与模板量正相关。 4.qPCR用于定量DNA（或cDNA）含量，RT-qPCR用于定量基因表达（mRNA水平）；二者均不能直接测蛋白质（翻译）水平。 重点5 巢式PCR 1．原理： 巢式PCR（nested PCR）使用两对引物进行两轮PCR扩增，以提高特异性和灵敏度。第一轮用外引物对扩增出较长片段；第二轮以第一轮产物为模板，用位于第一轮产物内部的内引物对进行二次扩增，获得更短的特异性片段。 2．优点： 两轮特异性扩增可显著减少非特异性产物，提高检测的灵敏度和特异性，适用于微量模板、低拷贝基因、病原体（如病毒核酸）检测、法医痕量样本分析等。 【典例】巢式PCR是指先后用外内引物扩增目的基因的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（    ） A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定 C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物 【答案】D 【详解】A、两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确； B、第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确； C、由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增出来，C正确； D、如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。 故选D。 解题通法 1.巢式PCR两轮两对引物：外引物对→扩出较长片段；内引物对（位于第一轮产物内部）→二次扩增得到更短特异片段。 2.第二轮模板是第一轮PCR产物（不是原始模板），引物为内引物对。 3.优势：提高特异性（避开非特异性产物）、提高灵敏度（适合微量/低丰度样本）。 4.读图判断：内引物结合位点必然位于外引物扩增片段之内，据此判断引物组合与产物长度。 重点6 不对称PCR 1．原理：不对称PCR是指PCR体系中两种引物浓度不相等（通常其中一条引物与另一条引物比例为50∶1～100∶1），使反应前若干循环进行双链指数扩增，当浓度低的引物消耗殆尽后，浓度高的引物继续进行线性扩增，最终产生大量单链DNA（ssDNA）。 2．应用：单链DNA可作DNA测序模板、制备核酸杂交探针、用于单链构象多态性分析（SSCP）等。 【典例】不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物，数量较少的为限制性引物，数量较多的为非限制性引物。假设体系中模板DNA数量为a，在PCR反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，限制性引物耗尽，非限制性引物继续引导合成大量目标DNA单链。下列说法正确的是（    ） A．若B链为所需的DNA探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ B．两种引物与模板链结合时，需将温度控制在72℃左右 C．如果总共进行25次循环，最终获得的单链探针数为15×210a D．因为双链DNA和单链DNA的长度相同，不能通过电泳方法将其分离 【答案】C 【详解】A、由于DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，引物Ⅱ和Ⅲ不能作为扩增探针序列的引物，据题干信息“数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA 单链”可知，若B链为所需的DNA分子探针，即目标DNA单链，则则非限制性引物应选用引物Ⅰ，A错误； B、两种引物与模板链结合即复性过程，该过程中温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误； C、如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链DNA分子为210×a个，其中有B链为210×a个，以这些链为模板，利用引物又进行了15次循环，每次循环生成的都是A链，不改变B链的数目，即B每次循环开始都是210×a个，15次循环每次生成A也是210×a个，故最终获得的单链探针数共为15×210×a个，C正确； D、单链DNA和双链DNA的分子量不同，电泳可以将其分离，D错误。 故选C。 解题通法 1.抓“引物浓度不等”“产生单链DNA”→不对称PCR；普通PCR两引物等量，产物为双链。 2.两轮扩增：前期双链指数扩增→后期低浓度引物耗尽、高浓度引物线性扩增→大量单链。 3.应用场景：制备单链探针、测序模板、SSCP突变分析；而非用于直接克隆双链片段。 4.区分：重叠延伸PCR靠重叠区搭桥，不对称PCR靠引物不等量产单链，两者原理完全不同。 一、单选题 1．常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者不能互补配对 B．环化阶段，可选E．coli DNA连接酶而不能选T4DNA连接酶 C．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 【答案】C 【详解】A、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，A错误； B、T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B错误； C、在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，C正确； D、PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。 2．如图为利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的原理示意图(图中已标出各链的5′、3′端，引物1～4的结合位置，以及拟突变位点在两条链上的碱基)，下列叙述正确的是（　　） A．PCR3中，链②与链③可在重叠区退火后互为引物、互为模板，延伸得到改造后的目的基因 B．若PCR1中以一个DNA分子为模板循环20次，理论上参与子链合成的引物2为个 C．若要将拟突变位点的A-T碱基对突变为C-G碱基对，则引物2相应位点的碱基为G，引物3相应位点的碱基为C D．若在含原始模板的同一反应体系中同时加入引物1～4，引物1和引物4不会以原始模板直接扩增出未突变的全长片段 【答案】C 【详解】A、链①的3'端和链④的3'端分别带有互补的突变重叠序列，二者在重叠区退火配对后，每条链的3'端都可以作为引物，以对方为模板完成延伸，最终得到引入定点突变的全长目的基因，A错误。 B、1个DNA分子PCR循环n次，理论上总子链数为，对应所有引物的总使用量为；仅引物2的使用量为总引物数的一半，循环20次时引物2的数量应为，B错误。 C、原始拟突变位点的双链为A-T，要突变为C-G，引物2结合在上方5'→3'链（该处引物的碱基与C配对），则引物2相应位点的碱基为G；引物3结合在下方3'→5'链（该处引物的碱基与G配对），则引物3相应位点的碱基为C，C正确。 D、同一体系中加入全部4种引物后，引物1和引物4可以直接结合原始模板的两端，正常扩增出未发生突变的全长原始DNA片段，D错误。 3．大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，每一轮PCR包括30次循环，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物。如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变，下列叙述正确的是（    ） A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C．扩增的定点诱变产物通常需具备起始密码、终止密码等结构才能进行转录 D．可在引物的3'端设计两种限制酶识别位点有利于目的基因插入载体 【答案】A 【详解】A、第一轮PCR中，需要先合成一条链，再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，A正确； B、第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，B错误； C、若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录，C错误； D、在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，因此不能在引物的3'-端添加限制酶识别位点，应在引物的5'-端添加限制酶识别位点，D错误。 故选A。 4．实时荧光定量PCR(qPCR)是一种能够实时监测DNA 扩增过程的技术，其原理如图所示。反应体系中加入的荧光探针可与模板DNA的特定序列互补结合，当DNA 聚合酶延伸子链至探针处时，会降解探针使荧光基团与淬灭剂分离，从而产生可检测的荧光信号。下列叙述错误的是（　　） A．qPCR 反应需要使用耐高温的 DNA 聚合酶催化子链合成 B．荧光信号的强度与体系中扩增的 DNA 分子数量呈正相关 C．1个双链DNA 分子经过5轮qPCR 循环，共产生31个荧光分子 D．荧光探针可作为DNA 复制的引物，引导子链的延伸 【答案】D 【详解】A、qPCR反应过程中需要经历高温变性步骤，因此需要使用耐高温的DNA聚合酶，A正确； B、每合成一个新的DNA分子就会降解一个探针并释放一个荧光分子，因此荧光信号的强度与扩增的DNA分子数量呈正相关，B正确； C、每轮循环DNA数量加倍，经过n轮循环共产生2ⁿ个DNA分子，其中原始模板链不产生荧光，因此荧光分子数为2ⁿ-1，5轮循环产生2⁵-1=31个荧光分子，C正确； D、DNA复制的引物是图中的引物Ⅰ和引物Ⅱ，荧光探针仅用于检测扩增产物，不能作为引物引导子链延伸，D错误。 5．实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述正确的是（　　） A．每个模板DNA分子含有4个游离的磷酸基团 B．在反应过程中，需要ATP为新链的合成提供能量 C．循环次数相同时，荧光值越低，证明感染的病毒越多 D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病毒的概率越大 【答案】D 【详解】A、DNA分子为两条反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，即每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A错误； B、在反应过程中，dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）既是原料又为新链的合成提供能量，无需ATP，B错误； C、由题干可知，Ct值与待测样本中目的基因的个数呈负相关，循环次数相同时，荧光值越低，说明Ct值越高，那么目的基因的个数越少，即证明感染的病毒越少，C错误； D、若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病毒的概率越大，D正确。 6．巢式PCR是特殊的PCR技术，使用两对PCR引物扩增完整的DNA片段。具体过程分为两个阶段：第一阶段使用一对引物进行第一次PCR扩增，获得中间产物；第二阶段以中间产物为模板，使用另一对引物进行第二次PCR扩增，具体过程如图所示。下列相关叙述正确的是（    ） A．巢式PCR技术能降低扩增多个靶位点的可能性 B．第一次PCR扩增DNA分子应选用引物①和引物③ C．巢式PCR扩增的两个阶段应在同一试管中进行 D．PCR扩增DNA分子的过程中，复性阶段的温度最高 【答案】A 【详解】A、巢式PCR使用两对引物进行两轮扩增，其中第二轮扩增的引物是针对第一轮扩增的中间产物设计的，因此具有更高的特异性。这种特异性使得巢式PCR能够更准确地扩增目标DNA片段，降低了扩增多个靶位点的可能性，A正确； B、根据图示和巢式PCR的原理，第一次PCR扩增应该使用引物①和引物④，它们分别与目标DNA片段的两端互补，从而能够扩增出包含整个目标片段的中间产物。引物②和引物③则是用于第二轮扩增的，它们与中间产物的特定序列互补，B错误； C、巢式PCR的两个阶段通常不在同一试管中进行，因为第二阶段需要去除第一阶段的引物和未反应的DNA，以免干扰第二阶段的特异性扩增，C错误； D、PCR扩增DNA分子的过程中，分为变性、复性、延伸三步，变性时温度在90℃以上时，双链DNA解聚为单链； 复性时温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；延伸时当温度上升到72℃左右溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链，D错误。 故选A。 7．常用不对称PCR来制备单链DNA分子探针。不对称PCR中使用的一对引物的量不相等，其中少的称为限制性引物，多的称为非限制性引物，开始扩增出的是双链DNA，后来扩增出了单链DNA．图中，a链为所需的DNA分子探针，已知图示DNA有n个，前5次循环的产物为双链DNA，后10次循环的产物是单链DNA，下列有关此过程的说法正确的是（　　） A．引物A是非限制性引物，引物C是限制性引物 B．最初需要添加限制性引物的数量为32n个 C．此过程需要非限制性引物个数为（11×215－1）n D．此过程最终获得所需单链探针个数为10n×25 【答案】D 【详解】A、观察图可知，要得到a链，需要以b链为模板，以引物C进行延伸，a链为所需单链DNA分子探针，所以扩增a链的引物C应该是非限制性引物（量多的引物），引物A是限制性引物（量少的引物），A 错误； B、前5次循环的产物为双链DNA，DNA进行半保留复制，DNA有n个，5次循环结束后产生n·25个双链DNA分子，但是母链上没有引物，其余合成的子链需要引物，且引物A和引物C数量相等，所以最初需要添加限制性引物A 的数量为(2×n·25-2n)/2=（25-1）n=31n个，B错误； C、前5次循环的产物为双链DNA，DNA进行半保留复制，5次循环结束后产生n·25个双链DNA分子，最初需要添加非限制性引物（引物C）的数量为（25-1）n，后10次循环以前五次循环的DNA产物的b链为模板（前5次扩增后b链共有n·25），所以此过程需要非限制性引物（引物C）个数为n·25·10个，因此此过程需要非限制性引物个数为（25-1）n+n·25·10=（11×25－1）n，C错误； D、后10次循环以前五次循环的DNA产物的b链为模板，所以此过程需要非限制性引物C个数为n·25·10个，获得的所需单链探针个数为10n×25，D正确。 故选D。 二、多选题 8.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100。PCR最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是（    ） A．用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列 B．进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量 C．最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致 D．不可通过电泳方法将dsDNA和ssDNA分离 【答案】CD 【详解】A、PCR时不需要知道扩增基因的全部序列，只需要知道两端的部分序列即可，A正确； B、进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量，以便后期更快得到目标DNA单链，B正确； C、不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误； D、电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离或鉴定。单链DNA和双链DNA的分子量不同，电泳可以将其分离，D错误。 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $