3.2基因工程是一种重组DNA技术课件2026-2027学年高二下学期生物沪科版选择性必修3

基因工程是一种重组DNA技术 （第一课时） 1 2000-2050年全球成年糖尿病患者数量* 情境创设 2 中心法则 复制 转录 DNA RNA 逆转录 复制 蛋白质 翻译 大肠杆菌 复制 转录 DNA RNA 逆转录 复制 蛋白质 核心问题： 基因工程需要哪些工具？ 它们的功能是什么？具有怎样的作用特点或必备条件呢？ 翻译 人胰岛素 人胰岛素的合成 资料1： 1960年代，科学家发现细菌存在某种保护机制，选择性地破坏入侵者的DNA。 参与这类化学反应的酶称为限制性内切核酸酶。 任务一：认识限制性内切核酸酶 1970年，科学家首次发现具有识别序列特异性的限制性内切核酸酶。 1972年，科学家在大肠杆菌中成功分离出这类酶中的其中一种，命名为EcoR I。 中轴线 EcoR I EcoR I识别序列及切割位点 黏性末端 黏性末端 5’ 5’ DNA 5 任务一：认识限制性内切核酸酶 DNA平面结构 请同学们观察EcoR I的作用过程，说一说EcoR I的识别序列是什么？ 5’-GAATTC-3’ 以EcoR I为例，推测限制性内切核酸酶切割的是什么键？ 任务一：认识限制性内切核酸酶 产生的两个黏性末端均为5'-AATT 呈序列互补性且方向相同 5’ 5’ 3’ 3’ 以EcoR I为例，切割后形成的黏性末端有何特点？ DNA平面结构 序列内部鸟嘌呤脱氧核苷酸与腺嘌呤脱氧核苷酸之间的化学键 请同学们观察EcoR I的作用过程，说一说EcoR I的识别序列是什么？ 5’-GAATTC-3’ 以EcoR I为例，推测限制性内切核酸酶切割的是什么键？ 活动1：请完成表格内容，并思考以下问题。 任务一：认识限制性内切核酸酶 （1）黏性末端的方向都是相同的吗？ （2）不同限制性内切核酸酶切割形成的末端一定不同吗?能否拼接呢? （3）不同的限制性内切核酸酶，所识别的序列一定不同吗？请举例说明。 8 活动1：请完成表格内容，并思考以下问题。 任务一：认识限制性内切核酸酶 （1）黏性末端的方向都是相同的吗？ （2）不同限制性内切核酸酶切割形成的末端一定不同吗?能否拼接呢? （3）不同的限制性内切核酸酶，所识别的序列一定不同吗？请举例说明。 9 EcoR I 5' 5' 3' 3' 黏性末端 中轴线 5' 5' 3' 3' Sma I 平末端 ·整理、概述限制性内切核酸酶概念 任务一：认识限制性内切核酸酶 功能 作用特点 作用结果 产生具有黏性末端或平末端的DNA片段 ①每一种限制性内切核酸酶能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间的化学键。 ②大多数限制性内切核酸酶的识别序列长度为4~8个碱基对 在DNA分子内部切割，使其断裂为两个DNA片段 ·获得了足量的人胰岛素基因后，能否直接将其导入大肠杆菌中？ 直接导入 人胰岛素 大肠杆菌 原因分析： 产生 ①大肠杆菌会水解外源DNA分子 ②游离的DNA片段没有RNA聚合酶结合位点，导致无法进行转录 ③游离的DNA片段缺少复制所必需的特定DNA序列 为什么呢？ . . . . . . 任务二：认识载体 ·理论上讲，任何具备在受体细胞中独立复制性能的DNA分子都可以作为基因工程的载体 一个细菌破裂后的拟核DNA和质粒 （电子显微镜照片） 任务二：认识载体 ·理论上讲，任何具备在受体细胞中独立复制性能的DNA分子都可以作为基因工程的载体 活动2：如图展示3种质粒的结构模式图。请各位同学观察，选出最合适的质粒与人胰岛素基因拼接，并说明理由。 质粒1 质粒2 质粒3 √ 标记基因 复制原点 终止子 启动子 DNA复制的起始位点 多个限制性内切核酸识别序列 转录起始位点 便于插入目的基因 转录终止位点 筛选、鉴定受体细胞 质粒结构模式图 任务二：认识载体 一个细菌破裂后的拟核DNA和质粒 （电子显微镜照片） 病毒DNA载体 （模式图） 任务二：认识载体 种类 功能 必备 条件 作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 ①质粒DNA ②病毒DNA ·整理、概述载体概念 ①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 ②具一个或多个限制性内切核酸酶切点，供外源DNA片段 （目的基因）插入其中 ③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择 ④具有启动子、终止子区域，使得目的基因可以表达 任务三：认识DNA连接酶 DNA连接酶作用模式图 DNA连接酶 DNA连接酶 任务三：认识DNA连接酶 DNA连接酶作用模式图 降低温度 任务三：认识DNA连接酶 DNA连接酶的作用是什么? DNA连接酶作用的两个DNA分子需要满足什么条件? DNA连接酶能够连接一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键。 需要具有相同的黏性末端，能碱基互补配对 功能 作用特点 作用结果 任务三：认识DNA连接酶 ·整理、概述DNA连接酶概念 大多数生物的DNA连接酶能封闭双链DNA分子中单链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键） 连接的DNA片段黏性末端呈序列互补性且方向相同 将两个具有相同的黏性末端的DNA分子片段连接为一体 不具有识别序列特异性 任务三：认识DNA连接酶 质粒 √ 活动3：请根据以下信息，利用基因工程三种基本工具，模拟人胰岛素DNA分子重组过程。并把重组DNA分子粘在《学习任务单》相应位置。 限制性内切核酸酶种类 Sma I EcoR I Xho I 识别序列及切割位点 （注：剪刀—限制性内切核酸酶；纸模型—目的基因、载体；透明胶—DNA连接酶） 任务三：认识DNA连接酶 活动3：请根据以下信息，利用基因工程三种基本工具，模拟人胰岛素DNA分子重组过程。并把重组DNA分子粘在《学习任务单》相应位置。 （注：剪刀—限制性内切核酸酶；纸模型—目的基因、载体；透明胶—DNA连接酶） “分子手术刀” 重组DNA技术的基本工具 剪 接 运 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 载体 小 结 “分子缝合针” “分子运输车” Stanley Norman Cohen 1978年，通过重组DNA技术，利用大肠杆菌成功表达出具有生物学活性的人胰岛素 Herbert Wayne Boyer 课外延伸 第二代重组人胰岛素 课后作业 1.请完成本节课作业练习 2.查阅资料，了解基因工程三种工具在其他领域的应用及对社会进步的贡献，制作小报并进行交流。 基因工程是一种重组DNA技术 （第二课时） 27 核心问题： 基因工程的基本操作步骤有哪些？ 每一步涉及的方法和技术有哪些？ 28 任务一：构建基因工程基本步骤 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 任务二：获取目的基因 29 任务二：获取目的基因 目的基因：指人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因 目的基因序列未知，采用大规模筛选的方法获得 目的基因的完整序列已知，采用化学合成法合成 ·国家基因组科学数据中心 ·NCBI数据库网址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ... ... DNA合成仪 30 任务二：获取目的基因 目的基因部分序列已知，采用聚合酶链式反应，又称PCR PCR原理：DNA体外扩增 ··· ··· 体外 复制 31 任务二：获取目的基因 【回顾】DNA体内复制的过程和条件 在DNA复制中的作用 条件 DNA解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷三磷酸 合成DNA子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 DNA复制过程示意图 32 条件 任务二：获取目的基因 活动1-1：请阅读《学习任务单》中的资料，探究PCR的反应条件，并与同伴交流。 高温 DNA母链 4种脱氧核苷三磷酸 耐高温DNA聚合酶 33 任务二：获取目的基因 引物的概念和作用 ·15-30个碱基长度的单链核酸分子 ·一对引物分别与目的基因两条链的3’端序列结合，使DNA聚 合酶催化脱氧核苷三磷酸连接到引物的3’端，进行子链的合成。 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 目的基因解旋后两条母链 子链延伸 子链延伸 34 条件 任务二：获取目的基因 活动1-1：请阅读《学习任务单》中的资料，探究PCR的反应条件，并与同伴交流。 高温 DNA母链 4种脱氧核苷三磷酸 耐高温DNA聚合酶 引物 35 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 引物 待扩增的DNA片段 5’ 5’ 变性 退火 聚合 约95℃，双链DNA解聚，形成单链模板 55℃~68℃，两种引物分别与两条单链DNA模版结合 约75℃，合成新的DNA子链 任务二：获取目的基因 活动1-2：请阅读教材78-79页内容，探究PCR的基本程序，并与同伴交流。 多轮循环 任务二：获取目的基因 活动2：请各位同学借助数字化资源，查询人胰岛素基因编码链序列，尝试设计引物，利用PCR技术扩增目的基因，并思考以下问题。 ①设计引物有什么要求？请说说理由。 ②引物可以重复利用吗？请说说理由。 任务二：获取目的基因 活动2：请各位同学借助数字化资源，查询人胰岛素基因编码链序列，尝试设计引物，利用PCR技术扩增目的基因，并思考以下问题。 5’-AGCCCT…..TTTGTGAACCAA……ACCAGC-3’ 3’-TCGGGA.…AAACACTTGGTT ……TGGTCG-5’ 引物a 引物b 引物c 引物d 3’… TGGTCG-5’ 5’-AGCCCT… 3’ ①设计引物有什么要求？请说说理由。 ②引物可以重复利用吗？请说说理由。 任务二：获取目的基因 活动3：基于PCR原理和过程，说一说如何利用PCR获取目的基因。 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 任务三：构建基因表达载体 目的基因 限制性内切核酸酶 切割位点 标记基因 启动子 限制性内切核酸酶切割位点 终止子 复制原点 限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 ·简述基因表达载体构建的过程 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 任务三：构建基因表达载体 如何选择限制性内切核酸酶? ①不能切割目的基因的结构序列 ②避免切割载体的复制原点、启动子和 终止子等功能区域 目的基因正向接入载体 目的基因自我环化 目的基因反向接入载体 载体“空载” 思考： （1）为什么会出现多种连接方式？ （2）这些连接产物中人胰岛素基因均能表达吗？ （3）人胰岛素基因与载体正向、反向连接，转录出的mRNA是否一致？翻译出的多肽链是否一致？ 目的基因两端、载体两端具有相同的黏性末端；DNA连接酶不具有识别序列特异性 只有与载体相连的人胰岛素基因才可以表达 连接方式 DNA编码链* mRNA链 肽链 正向接入 ...TTTGTG... 反向接入 ..GGTCTT... ...UUUGUG... ...苯丙氨酸-缬氨酸... ...GGUCUU... ...甘氨酸-亮氨酸... 任务三：构建基因表达载体 活动4：请根据补充信息，利用基因工程三种基本工具，再次模拟人胰岛素DNA分子重组过程。并把重组DNA分子粘在《学习任务单》相应位置。 限制性内切核酸酶种类 Sma I EcoR I Xho I 识别序列及切割位点 √ √ （注：剪刀—限制性内切核酸酶；纸模型—目的基因、载体；透明胶—DNA连接酶） 质粒 任务三：构建基因表达载体 活动4：请根据补充信息，利用基因工程三种基本工具，再次模拟人胰岛素DNA分子重组过程。并把重组DNA分子粘在《学习任务单》相应位置。 （注：剪刀—限制性内切核酸酶；纸模型—目的基因、载体；透明胶—DNA连接酶） 任务三：构建基因表达载体 如何选择限制性内切核酸酶? ①不能切割目的基因的结构序列 ②避免切割载体的复制原点、启动子和终止子等功能区域 ③避免切割出两端具有相同黏性末端的目的基因、载体，提高正确连接效率 小 结 结构：目的基因、复制原点、启动子、终止子、标记基因等 限制性内切核酸酶的选择 基因工程的基本步骤： 一、获取目的基因 二、构建表达载体 三、导入受体细胞 四、筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 化学合成法 大规模筛选法 利用PCR获取和扩增 ①原理：DNA体外扩增（DNA半保留复制） ②反应体系： ③基本程序： ·DNA模板（目的基因） ·引物 ·耐高温的DNA聚合酶 ·四种脱氧核苷三磷酸（dNTP） ·缓冲液系统 变性→退火→聚合 课后作业 请完成本节课作业练习 基因工程是一种重组DNA技术 （第三课时） 49 核心问题： 基因工程的基本操作步骤有哪些？ 每一步涉及的方法和技术有哪些？ 50 任务一：导入受体细胞 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 受体细胞类型： 微生物细胞 Ca2+处理法 （化学方法） 转化方法： 转化成功的效率只有10-4~10-2！ 如何知道基因已经导入受体细胞？ 基因导入细胞就能表达吗？ 如何判断基因工程是否成功？ 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 插入DNA片段 导入 Amp r：氨卡青霉素抗性基因 Tet r： 四环素抗性基因 上标“r” :代表抗性 上标“s”：代表敏感 Amp r：氨卡青霉素抗性基因 Tet r： 四环素抗性基因 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 导入情况分析： 未导入外源DNA分子的 大肠杆菌 导入外源DNA分子的 大肠杆菌 导入重组DNA分子的 大肠杆菌 导入空载质粒的 大肠杆菌 占绝大多数 占10-4~10-2 培养基添加Amp 培养基添加 Tet √ × × × √ √ 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 （1、4、6、8、11） 含空载质粒的克隆 含重组质粒的克隆 （2、3、5、7、9、10） 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 活动1：根据材料信息，参考抗药性筛选法的原理和操作过程，阐述显色筛选法的原理和 操作过程，并与同伴交流。 目的基因图示 （两侧具有与质粒同种限制性内切 核酸酶识别序列） lacZ’ 限制性内切核酸酶识别序列 载体 资料1：pUC18质粒上含有lacZ’标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物X-gal水解成蓝色产物。 实验材料：大肠杆菌、pUC18质粒、目的基因、普通平板、青霉素、X-gal、涂布器等。 Amp r：氨卡青霉素抗性基因 lacZ’ 限制性内切核酸酶识别序列 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 分析： lacZ’ 插入DNA片段 目的基因 导入 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 导入情况分析： 未导入外源DNA分子的 大肠杆菌 导入外源DNA分子的 大肠杆菌 导入重组DNA分子的 大肠杆菌 导入空载质粒的 大肠杆菌 占绝大多数 占10-4~10-2 培养基添加Amp、X-gal 菌落呈白色 × 菌落呈蓝色 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 含Amp、X-gal平板 含空载质粒的克隆 含重组质粒的克隆 再经表达产物结构和功能分析等 提纯等步骤 重组人胰岛素产品 任务二：筛选和鉴定含有目的基因的受体细胞 双标记基因筛选法小结 受体细胞导入情况 受体细胞或个体呈现的性状 未导入质粒 无两个标记基因控制的性状 导入空载质粒 同时有两个标记基因控制的性状 导入重组质粒 仅具保留的一个标记基因控制的性状 ·原理： 目的基因插入其中一个标记基因使其灭活，另一标记基因保持完整。 ·结果分析： 受体细胞类型： 动物细胞 微生物细胞 显微注射法、电击法 Ca2+处理法 （化学方法） （物理方法） 转化方法： 任务三：构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 活动2：阅读教材p87-88页相关内容，结合胚胎工程等内容，绘制培育转基因动物流程图。 任务三：构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 转基因动物构建 受体细胞： 导入方法： 受精卵或早期胚胎、动物的生殖细胞、诱导性多能干细胞等 流程图： 转基因小鼠 早期胚胎 雌鼠 （代孕） 胚胎移植 分娩 DNA显微注射 雌鼠 雄鼠 受精卵 卵子 精子 超数排卵 减数分裂 体内受精 取出 重组DNA分子 注入 ①个体大，易操作 ②全能性高，易培养成完整个体 、病毒感染方式 转基因鲑鱼（后排）和正常鲑鱼（前排） 乳汁中含有人生长激素的 转基因山羊 受体细胞类型： 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 农杆菌转化法 （生物方法） 显微注射法、电击法 Ca2+处理法 （化学方法） （物理方法） 转化方法： 任务三：构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 活动3：阅读教材p88页内容和以下资料，结合植物细胞工程内容，设计培育转基因抗虫棉的工程学流程或方案。 资料2：苏云金芽孢杆菌含Bt蛋白，可与鳞翅目昆虫（例如棉铃虫）肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，害虫死亡。人和牲畜的肠道细胞没有Bt蛋白特异性受体。 实验材料：普通棉花植株、Ti质粒、农杆菌、平板、无菌实验室等。 思考： ·基本操作步骤有哪些？ ·每一步涉及的方法和技术有哪些？ 导入棉花 细胞 第三步 第四步 筛选和鉴定含抗虫基因的棉花细胞（或植株） 第一步 获取抗虫基因 第二步 构建表达载体 目的基因：crylAb/Ac基因等 ·查阅文献 ·数字化资源 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ...... 导入棉花 细胞 第三步 第四步 筛选和鉴定含抗虫基因的棉花细胞（或植株） 第一步 获取抗虫基因 第二步 构建表达载体 化学合成法合成抗虫基因 利用PCR获取和扩增抗虫基因 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 构建 导入棉花 细胞 第三步 第四步 筛选和鉴定含抗虫基因的棉花细胞（或植株） 第一步 获取抗虫基因 第二步 构建表达载体 化学合成法合成抗虫基因 利用PCR获取和扩增抗虫基因 双酶切法 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 抗虫棉 构建 转入 导入 插入 表达 农杆菌转化法过程： 导入棉花 细胞 第三步 第四步 筛选和鉴定含抗虫基因的棉花细胞（或植株） 第一步 获取抗虫基因 第二步 构建表达载体 农杆菌转化法 化学合成法合成抗虫基因 利用PCR获取和扩增抗虫基因 双酶切法 mRNA Bt 抗虫蛋白 抗虫棉 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗虫特性以及抗性程度等 检测水平： 分子水平 个体水平 Bt基因 检测内容： 分子水平 分子水平 ··· ··· 逆转录 （一）分子水平的检测 提取 待测DNA PCR 通过琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的基因 提取 待测mRNA PCR 转基因抗虫棉 转基因抗虫棉 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 M：marker 1-阳性质粒 2：原始品系 3-9转Bt品系 ①检测目的基因是否导入、目的基因是否转录 ——通过PCR等技术检测 设计引物 设计引物 （一）分子水平的检测 从棉花中 提取蛋白质 用相应抗体进行 抗原-抗体杂交检测 ②检测目的基因是否翻译 ——通过抗原-抗体杂交检测 检测目的基因是否表现出相应的性状 采摘抗虫棉叶片 接种 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 （二）个体水平的检测 转基因抗虫棉 普通棉花 导入棉花 细胞 第三步 第四步 筛选和鉴定含抗虫基因的棉花细胞（或植株） 第一步 获取抗虫基因 第二步 构建表达载体 农杆菌转化法 化学合成法合成抗虫基因 利用PCR获取和扩增抗虫基因 双酶切法 PCR、琼脂糖凝胶电泳 抗原-抗体杂交检测 基因表达产物结构和 功能分析技术 转基因抗病毒甜椒 转基因抗除草剂玉米田 转基因矮牵牛 导入受体 细胞 筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 获取目的基因 构建表达载体 氯化钙法 农杆菌转化法 DNA显微注射法 病毒感染法 ...... 利用PCR获取和扩增目的基因 化学合成法合成目的基因 大规模筛选法 ...... 双酶切法 ...... 抗药性筛选法 显色筛选法 PCR、琼脂糖凝胶电泳 抗原-抗体杂交检测 ...... 小 结 基因工程基本操作步骤： 采用的方法和技术： 课后作业 请完成本节课作业练习 $