2027届高三生物人教版二轮复习课件增分微专题❷　基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建

增分微专题❷　基因工程中限制酶的选取 与基因表达载体的构建 1 01.真题示例 02.专题强化练44 内容 索引 2 01.真题示例 返回导航 3 例 (2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 返回导航 4 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是____________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。 复制原点 Xba Ⅰ DNA聚合酶 Sma Ⅰ和Spe Ⅰ 550 返回导航 5 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为______(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为____________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 4 环化 测序和序列比对 返回导航 6 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 不能 返回导航 7 解析：(1)DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂基因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHⅠ，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切。 返回导航 8 XbaⅠ酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平(可使重组质粒最小，同时PstⅠ酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3′端延伸子链)。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，转录的方向是从模板链的3′→5′，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550 bp，若反向连接，较短的条带长度近似为200 bp。 返回导航 9 (2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。(3)突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 返回导航 10 [题后拓展] 1．限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶 返回导航 11 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙)。 返回导航 12 (2)根据质粒的特点选择限制酶(如图) 返回导航 13 (3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 返回导航 14 2．基因表达载体的构建过程 返回导航 15 [反馈即练] 1．(2025·黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 返回导航 16 (1)可从_____________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图甲所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用___________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 基因序列数据库 XhoⅠ XbaⅠ DNA连接酶 返回导航 17 (2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图乙。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组____(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是____________________________________________ __________________________________。 外源DNA 1 基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL大小的差值， 约为2.3 kb，对应实验组的电泳条带 返回导航 18 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有__________。 a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ b：5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′ c：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ d：5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′ GCC 返回导航 19 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 香树脂醇 返回导航 20 解析：(1)可从基因序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。由题图可知，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段。(2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质粒pYL大小为7.2 kb，重组质粒大小约9.5 kb，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小为二者的差值，约为2.3 kb(2～2.3 kb)，结合图乙电泳结果可知，实验组1的电泳条带大小约为2 300 bp，说明实验组1的质粒中成功插入了基因N。 返回导航 21 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列，与丙氨酸的密码子序列相同)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物，其配对模板与a的配对模板相同，据此分析，除编码第243位苯丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序列，与丙氨酸的密码子序列相同，其后的编码序列应该与a相同，为TGG/CTG/TTT……，所以该引物是c，其中GCC为第243位诱变序列，故丙氨酸的密码子还可以是GCC。(4)本题旨在通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N并进行改造，提高香树脂醇合酶的催化效率，高效生产香树脂醇，所以检测转基因酵母菌发酵产物香树脂醇的含量并进行比较，可以选出香树脂醇合酶催化效率较高的香树脂醇合酶基因改造方案。 返回导航 22 2．(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： 返回导航 23 (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是______________和________。模板与引物在PCR反应的______阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行 返回导航 24 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图甲所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加________________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成________键。 SmaⅠ和EcoR Ⅰ 磷酸二酯 返回导航 25 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为_________________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量_____，则表明融合蛋 白能结合镉离子。 细胞表面发出黄色荧光 高 返回导航 26 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图乙。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 __________________________________________________________。 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 返回导航 27 240 μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 ___________________________________________________________。 　镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 返回导航 28 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是________和________。(填标号) ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 ③ ① 返回导航 29 解析：(1)在PCR反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。模板与引物在PCR的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，是因为PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行。 返回导航 30 (2)观察图甲，要避免错误连接，GP1两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nhe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GP1连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 返回导航 31 (3)若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的CADR可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 返回导航 32 (4)转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。240 μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 返回导航 33 02.专题强化练44 返回导航 34 1．(2025·山东泰安二模)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。 返回导航 2 4 5 6 3 1 35 下列分析正确的是 (　　) A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ切割已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 答案：D 返回导航 2 4 5 6 3 1 36 解析：转录是从子链(mRNA)5′→3′方向进行的，由题图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误；如果用SphⅠ切割已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，就会破坏LUC基因，B错误；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 返回导航 2 4 5 6 3 1 37 2．(2025·江西九江二模)(不定项)下图甲、乙所示为Ti质粒和含S基因的DNA片段及一些酶切位点，图中所示的限制酶切割位点及其所产生的末端都不相同。 返回导航 2 4 5 6 3 1 38 下列说法正确的是 (　　) A．最好选用XbaⅠ和HindⅢ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒 B．PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的5′端 C．S基因应插入到Ti质粒T-DNA的启动子与终止子之间 D．基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端都不相同 答案：AC 返回导航 2 4 5 6 3 1 39 解析：结合题图可知，最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒，这样可以在目的基因的两端形成不同的黏性末端，同时这两个限制酶在质粒的T-DNA中有这两个限制酶的识别序列各一个，进而可以保证目的基因的正向连接，A正确；PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的3′端，因为引物上子链的延伸方向是5′→3′，且引物和模板链是反向平行的，B错误；S基因应插入到Ti质粒T-DNA的启动子与终止子之间，这样可以保证目的基因的转移和表达，C正确；基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端可能相同，即存在同尾酶，D错误。 返回导航 2 4 5 6 3 1 40 3．(14分)(2025·山东聊城一模)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原(vtg)基因(如图甲所示)的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。 返回导航 2 4 5 6 3 1 41 为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因(无启动子)的载体(如图乙所示)连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图乙中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 返回导航 2 4 5 6 3 1 42 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶______________进行双酶切Luc基因载体，其优点是____________________________________________。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图甲、图乙信息推测引物2包含的碱基序列为5′-______________-3′。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为______。 EcoRⅠ、HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化及目的基因的反向连接 AAGCTTAGAGGC 返回导航 2 4 5 6 3 1 43 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选_________________________________________________________的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加______________进行检测。 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长 雌激素和荧光素 返回导航 2 4 5 6 3 1 44 解析：(1)要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。观察图乙，EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化及目的基因的反向连接。(2)引物2要与vtg基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc基因载体双酶切后相同的黏性末端(HindⅢ的黏性末端)。根据图甲中vtg基因的序列以及图乙中HindⅢ的识别序列，引物2包含的碱基序列为5′-AAGCTTAGAGGC-3′；一个vtg基因经过4轮循环后，共得到24＝16个DNA分子。其中只含有1种引物的DNA分子有2个，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为。 返回导航 2 4 5 6 3 1 45 (3)重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原(vtg)基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素和荧光素进行检测。 返回导航 2 4 5 6 3 1 46 4．(15分)(2025·河北保定一模)由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图甲表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： 返回导航 2 4 5 6 3 1 47 (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P基因时，应选择的引物是_____________。构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为________________。 (2)用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含________的培养基中进行筛选。科研人员进一步用PCR验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图乙所示。其中①为P基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证______________________。 引物2和引物3 EcoRⅠ和SpeⅠ 潮霉素 P基因成功导入了玉米细胞 返回导航 2 4 5 6 3 1 48 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，可用_____________技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有__________________(填植物激素)的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是________________________________________________。 抗原—抗体杂交 生长素、细胞分裂素 玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息 返回导航 2 4 5 6 3 1 49 解析：(1)启动子在基因的左边，b链为P基因转录的模板链，则b链的5′端在右边，3′端在左边；a链的5′端在左边，3′端在右边。引物结合在模板链的3′端，所以选择的引物应该为引物2和引物3。构建基因表达载体时，切割Ti质粒的其中一种限制酶不能选用XbaⅠ，因为XbaⅠ在终止子以外，故限制酶只能在EcoR Ⅰ、SpeⅠ及MunⅠ中选择。MunⅠ在T-DNA的边界序列以外，故应该选择EcoRⅠ和SpeⅠ。(2)潮霉素抗性基因位于T-DNA内，用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含潮霉素的培养基中筛选出含P基因的玉米细胞。经过电泳图谱比较，③待测玉米细胞中有一条条带与①的阳性对照相同，说明P基因成功导入了玉米细胞。 返回导航 2 4 5 6 3 1 50 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有生长素和细胞分裂素等的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息。 返回导航 2 4 5 6 3 1 51 5．(16分)(2025·内蒙古阿拉善盟一模)双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答： 返回导航 2 4 5 6 3 1 52 (1)分析图甲可知，需用______________(填限制酶名称)切割质粒1以获取CUP1基因。 BglⅡ和SalⅠ 返回导航 2 4 5 6 3 1 53 (2)转化后的啤酒酵母应置于含_______________的培养基中进行初步筛选。 (3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的_________为模板，用图示两种引物进行PCR扩增。若扩增产物的大小约为1 300 bp，则说明________________基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 一定浓度的硫酸铜 总DNA CUP1基因和GSH1 返回导航 2 4 5 6 3 1 54 (4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图乙。据图乙分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力________。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显____未转化的受体菌，原因是_______________________________。 增强　 低于 啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏 返回导航 2 4 5 6 3 1 55 解析：(1)观察图甲中质粒1的结构，CUP1基因两端的限制酶切割位点分别为SalⅠ和BglⅡ，所以要用SalⅠ和BglⅡ切割质粒1，才能将CUP1基因完整地从质粒1上切割下来。(2)由题意“CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性”可知，转化后的啤酒酵母应置于含一定浓度的硫酸铜的培养基中进行初步筛选，这样就可以筛选出转化后含有CUP1基因的啤酒酵母，只有成功导入并表达CUP1基因的啤酒酵母才能在含铜离子的培养基中生存。 返回导航 2 4 5 6 3 1 56 (3)进一步鉴定需要检测目的基因是否整合到啤酒酵母的染色体上，所以应以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，因为啤酒酵母的总DNA包含了可能整合进去的CUP1基因等所有遗传物质；由图甲可知，用KpnⅠ和PstⅠ处理重组质粒后导入啤酒酵母的片段含有CUP1基因和GSH1基因。已知CUP1基因大小为1 028 bp，引物1到引物2之间还包含ILV2-左部分片段(270 bp)，1 028＋270＝1 298，约为1 300 bp，因此扩增产物的大小约为1 300 bp则说明CUP1基因导入啤酒酵母的染色体上，也说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 返回导航 2 4 5 6 3 1 57 (4)由题意可知，谷胱甘肽含量越高，抗老化能力越强。从图乙可以看出，工程菌的谷胱甘肽含量高于未转化的受体菌，所以啤酒酵母工程菌抗老化能力增强；由图乙可知，啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显低于未转化的受体菌，由题意可知，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，如果转化的啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏，就不能编码双乙酰合成中的关键酶，从而使工程菌的双乙酰合成量降低。 返回导航 2 4 5 6 3 1 58 6．(16分)(2025·河北石家庄二模)农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将源于施氏假单胞菌YC-YH1的降解酶基因mpd和ophc2插入苦草(一种沉水植物)染色体中，让转基因植物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图甲所示基因mpd和ophc2与引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题： 返回导航 2 4 5 6 3 1 59 (1)现需将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据____________________________设计特异性引物序列，引物的作用是_________________________________________。 (2)据图分析，将基因mpd和ophc2拼接成融合基因，基因mpd的a链的5′端与基因ophc2的________(填“a链”或“b链”)的3′端相连，理由是___________________________________________________________________________。 mpd和ophc2基因两端的核苷酸序列 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 b链 由于融合基因共用启动子和终止子，因此基因mpd和ophc2的转录模板链应在DNA 的一条链上 返回导航 2 4 5 6 3 1 60 (3)利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为：________________，据图乙分析，该过程需要选择限制酶_____________切割融合基因。 基因表达载体的构建 XbaⅠ和HindⅢ 返回导航 2 4 5 6 3 1 61 (4)将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用是______________________________，将筛选出的受体细胞经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药，原因是___________________________________。 筛选得到含重组DNA分子的受体细胞 导入的融合基因不一定能够成功表达 返回导航 2 4 5 6 3 1 62 解析：(1)将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据mpd和ophc2基因两端的核苷酸序列设计特异性引物序列，引物的作用是使Taq DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)由于融合基因共用启动子和终止子，因此基因mpd和ophc2的转录模板链应在DNA的一条链上，因此将基因mpd和ophc2拼接成融合基因时，基因mpd的a链的5′端与基因ophc2的b链的3′端相连。 返回导航 2 4 5 6 3 1 63 (3)利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为基因表达载体的构建，据图乙分析，根据转录方向和融合基因两侧的限制酶识别位点，可知BamHⅠ会破坏融合基因，且使用EcoRⅠ或导致目的基因反向连接，因此该过程需要选择限制酶XbaⅠ和HindⅢ。(4)卡那霉素抗性基因为标记基因，将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用是可筛选得到含重组DNA分子的受体细胞，将筛选出的受体细胞经组织培养获得植株，导入的融合基因不一定能够成功表达，因此成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药。 返回导航 2 4 5 6 3 1 64 65 $