专题11 生物技术工程（期中真题汇编，黑吉辽蒙专用）高三生物上学期

专题11 生物技术工程 8大高频考点 1. 传统发酵技术的应用 2. 微生物的培养与应用 3. 植物细胞工程 4. 动物细胞工程 5. 胚胎工程 6. 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 7. 基因工程综合 8. 基因工程和蛋白质工程的应用 考点1 传统发酵技术的应用 1．（25-26高三上·内蒙古包头·期中）某同学利用红叶李果实制作果醋，下图示意其操作的简易流程。下列叙述错误的是（　　） 果实果汁果酒果醋 A．果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构不同 B．过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率 C．过程②中，需将温度控制在18~30°进行发酵 D．过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气 【答案】D 【解析】A、果酒发酵的菌种是酵母菌，是真核生物，果醋发酵的菌种是醋酸菌，是原核生物，两者的细胞结构不同，A正确； B、过程①为榨汁，果胶酶能分解细胞壁中的果胶，添加适量果胶酶，有利于提高出汁率，B正确； C、过程②为果酒发酵，所需要的菌种为酵母菌，所以需将温度控制在18~30°进行发酵，C正确； D、醋酸菌为好氧微生物，发酵过程中要保证通气，不能盖上盖子，因此不存在拧松瓶盖的操作，D错误。 故选D。 2．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）我国古代酿酒著作《北山酒经》中记载：“凡酿酒。须用黍米为佳，曲用小麦，候熟。下黍米，三投乃成。”下列相关分析错误的是（　　） A．“黍米为佳”是因黍米淀粉含量高，且不含蛋白质等影响酒质的成分 B．“曲用小麦”是因为小麦胚乳富含淀粉酶，可催化原料中的淀粉 C．“候熟”指让酒曲中的微生物充分繁殖，形成酿酒所需的酶系 D．“三投乃成”指的是分三次投料，可避免因渗透压过高抑制酵母菌活性 【答案】A 【解析】参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。在有氧的情况下酵母菌生长繁殖速度快，把糖分解成二氧化碳和水。在无氧的环境中酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。 A、黍米淀粉含量高，是酿酒的良好原料，黍米中不仅含有淀粉，也含有蛋白质，只是蛋白质含量低，A错误； B、“曲用小麦”是因为小麦发芽后胚乳富含淀粉酶，可催化原料中的淀粉分解为葡萄糖，从而为酵母菌发酵提供碳源和能源物质，B正确； C、“候熟”指酒曲的成熟过程，在此期间，酒曲中的微生物充分繁殖并形成酿酒所需的酶系，为后续的酿酒做准备，C正确； D、“三投乃成”指的是分三次投料，这可避免初始糖浓度过高导致的高渗透压环境，防止酵母菌因渗透压过高而大量失水死亡，D正确。 故选A。 考点2 微生物的培养与应用 1．（25-26高三上·黑龙江绥化·期中）多环芳烃PAHs是一种有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的“三致效应”，细菌X可有效分解PAHs。下列说法正确的是（　　） A．可利用以PAHs为唯一碳源的选择培养基筛选出X B．向培养基中添加高浓度氮源可促进X生长，抑制其他微生物生长 C．为获得X的纯培养物，应将分解PAHs的微生物接种于液体培养基中培养 D．对X菌液进行稀释，在平板上进行多次划线以统计X的菌落数 【答案】A 【解析】A、选择培养基通过提供特定条件（如唯一碳源）使目标微生物生长，而抑制其他微生物。PAHs为唯一碳源时，只有能分解PAHs的细菌X可生长，其他微生物因缺乏碳源无法繁殖，A正确； B、向培养基中添加高浓度氮源，并不一定能特异性促进X生长而抑制其他微生物，且题干未提及X对高氮的需求，不同的微生物对氮源的利用存在着差异，这种方法不具有针对性的选择作用，B错误； C、获得纯培养物需用固体培养基进行分离纯化，液体培养基无法形成单菌落，无法纯化微生物，常用于扩大培养，C错误； D、平板划线法不需要稀释菌液，可用于分离纯化菌种，划线区菌落可能重叠，无法准确计数；统计菌落数需用稀释涂布法，D错误。 故选A。 2．（25-26高三上·内蒙古包头·期中）某同学假期预习时，想利用我国人工智能大棋型检索、学习一些生物学问题，下列检索的问题不合理的是（　　） A．蛙的红细胞进行无丝分裂的过程包含几个阶段 B．线粒体内膜上哪些酶参与催化ATP的合成 C．服用哪种抗生素可以有效治疗甲型流感 D．破坏人体内环境酸碱平衡的最低乳酸量是多少 【答案】C 【解析】A、无丝分裂的过程包括细胞核缢缩、细胞质分裂等阶段，虽然阶段较少，但问题本身合理，A错误； B、线粒体内膜上的ATP合成酶参与催化ATP生成，属于有氧呼吸第三阶段的关键酶，问题合理，B错误； C、甲型流感由病毒引起，抗生素仅对细菌有效，无法治疗病毒感染，问题本身存在科学性错误，C正确； D、内环境酸碱平衡由缓冲系统维持，当乳酸量超出缓冲能力时会破坏平衡，问题涉及生理调节机制，问题合理，D错误。 故选C。 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）如图是平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5。下列叙述错误的是（　　） A．划线操作必须在酒精灯火焰旁进行 B．不一定在5区域中才可以得到所需菌落 C．在5次划线的前后都要对接种环灭菌 D．平板划线法可以对微生物分离与计数 【答案】D 【解析】A、为避免杂菌污染，划线操作必须在酒精灯火焰旁进行，因为酒精灯火焰旁为无菌区，A正确； B、由题图可知，5区域是最后一个区域，有可能在5区域获得单一菌落，但其他区域也可能形成所需菌落，B正确； C、在1区域划线前要先灼烧，做到无菌操作，2、3、4、5区域中划线前都要对接种环进行灼烧灭菌，保证每次划线的菌种来自上一区域的末端，即在5次划线的前后都要对接种环灭菌，C正确； D、平板划线法可以对微生物分离，但不能实现计数，D错误。 故选D。 4．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）研究小组从保鲜即食湿面条中分离出6株能引起面条表面液化的致腐菌株A1、A2、A3、A4、A5、A6，对菌株分别进行高温处理和不同酸度处理，分析其生长特性，结果如下表。以下分析正确的是（　　） 菌株编号 100℃加热5min芽孢存活率/% pH 7.22 6.75 5.74 5.19 4.70 4.18 3.63 3.17 2.57 A1 92.71±0.83 + + + + + – – – – A2 91.80±0.64 + + + + + – – – – A3 84.99±3.28 + + + + + – – – – A4 88.09±2.35 + + + + – – – – – A5 0 + + – – – – – – – A6 0 + + + + + + + – – 注：“+”表示有菌体生长，“–”表示未见明显菌体生长 A．推测A1、A5、A6不是同一类致腐菌 B．采用接种环进行接种，可同时实现菌种的分离纯化与活菌计数 C．生产过程中通过蒸煮和巴氏消毒能使致腐菌株彻底失活 D．蒸煮后调整pH为4.50保存，面条表面不会液化腐败 【答案】A 【解析】A、A1芽孢存活率高（1.71%），表明其可能为芽孢杆菌；A5芽孢存活率为0且仅耐中性pH（生长pH下限为6.75），可能为无芽孢的细菌；A6芽孢存活率为0但耐强酸（生长至pH3.63），可能为耐酸的非芽孢菌。三者特性差异显著，不属于同一类致腐菌，A正确； B、接种环用于平板划线法，仅能实现菌种分离纯化，无法进行活菌计数（需用稀释涂布平板法），B错误； C、巴氏消毒为低温消毒（通常60-85℃），无法杀灭芽孢（耐100℃高温）。表中A1-A4芽孢存活率高，故无法彻底失活，C错误； D、pH=4.50时：A1-A4生长下限为pH4.70（A1-A3）或pH4.18（A6），故pH4.50仍可能生长（如A6在pH4.18生长）；A5生长下限pH6.75，虽被抑制，但A6仍可繁殖导致腐败，D错误。 故选A。 5．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨九中·期中）炭疽是一种由炭疽芽孢杆菌引起的人兽共患性传染病，皮肤炭疽病在人类炭疽病中最为常见，这类患者的皮肤渗出物中含有炭疽芽孢杆菌。回答下列有关问题： （1）皮肤炭疽病疑似患者就医时，医生先要取患者的皮肤渗出物稀释后涂布到固体培养基上，经过一段时间的培养获得的平板不可能是______。 A． B． C． D． （2）挑取上述培养基上的菌落进行如图所示实验（注：实验组中的噬菌体能特异性地侵染炭疽芽孢杆菌）。 ①对照组试管中应加入_______，在实验室培养微生物时，需要对所用的培养基和玻璃器皿进行灭菌，可采用的方法分别是_______。 ②实验过程中需将锥形瓶固定在摇床上，在35℃下振荡培养24h，直至液体培养基变浑浊。振荡培养说明炭疽芽孢杆菌的代谢类型是________。液体培养基变浑浊的原因是_______。 ③实验结果为实验组液体培养基的浑浊度比对照组______（填“高”或“低”或“相近”）时，表明该疑似患者被炭疽芽孢杆菌感染。 （3）对炭疽芽孢杆菌进行计数时，选用104、105、106三个稀释倍数的菌液，各取0.2mL涂布，每个稀释度作三次重复，经24h恒温培养后结果如表。 稀释倍数 104 105 106 平板编号 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 菌落数 315 298 302 45 54 51 12 9 11 由表可知，最适合计数的稀释倍数为______，该稀释度下，原菌液中炭疽芽孢杆菌的密度为______个/mL。 【答案】（1）D （2）等量的生理盐水 高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌）和干热灭菌法 异养需氧型 炭疽芽孢杆菌大量繁殖 低 （3）105 2.5×107 【解析】稀释涂布平板法：将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。 （1）A、B、C中的菌落分布较均匀，是通过稀释涂布平板法获得的，而D是通过平板划线法获得的，平板划线法是从上一次划线的末端开始划线，D符合题意，ABC不符合题意。 故选D。 （2）①对照组中加入的液体不应含有噬菌体，因此应加入等量的生理盐水。在进行微生物培养时为防止杂菌的混入，消毒和灭菌工作是关键，主要包括对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌，培养基灭菌采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）法，玻璃器皿采用干热灭菌法。 ②炭疽芽孢杆菌属于细菌，能寄生在人和动物体内，说明它是异养型生物，培养时需要借助摇床振荡培养，说明它是需氧型生物。培养液变浑浊表明菌体数量增多，即炭疽芽孢杆菌大量繁殖。 ③若实验组液体培养基的浑浊度低于对照组，说明实验组中的炭疽芽孢杆菌被噬菌体侵染与破坏，即该疑似患者感染了炭疽芽孢杆菌。 （3）分析表中数据可知，只有稀释度为10-5时菌落数在30~300之间，适合用于计数。该稀释度下，原菌液中炭疽芽孢杆菌的密度为（45+54+51）÷3÷0.2×105=2.5×10⁷个/mL。 考点3 植物细胞工程 1．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）科研人员运用植物体细胞杂交技术实现了抗病毒板蓝根（2n=38）和传统油菜（2n=14）的远缘杂交，成功获得了菘油1号板蓝根青菜。下列分析错误的是（　　） A．高Ca2+-高pH可以促进原生质体融合 B．细胞分裂素和生长素浓度、比例会影响细胞发育方向 C．融合后的原生质体均含有52条染色体 D．与传统油菜相比，菘油1号板蓝根青菜可能具有抗病毒特性 【答案】C 【解析】A、高Ca²⁺-高pH可改变细胞膜流动性，促进原生质体融合，此为化学诱导常用方法，A正确； B、细胞分裂素与生长素的浓度比例调控脱分化和再分化，影响细胞发育方向，B正确； C、原生质体融合包括同种细胞融合（如板蓝根+板蓝根、油菜+油菜）和异种融合（板蓝根+油菜），异源融合染色体数为38+14=52，但同源融合染色体数分别为76或28，并非“均含52条”，C错误； D、体细胞杂交整合双亲遗传物质，抗病毒特性可能由板蓝根基因表达，故菘油1号可能具备抗病毒性，D正确。 故选C。 2．（25-26高三上·黑龙江绥化·期中）（多选）植物组织培养技术可用于作物脱毒，将热处理与茎尖培养两种方法相结合，可大大提高脱毒率。下列说法不正确的是（　　） A．热处理可使所有病毒蛋白发生变性 B．作物脱毒的原理为植物细胞的全能性 C．脱毒苗必需经过病毒检测才可推广种植 D．茎尖分裂旺盛，所取茎尖越大脱毒效果越好 【答案】ABD 【解析】A、不同病毒的蛋白质热变性温度不同，例如热处理（50~70℃）只能使植物病毒的蛋白质变性，无法使所有病毒蛋白质变性，A错误； B、植物组织培养技术培育个体的原理是细胞全能性，作物脱毒是由于茎尖病毒极少，甚至无病毒，而后使用茎尖作为外植体无菌培养后获得的再生植株就有可能不带有病毒，B错误； C、脱毒苗可能存在脱毒不彻底的情况，必需经过病毒检测，确定无病毒后才可推广种植，C正确： D、作物脱毒的原理是利用蛋白质热变性原理以及茎尖或根尖分生区分裂快，病毒少的特点，通过离体培养这些无毒的分生组织，培育出无病毒的植株，茎尖越小，病毒含量越少，脱毒效果越好；茎尖越大，病毒越容易存在，脱毒效果越差，D错误。 故选ABD。 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图，下列叙述正确的是（　　） A．过程①②分别表示再分化和脱分化过程 B．获得辣椒素的两条途径都反映了植物细胞的全能性 C．两条途径分别利用了植物组织培养和植物细胞培养技术 D．脱毒苗的获得利用了芽尖等分生区能抗病毒的特性 【答案】C 【解析】A、植物组织培养中，脱分化是指外植体形成愈伤组织的过程（过程①）；再分化是指愈伤组织形成根、芽等器官的过程（过程②），A错误； B、植物细胞全能性的体现，以 “形成完整植株” 为标志。 上方途径（外植体→脱毒苗→果实）最终形成完整植株，体现了植物细胞的全能性； 下方途径（单细胞→高产细胞系→细胞培养物提取辣椒素）仅培养出细胞系和细胞培养物，未形成完整植株，未体现植物细胞的全能性，B错误； C、上方途径（外植体→愈伤组织→根芽→脱毒苗）利用了植物组织培养技术（基于植物细胞全能性，培养完整植株）； 下方途径（单细胞→高产细胞系→细胞培养物提取辣椒素）利用了植物细胞培养技术（通过细胞增殖生产代谢产物，如辣椒素），C正确； D、脱毒苗的获得，是利用了芽尖等分生区 “几乎不含病毒”的特性（分生区细胞分裂快，病毒来不及侵染），而非 “能抗病毒”，D错误。 故选C。 4．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）野生苔藓的次生代谢产物丰富，利用植物组织培养技术可快速繁殖野生苔藓。下列叙述正确的是（　　） A．植物组织培养技术的原理是细胞膜的流动性 B．苔藓细胞可进行光合作用，培养过程无需添加碳源 C．欲启动细胞分裂，仅需施加适宜浓度的生长素 D．通过诱导愈伤组织可从其中获取所需次生代谢产物 【答案】D 【解析】A、植物组织培养技术的原理是细胞的全能性（已分化的细胞发育成完整个体的潜能），而非细胞膜的流动性（与物质运输、细胞融合有关），A错误； B、苔藓细胞虽含叶绿体，但在离体培养的密闭环境中，光照和CO₂供应有限，仍需添加蔗糖等有机碳源提供能量和碳骨架，B错误； C、启动细胞分裂需细胞分裂素和生长素共同调节，仅生长素可诱导生根但不足以启动分裂，C错误； D、愈伤组织是脱分化的细胞群，次生代谢产物（如生物碱、萜类等）可在愈伤组织阶段合成积累，通过诱导愈伤组织可高效获取目标产物，D正确。 故选D。 考点4 动物细胞工程 1．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，可用于流感疫苗的生产。下列叙述错误的是（    ） A．悬浮培养单克隆细胞可有效避免接触抑制 B．用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清 C．当病毒达到一定数量时会影响细胞的增殖 D．培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量 【答案】D 【解析】培养动物细胞使用合成培养基时需要加入血清等一些天然成分，必须保证环境是无菌、无毒的，培养液还需要定期更换。O2是细胞代谢所必需的，CO2主要作用是维持培养液的pH。细胞贴附在培养瓶的瓶壁上称为细胞贴壁，贴壁细胞在生长增殖时会发生接触抑制的现象。 A、悬浮培养单克隆细胞，可以保证足够的气体交换，通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内，可有效避免接触抑制，A正确； B、由于细胞的生长是比较复杂的过程，血清中含有一些必须的因子，用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清，B正确； C、病毒借助于细胞进行繁殖，利用了活细胞的物质、能量、酶等，当病毒达到一定数量时细胞的生命活动受到影响，会影响细胞的增殖，C正确； D、细胞的正常生命活动需要适宜的pH，培养基pH会影响细胞代谢，进而影响单克隆细胞的病毒产量，D错误。 故选D。 2．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）（多选）柑橘感染橘青霉产生的橘霉素可导致肾功能障碍并存在致癌风险。利用杂交瘤技术制备相应的单克隆抗体，可用来检测橘霉素的残留。下列叙述错误的是（　　） A．免疫小鼠所用的抗原与单克隆抗体所识别的抗原均为橘霉素 B．灭活的病毒因其抗原结构被破坏而失去感染能力，故能用来诱导细胞融合 C．克隆化培养的目的是确保最终获得的细胞群由单一杂交瘤细胞增殖而来 D．该抗体与放射性同位素结合形成抗体—药物偶联物，可定向杀伤癌细胞 【答案】BD 【解析】A、免疫小鼠时需注射橘霉素作为抗原，刺激小鼠产生能产生特异性抗体的B淋巴细胞，最终制备出的单克隆抗体可特异性识别橘霉素抗原，因此免疫小鼠所用的抗原与单克隆抗体所识别的抗原均为橘霉素，A正确； B、灭活的病毒已失去感染活性，但它表面的抗原结构未被破坏，可使不同动物细胞进行融合，B错误； C、克隆化培养的过程可确保每个培养孔中仅有一个杂交瘤细胞，从而获得由单一细胞增殖形成的同源细胞群，C正确； D、该单克隆抗体是针对橘霉素而设计的，用于检测橘霉素的残留而非治疗癌症，不能定向杀伤癌细胞，D错误。 故选BD。 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨师范大学附属中学·期中）北极狼是起源于30万年前的冰河时期幸存者，有着驰骋于极寒雪域的生存能力，野性十足，更是身披“银光战袍”的闪电捕猎者。2022年6月10日，世界首例体细胞克隆北极狼在北京呱呱坠地。克隆北极狼的供体细胞来自哈尔滨极地公园引进的一只野生北极狼的皮肤样本，其培育过程如图所示。回答下列问题： （1）欲获得多个卵母细胞，可对比格犬进行的处理是_________（具体操作）。 （2）选用去核卵母细胞与细胞核融合的原因是_______。野生北极狼皮肤细胞可用于克隆的关键在于_______。 （3）过程②激活重构胚的方法是______（填一种方法）；目的是_______；早期胚胎中，将来发育成胎盘和胎膜的是____________（填图中字母和名称）。 （4）过程③中是否需要对代孕动物使用抗免疫排斥反应的药物，并说明理由____ 【答案】（1）注射一定量的促性腺激素 （2）卵母细胞体积大、营养丰富、更容易激活细胞核的全能性 北极狼皮肤细胞的细胞核中含有该物种一整套遗传信息 （3）电刺激、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂 使其完成细胞分裂和发育进程 a滋养层 （4）不需要，代孕动物对移植入子宫的外来胚胎基本不会发生免疫排斥反应 【解析】通过动物核移植技术得到克隆动物，动物核移植是指将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成为动物个体。 （1）若要获得多个卵母细胞，可对比格犬注射一定量的促性腺激素，以促进其超数排卵来实现。 （2）之所以选用去核卵母细胞与细胞核融合，是由于卵母细胞体积大、营养丰富、更容易激活细胞核的全能性；而之所以选用野生北极狼细胞用于克隆的关键是由于北极狼皮肤细胞的细胞核中含有该物种一整套遗传信息。 （3）过程②表示采用物理或化学方法激活重构胚，其目的是使其完成细胞分裂和发育进程；在早期胚胎中，a滋养层细胞会发育成胎盘和胎膜。 （4）过程③表示胚胎移植，由于代孕动物对移植入子宫的外来胚胎基本不会发生免疫排斥反应，所以在该过程中不需要对代孕动物使用抗免疫排斥反应的药物。 考点5 胚胎工程 1．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）将供核细胞移入去核卵母细胞激活培养，再取重构胚的核移入处理过的受精卵中，可提升克隆猪的胚胎发育能力。下列关于该过程的叙述错误的是（　　） A．初次核移植的受体细胞是去核的MⅡ期卵母细胞 B．重构胚的核移入的受体细胞需显微操作去核 C．克隆猪遗传物质来自供核细胞和卵母细胞的细胞质 D．受体母猪需进行发情处理以提高胚胎着床率 【答案】C 【解析】A、初次核移植需将供核细胞移入去核的MⅡ期卵母细胞，因MⅡ期卵母细胞含丰富营养和促核重编程因子，利于重构胚发育，A正确； B、重构胚的核移入处理过的受精卵时，需显微操作去除受精卵原核，以保证受体细胞为去核状态，B正确； C、通过题干信息可知，克隆猪的核DNA来自供核细胞，细胞质DNA（如线粒体基因）来自受精卵，C错误； D、受体母猪需与供体母猪同期发情处理，以使子宫生理状态与胚胎发育同步，提高胚胎着床率，D正确。 故选C。 2．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）下列关于生物工程技术叙述错误的是（　　） A．动物细胞培养中，两次胰蛋白酶处理的目的依次为：使组织分散成单个细胞、使贴壁生长的细胞脱落下来并分散成单个细胞 B．早期胚胎培养中，不同生长发育阶段的特点为：未分化的桑葚胚细胞具有全能性、已分化的囊胚期细胞不具有全能性 C．农杆菌转化法中，目的基因插入的对象依次为：农杆菌细胞中Ti质粒的T-DNA、植物细胞中染色体的DNA D．单克隆抗体制备中，两次筛选的目的依次为：筛选出杂交瘤细胞、筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞 【答案】B 【解析】纤维素酶或者果胶酶去除植物细胞的细胞壁，用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，将动物组织分散成单个细胞。动物细胞培养的理论基础是细胞增殖。单克隆抗体的制备过程中需两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞群。 A、在培养瓶中进行动物细胞培养时，第一次使用胰蛋白酶的目的是将组织分散成单个细胞，此次的胰蛋白酶也可用胶原蛋白酶代替，由于正常动物细胞具有贴壁生长和接触抑制的特点，故培养到一定阶段需要第二次用胰蛋白酶处理然后分瓶培养，A正确； B、未分化的桑葚胚细胞、已分化的囊胚期细胞（内细胞团）具有全能性，B错误； C、农杆菌转化法中Ti质粒的T-DNA （可转移的DNA）可整合到植物细胞中染色体DNA上，因此目的基因插入的对象依次为：农杆菌细胞中Ti质粒的T-DNA、植物细胞中染色体的DNA，C正确； D、两次筛选的目的不同，先用特定的选择培养基进行第一次筛选，经筛选获得的杂种细胞，还需要进行克隆化培养和抗体检测，最终获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞，D正确。 故选B。 3．（25-26高三上·内蒙古包头·期中）（多选）为保护濒危哺乳动物甲，科研工作者将甲的近亲物种乙（种群数量多）进行了如下图所示的研究，下列叙述正确的是（　　） A．克隆动物的核基因组来源于甲 B．体外受精需用获能的精子与MI期的卵母细胞受精 C．囊胚①的内细胞团可发育为胎盘、个体 D．滋养层可影响内细胞团的发育 【答案】AD 【解析】A、克隆动物的核基因组来源于甲，细胞质中的基因来源于乙，A正确； B、体外受精需用获能的精子与MⅡ期的卵母细胞受精，而不是MI期，B错误； C、囊胚①的内细胞团可发育为个体，滋养层细胞发育为胎膜和胎盘，C错误； D、滋养层可影响内细胞团的发育，如滋养层细胞分泌的某些物质可能会影响内细胞团细胞的分化等，D正确。 故选AD。 考点6 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（25-26高三上·辽宁营口·期中）研究发现，某种土壤杆菌的基因会通过T-DNA进入甜菜细胞，这些基因的表达产物可调控甜菜根部的糖分积累，使其含糖量显著提高。下列相关叙述错误的是（　　） A．土壤杆菌的基因在甜菜细胞中的遗传可遵循孟德尔遗传规律 B．土壤杆菌和甜菜的基因均遵循碱基互补配对原则 C．糖的含量属于甜菜的性状，该性状是甜菜和大肠杆菌基因作用的结果 D．上述现象说明土壤杆菌和甜菜共用一套遗传密码 【答案】C 【解析】A、土壤杆菌的基因通过T-DNA整合到甜菜染色体后，在甜菜有性生殖时可能随染色体分离和自由组合传递，遵循孟德尔遗传规律，A正确； B、所有生物的基因在复制（DNA→DNA）和表达（DNA→RNA→蛋白质）过程中均涉及碱基互补配对，B正确； C、题干中调控糖分积累的基因来自土壤杆菌，而非大肠杆菌，C错误； D、遗传密码具有通用性，所有生物共用同一套密码子，D正确。 故选C。 2．（25-26高三上·辽宁葫芦岛市县协作校·期中）某植物4号染色体上的A基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该种植物会死亡。实验人员通过诱变处理得到了两种A基因的突变体甲（AA21-）和乙（AA25-），A21-和A25-是A基因分别缺失21个和25个碱基对产生的基因。回答下列问题： （1）基因突变除了题目中的碱基缺失，还有碱基的_____两种类型。 （2）为了探究这两个突变基因是否会影响植酸的合成，实验人员将突变体甲和突变体乙分别进行自交。自交后代进行PCR，正向引物分别与A21-和A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0．5kb处，PCR后进行电泳，所得条带类型如表所示。 项目 子代类型1 子代类型2 子代类型3 突变体甲自交 亮条带 暗条带 无条带 突变体乙自交 亮条带 暗条带 注：条带的亮和暗表示扩增产物的多少。 ①突变体甲自交子代类型3的基因型为______，该子代类型经PCR扩增电泳后无条带的原因是______。 ②突变体乙自交子代经PCR扩增电泳后全为有条带，没有无条带类型，分析其原因可能是_____。在突变体乙自交产生的子代中类型2所占的比例为_____。 （3）将突变体甲和突变体乙进行杂交，所得子代按上述（2）中的方法进行PCR扩增电泳，子代中条带类型及比例为______。 【答案】（1）增添、替换 （2）A21-A21- 缺失21个碱基对的A21-基因无法与正向引物配对，从而不能扩增，因此A21-A21-个体无条带 A25-基因不能指导植酸的合成，基因型为A25-A25-的个体无法存活 2/3 （3）亮条带：暗条带：无条带=1：2：1 【解析】1、DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫做基因突变。2、基因自由组合定律实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的， 在减数分裂形成配子的过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 （1） 基因突变的类型包括碱基的替换、增添和缺失，所以除了题目中的碱基缺失，还有碱基的替换、增添两种类型。   （2）突变体甲的基因型为AA21-，植物自交后代的基因型及其比例为AA：AA21-：A21-A21-=1：2：1。当对这些后代进行PCR时，正向引物与A21-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，可推知缺失这21个碱基对的A21-基因无法与正向引物配对，从而不能扩增，因此只含有A21-基因的个体（即A21-A21-）不具有条带。由题意可知，基因型为AA25-的植物自交后代的基因型及其比例为AA：AA25-：A25-A25-=1：2：1。由于该植物的全部后代都具有条带，说明因基因A25-不能指导植酸的合成，基因型为A25-A25-的个体无法存活，所以没有无条带类型，只有基因型为AA和AA25-自的个体能够存活下来，并进行了PCR扩增产生了条带，因此较明亮条带代表的基因型为AA，占比为1/3，暗条带的为AA25-，占比为2/3，故子代中类型2所占的比例为2/3。 （3） 将突变体甲（AA21-）和乙（AA25-）进行杂交，子代基因型及其比例为AA：AA21-：AA25-：A21-A25-=1：1：1：1，基因型为AA的个体为亮条带，基因型为AA21-AA25-的个体为暗条带，基因型为A21-A25-的个体为无条带，子代中亮条带：暗条带：无条带=1：2：1。 考点7 基因工程综合 1．（25-26高三上·辽宁沈阳法库郊联体·期中）番茄是一种双子叶植物，果实中含有的类黄酮是一种具有抗氧化和保健功能的营养物质。科学家利用基因工程技术抑制番茄类黄酮-3＇-羟化酶基因（即F3＇H基因）的表达，获得了类黄酮显著提高的番茄。请回答下列问题： （1）需对F3＇H基因进行PCR扩增，PCR是__________的简称，反应需要在一定的_________中才能进行，在PCR循环之前通常进行_________，以使模板DNA充分解聚为单链。 （2）F3＇H基因及质粒如图1所示，为保证F3＇H基因与质粒能高效连接，应选用图1中的限制酶__________进行切割。 欲将F3＇H基因反向连接到质粒中，以构建反义基因表达载体。F3＇H基因、重组表达载体的部分结构图2所示，a~d表示F3＇H基因的4个位点。将F3＇H基因的__________（填图中的字母）位点连接到重组表达载体模板链启动子端。这样构建的重组表达载体转录产生的mRNA可抑制细胞内F3＇H基因的表达，其原因是重组表达载体中目的基因的转录产物会抑制F3＇H基因的________过程。 （3）将F3＇H基因导入番茄受体细胞可以采用多种方法，图3所示的方式为其中一种。在番茄授粉后的一定时间内，剪去__________，将外源DNA溶液滴加在其切面上，使目的基因借助_________进入胚囊，该方法后续________（填“需要”或“不需要”）用到植物组织培养技术。 【答案】（1）聚合酶链式反应 缓冲液 预变性 （2）XmaⅠ和BglⅡ b 翻译 （3）柱头 花粉管通道 不需要 【解析】基因工程是狭义的遗传工程，基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、重组DNA的形成，重组DNA导入受体细胞也称（宿主）细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。 （1）PCR 是聚合酶链式反应的简称。 PCR 反应需要在一定的缓冲液中才能进行，缓冲液可以为反应提供稳定的 pH 等条件。 在 PCR 循环之前通常进行预变性，通过高温处理，以便模板DNA充分解聚为单链，为后续的引物结合和DNA合成做准备。 （2）为保证 F3′H 基因与质粒能高效连接，需要双酶切目的基因和载体，目的基因两端产生不同的黏性末端，形成防止目的基因反向连接。观察图 1 可知，根据目的基因两端的序列，XmaⅠ和BglⅡ可以满足要求，用这两种限制酶切割能产生的黏性末端，便于连接。 欲将 F3′H 基因反向连接到质粒中，根据转录方向以及碱基互补配对原则，应该将 F3′H 基因的 b位点连接到重组表达载体模板链启动子端。这样构建的重组表达载体转录产生的 mRNA 可与细胞内 F3′H 基因转录产生的 mRNA 互补配对，从而抑制 F3′H 基因的翻译过程，因为 mRNA 互补配对后会影响核糖体与 mRNA 的结合等翻译过程。 （3）在番茄授粉后的一定时间内，剪去柱头，这样可以为外源 DNA 溶液进入胚囊创造通道。使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，这是这种基因导入方法的原理。由于该方法是将目的基因导入到胚囊中的受精卵等细胞，这些细胞可以直接发育成种子等，后续不需要用到植物组织培养技术来将细胞培育成完整植株。 2．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）乳酸菌是一种非致病性微生物，可作为异源蛋白进入动物体内的载体，具有广阔的应用前景。研究人员尝试制备重组乳酸菌作为口服疫苗，为提升免疫效果，研究人员采用重叠延伸PCR技术将GFP基因与高表达启动子P11连接，构建重组质粒（如下图）。已知GFP是来源于水母的绿色荧光蛋白，作为本研究的抗原蛋白，Gm为氯霉素抗性基因。回答下列问题： （1）乳酸菌获取与纯化：获取动物消化道内壁刮取物，加入无菌生理盐水振荡摇匀，采用______法接种于固体培养基上，培养一段时间后挑取单菌落接种于液体培养基中进行______。培养基中加入磷酸氢二钾（K2HPO4）与磷酸二氢钾（KHPO4）的作用是______，为乳酸菌生长繁殖提供有利环境条件。 （2）构建重组乳酸菌： ①获取GFP基因：提取水母的基因组，通过PCR技术扩增GFP基因。PCR之初要进行预变性，以基因组作为模板进行PCR时需要更高的预变性温度和时间，这是为了______。 ②构建P11-GFP串联序列：PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，据图分析原因是______；为保证P11-GFP串联序列能定向接入质粒，由图分析设计引物时需在引物1的5'端加入BglⅡ限制酶的识别序列，在引物4的5'端加入EcoRⅠ限制酶的识别序列。 ③构建重组质粒：利用BglⅡ限制酶、EcoRⅠ限制酶和______酶，将P11-GFP串联序列与质粒载体连接，形成重组质粒。 ④转化乳酸菌：将重组质粒导入经______处理的乳酸菌中，将处理过的乳酸菌涂布在含______的LB琼脂平板中筛选重组乳酸菌。欲测定重组乳酸菌中GFP基因的转录水平，可用______处理样品以避免乳酸菌中GFP基因的干扰，也可通过测定重组乳酸菌的______来评估其GFP基因的表达水平。 （3）检测乳酸菌口服疫苗的免疫效果：给小鼠灌胃重组乳酸菌，可以通过检测小鼠体内______的来评估乳酸菌口服疫苗的免疫效果。 【答案】（1）稀释涂布平板法或平板划线法 扩大培养 维持pH稳定 （2）确保DNA双链之间氢键完全打开，以便引物与模板结合 引物2和引物3存在互补序列 DNA连接酶 Ca2+ 氯霉素 DNA酶 绿色荧光强度/绿色荧光蛋白含量 （3）抗绿色荧光蛋白抗体的含量 【解析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等。将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测有：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）微生物的接种可采用稀释涂布平板法，也可采用平板划线法。接种培养一段时间后挑取单菌落接种于液体培养基中进行扩大培养，增大目的菌的浓度。微生物培养基调节pH值时可以用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，以维持微生物所需的正常酸碱度。 （2）①PCR每次循环都包括变性、复性和延伸过程。PCR过程中需要进行预变性处理，是为了增加模板DNA彻底变性的概率，确保DNA双链之间的氢键完全打开，以保证和引物顺利结合，使PCR过程顺利进行。 ②引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用。 ③构建重组质粒：利用BglⅡ限制酶、EcoRⅠ限制酶切割和DNA连接酶连接，将P11-GFP串联序列与质粒载体连接，形成重组质粒。 ④在将目的基因导入到受体细胞时要使用氯化钙处理受体细胞，使其处于更易吸收重组质粒。因重组质粒上含有Gm（氯霉素抗性基因），因此在进行筛选时应在培养基上添加氯霉素。避免乳酸菌中GFP基因的干扰，可以使用DNA酶将其水解除去。可通过测定重组乳酸菌的绿色荧光强度或绿色荧光蛋白含量来评估其GFP基因的表达水平。 （3）疫苗是抗原，因此进入机体后会引发机体产生抗体，所以抗体的含量可以作为评估效果的指标，其次GFP是来源于水母的绿色荧光蛋白，作为本研究的抗原蛋白，因此也可以测定抗绿色荧光蛋白抗体的含量来评估。 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为氨苄青霉素抗性基因）。回答下列问题： （1）转基因抗冻番茄培育过程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、________、________。 （2）获取鱼的抗冻蛋白基因的PCR技术可以分为_____、复性和延伸三步。 （3）图中对质粒和含鱼的抗冻蛋白基因的DNA进行剪切，选用的限制酶可以是SmaⅠ和_______。构建的基因表达载体包括的基本结构有目的基因、_______、终止子、标记基因和复制原点等。 （4）过程②常利用_____法将目的基因导入受体细胞，构建基因表达载体时需使用的质粒是______。 （5）可通过PCR 等技术检测番茄的染色体DNA上是否插入了鱼的抗冻蛋白基因或检测鱼的抗冻蛋白基因是否_______。 【答案】（1）将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 （2）变性 （3）PstⅠ 启动子 （4）农杆菌转化 Ti质粒 （5）转录出了mRNA 【解析】基因工程的四步包括：获取目的基因、目的基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）转基因抗冻番茄培育过程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 （2）获取鱼的抗冻蛋白基因的PCR技术可以分为变性、复性和延伸三步，其中变性过程中温度最高。 （3）图中对质粒和含鱼的抗冻蛋白基因的DNA进行剪切，选用的限制酶可以是SmaⅠ和PstⅠ，用不同的限制酶切割可获得不同的黏性末端，通过连接酶的作用获得重组质粒。构建的基因表达载体包括的基本结构有目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点等，其中启动子的作用是驱动基因的转录。 （4）过程②常利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，因为农杆菌能侵染植物细胞，并且可以将其中的T-DNA转移到宿主细胞的染色体DNA上，构建基因表达载体时需使用的质粒是Ti质粒，因为其中含有T-DNA。　 （5）可通过PCR 等技术检测番茄的染色体DNA上是否插入了鱼的抗冻蛋白基因或检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA，进而实现分子水平的检测。 4．（25-26高三上·黑龙江大庆实验中学·期中）血栓病是心脑血管疾病中死亡率和严重致残率较高的重大疾病之一。组织纤溶酶原激活剂（t-PA）可选择性高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者可水解血栓中纤维蛋白，使血管畅通，故t-PA能应用于预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病。研究人员获取t-PA基因的cDNA，利用pUC19质粒、pPIC9K质粒构建基因表达载体，过程如图所示，图中①②③④表示过程。回答下列问题∶ 注∶pPIC9K质粒中的AmpR、KanR表示标记基因，Ori表示复制原点，带箭头的序列表示启动子，指示线指示酶切位点。 （1）图示过程中，需要用到DNA连接酶、逆转录酶的过程分别是__________、__________（填图中的数字）。经过程②③获取的目的基因含有山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动子，故构建重组质粒时，宜选用限制酶__________对pPIC9K质粒进行酶切。 （2）挑选未发情的成年母兔肌肉注射促性腺激素，连续注射4天后与公兔配种，第5天后手术取卵，这些步骤的目的是__________。将重组质粒导入受体细胞内，再通过__________技术获得转基因兔。待转基因母兔产仔后收集其乳汁，将乳汁离心获得乳清，采用__________方法检测乳清中是否存在t-PA. （3）用纤维蛋白平板溶圈法测定纯化乳清中t-PA的活性。在含有纤维蛋白（呈乳白色）和纤溶酶原的平板上打出大小相同的孔隙，将t-PA标准品和待测样品加入各孔隙中，在37℃条件下培养至出现透明圈，测定各透明圈的直径，参照标准曲线即可测得t-PA的活性。该检测方法的原理∶若t-PA的活性高，则__________，透明圈直径大。 【答案】（1）②④ ① Sac Ⅰ、SnaB Ⅰ （2）促进雌兔超数排卵，与公兔配种后获得多枚受精卵，作为转基因的受体细胞 胚胎移植 抗原-抗体杂交 （3）t-PA激活纤溶酶原生成的纤溶酶含量高，水解纤维蛋白多 【解析】1、目的基因的获取的方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点等。 1、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 （1）过程②和④中将DNA片段与质粒连接，需要DNA连接酶，过程①利用mRNA获得cDNA，需要逆转录酶。已知经过过程②③获取的目的基因含有山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动子，故构建重组质粒时，不需要保留pPIC9K质粒的启动子，但需要保留复制原点和标记基因等，且最好使用双酶切，故宜选用Sac Ⅰ、SnaB Ⅰ两种限制酶对pPIC9K质粒进行酶切。 （2）挑选未发情的成年母兔肌肉注射促性腺激素，连续注射4天后与公兔配种，第5天后手术取卵，这些步骤的目的是促进雌兔超数排卵，与公兔配种后获得多枚受精卵，作为转基因的受体细胞。将重组质粒导入受体细胞内，再通过早期胚胎培养、胚胎移植技术获得转基因兔。待转基因母兔产仔后收集其乳汁，将乳汁离心获得乳清，采用抗原-抗体杂交方法检测乳清中是否存在t-PA。 （3）已知t-PA可选择性高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者可水解血栓中的纤维蛋白。在含有纤维蛋白（不透明）和纤溶酶原的平板中加入t-PA，若t-PA的活性高，则t-PA激活纤溶酶原生成的纤溶酶含量高，水解纤维蛋白多，透明圈直径大。 5．（25-26高三上·黑龙江绥化·期中）将含纳豆激酶原基因的表达组件Pnis-aprN整合到乳酸菌的基因组上，即可构建出食品级的基因工程菌，过程如图。XhoI、HindⅢ、EcoRI、BamHI、SphI为限制酶，origin表示复制原点，amp为氨苄抗性基因，cm为氯霉素抗性基因。请回答下列问题： （1）图1为载体pFY006的构建过程：首先利用限制酶________获得质粒pFY005上的HisH基因，为保证载体pFY004与HisH基因正确连接，扩增HisH基因时，需在引物的______（填3′或5'）端添加限制酶_____的识别序列。 （2）图2为载体pFY007，研究团队利用限制酶SphI对载体pFY006和pFY007进行同源重组，将纳豆激酶原基因的表达组件Pnis-aprIN整合到载体pFY006上，构建出长度为4791bp的基因表达载体pFY008。为验证重组载体pFY008是否构建成功，需利用限制酶______，通过_________技术检测酶切产物，得到大约________bp的条带，若此条带大小与目的基因Pnis-aprN序列大小相符，则表明构建成功。 （3）当pH值<5.0时，纳豆激酶迅速失活，乳酸菌发酵后培养基pH值往往为3~4，分泌到细胞外的纳豆激酶可能失活。某科研团队欲利用蛋白质工程来解决此问题，应从________出发，设计_____，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的________或合成新的基因，从而获得所需要的纳豆激酶。 【答案】（1）BamH I 5′ Hind Ⅲ和EcoR I （2）Sph I 琼脂糖凝胶电泳 1484 （3）预期的纳豆激酶的功能 预期的纳豆激酶的结构 脱氧核苷酸序列 【解析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取。2、基因表达载体的构建。3、将目的基因导入受体细胞。4、目的基因的检测与鉴定。 （1）要获取质粒 pFY005 上的 His H基因，需用限制酶 BamHI切割； 为保证载体 pFY004 与 His H基因正确连接，需在扩增 His H基因的引物对的 5’端加上限制酶 HindⅢ和 EcoRI的序列。 （2）验证重组载体 pFY008 是否构建成功，可用限制酶 SphI切割;通过琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切产物,基因表达载体 pFY008 长度是 4791bp，pFY006 的长度是 3307bp，两者的差就是目的基因的大小，即4791-3307=1484bp,若得到 1484bp 左右的条带,条带大小与目的基因 Pnis-aprN 基本相符,则表明构建成功。 （3）利用蛋白质工程设计纳豆激酶的活性，需从预期的纳豆激酶功能（让酶在低 pH下仍有活性）出发，设计酶的结构、推测应有的氨基酸序列，再找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（或合成新基因），从而获得所需的纳豆激酶。 6．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨市第三中学校·期中）研究发现，某些植物的种子脱水数十年后复水仍能够恢复活性，原因是细胞中积累了海藻糖。科研人员拟将酵母菌的海藻糖合成酶基因（TPS）转入小麦中，培育具备抗旱特性的小麦。下图标注了载体、TPS基因的酶切位点和预期的基因表达载体的结构，表格列举了限制酶的识别序列。 酶 BamHI SacI HindⅢ XbaI 识别序列 5'-GGATCC-3' 5'-GAGCTC-3' 5'-AAGCTT-3' 5'-TCTAGA-3′ （1）利用PCR技术获取和扩增目的基因时，引物的作用是______。为了特异性地扩增TPS基因，并使其能与图中质粒正确连接，需根据______、______设计两种引物。据图分析，合适的2种引物序列分别是_______（填写选项字母）。 A．5'-GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT-3′ B．5'-GGATCCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3' C．5'-GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3' D．5'-GAGCTCGAATCGAACGATTAGCAACT-3' （2）在基因工程的操作程序中，_______是核心工作，其目的是让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使________。在此项工作中，可利用_______将扩增得到的TPS基因与相应限制酶切割后的质粒拼接起来。 （3）将TPS基因导入小麦细胞常用的方法有_______（答出2点即可）。图中Bar基因是抗除草剂基因，实验中可通过在获得的植株叶片上涂抹_______辅助筛选可能含有TPS基因的植株，在此项工作中，Bar基因作为载体上的_______基因。 （4）筛选得到的TPS转基因小麦植株还需要进行个体生物学水平的鉴定，即将获得的小麦植株种植在______胁迫的环境中并检测小麦的生长情况来确定TPS基因是否赋予了小麦相应的特性及抗性的程度。 【答案】（1）使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核糖核苷酸 TPS基因两端的核苷酸序列 BamH I和Sac I识别核苷酸序列 AC （2）构建基因表达载体 使TPS基因能够表达和发挥作用 DNA连接酶 （3）花粉管通道法、农杆菌转化法 除草剂 标记 （4）干旱 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 （1）进行PCR扩增时引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核糖核苷酸。引物需要与模板的3'端碱基互补配对，使子链沿着5'→3'的方向进行，据图分析，Hind Ⅲ存在于标记基因上，Xba I存在于TPS基因上，若引入会破坏标记基因和目的基因，故不能选择，所以TPS基因两侧引入的是BamH I、Sac I限制酶的酶切位点，综上所述，为了扩增TPS基因，并使其能与图中质粒正确连接，需根据TPS基因两端的核苷酸序列、BamH I和Sac I识别核苷酸序列设计两种引物。根据限制酶的识别序列和TPS基因两侧碱基序列可知，以BamH I为限制酶，设计的引物位于基因上游，序列为5′-GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT-3′，以Sac I为限制酶，设计的引物序位于基因下游，列是5′-GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3′，AC正确，BD错误。 故选AC。 （2）在基因工程操作程序里，构建基因表达载体是核心工作，其目的一是让基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代，二是使使TPS基因能够表达和发挥作用。在构建基因表达载体时，可利用DNA连接酶将扩增得到的TPS基因与经相应限制酶切割后的质粒拼接起来。 （3）将目的基因导入小麦细胞（植物细胞）的常用方法是花粉管通道法、农杆菌转化法。图中Bar基因是抗除草剂基因，实验中可通过在获得的植株叶片上涂抹除草剂来辅助筛选可能含有TPS基因的植株，因为含有TPS基因的植株可能因Bar基因表达而具有抗除草剂特性，在此过程中，Bar基因作为载体上的标记基因，用于筛选含有重组载体的细胞。 （4）筛选得到的TPS转基因小麦植株进行个体生物学水平鉴定时，需将其种植在干旱胁迫的环境中，通过检测小麦生长情况确定TPS基因是否赋予小麦相应特性及抗性程度。 考点8 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）细胞分裂素在马铃薯抵御外界胁迫方面发挥重要作用，研究人员推测细胞分裂素合成关键酶（IPT，编码基因为）通过与其他蛋白相互作用来实现其功能。利用酵母双杂交系统寻找IPT的互作蛋白，其原理是AD蛋白与BD蛋白互相接近时，能够与酵母细胞中基因启动子上游激活序列结合，启动基因表达，基因表达产物能催化培养基中X-gal形成蓝色物质。回答下列问题。 （1）利用马铃薯进行组织培养时应选择______作为外植体获得脱毒苗，原因是______。 （2）研究人员可利用DNA不溶于______的特性析出DNA；也可提取分离马铃薯植株和块茎的总RNA，纯化得到mRNA后进行逆转录获得互作蛋白基因，纯化mRNA的目的是______。 （3）下图是寻找IPT的互作蛋白的核心过程： ①饵蛋白载体中与增殖相关的元件是______。将饵蛋白载体和靶蛋白载体共同导入色氨酸-亮 氨酸营养缺陷型酵母菌中，通过观察菌落特征确定蛋白质是否互作，为达成实验目的，所用培养基在组成成分上的特点是______。 ②为使实验更加严谨，还应设计3组对照组，对照组1的饵蛋白载体和靶蛋白载体上分别携带基因和基因，对照组2饵蛋白载体和靶蛋白载体分别携带______基因，对照组3的饵蛋白载体和靶蛋白载体分别携带______基因。 ③若在培养基上观察到______，表明IPT蛋白能够与VOZ1蛋白发生相互作用。 （4）科研人员想优化IPT蛋白的功能，使其更易与抗逆相关的互作蛋白结合，需先明确IPT蛋白的______，再根据该信息设计改造方案，最终通过基因合成获得改造后的基因。 【答案】（1）茎尖组织（分生区） 分生区附近病毒极少，甚至无病毒 （2）酒精 去除总RNA中的rRNA、tRNA等杂质，保证逆转录获得的DNA均为编码蛋白质的基因 （3）复制原点 该培养基含有X-gal、不含色氨酸和亮 氨酸 StIPT-BD融合基因和AD基因 BD基因和StVOZ1-AD融合基因 蓝色菌落 （4）空间结构 【解析】基因工程（重组DNA技术）的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 （1）植物组织培养时应选择茎尖组织（分生组织）作为外植体获得脱毒苗，原因是分生区附近病毒极少，甚至无病毒。 （2）利用DNA不溶于酒精的特性可析出DNA，也可提取分离马铃薯植株和块茎的总RNA，为去除总RNA中的rRNA、tRNA等杂质，保证逆转录获得的DNA均为编码蛋白质的基因，需进一步纯化得到mRNA后再进行逆转录获得互作蛋白基因。 （3）载体中与增殖相关的元件是复制原点。 将饵蛋白载体和靶蛋白载体共同导入色氨酸-亮 氨酸营养缺陷型酵母菌中，在固体培养基表面培养形成菌落，为了利用酵母双杂交技术寻找IPT的互作蛋白，根据酵母双杂交的原理可知，培养基的成分特点应为含有X-gal、不含有色氨酸和亮氨酸。 对照组1的饵蛋白载体和靶蛋白载体上携带的目的基因分别是BD基因和AD基因，对照组2饵蛋白载体和靶蛋白载体携带的目的基因分别是StIPT-BD整合基因和AD基因，对照组3的饵蛋白载体和靶蛋白载体分别携带BD基因和StVOZ1-AD融合基因；若在培养基上观察到实验组的菌落为蓝色（对照组的菌落为白色），则表明IPT蛋白能够与VOZ1蛋白发生相互作用。 （4）科研人员想优化IPT蛋白的功能，使其更易与抗逆相关的互作蛋白结合，需先明确IPT蛋白的空间结构，再根据该信息设计改造方案，最终通过基因合成获得改造后的基因。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题11 生物技术工程 8大高频考点 1. 传统发酵技术的应用 2. 微生物的培养与应用 3. 植物细胞工程 4. 动物细胞工程 5. 胚胎工程 6. 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 7. 基因工程综合 8. 基因工程和蛋白质工程的应用 考点1 传统发酵技术的应用 1．（25-26高三上·内蒙古包头·期中）某同学利用红叶李果实制作果醋，下图示意其操作的简易流程。下列叙述错误的是（　　） 果实果汁果酒果醋 A．果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构不同 B．过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率 C．过程②中，需将温度控制在18~30°进行发酵 D．过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气 2．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）我国古代酿酒著作《北山酒经》中记载：“凡酿酒。须用黍米为佳，曲用小麦，候熟。下黍米，三投乃成。”下列相关分析错误的是（　　） A．“黍米为佳”是因黍米淀粉含量高，且不含蛋白质等影响酒质的成分 B．“曲用小麦”是因为小麦胚乳富含淀粉酶，可催化原料中的淀粉 C．“候熟”指让酒曲中的微生物充分繁殖，形成酿酒所需的酶系 D．“三投乃成”指的是分三次投料，可避免因渗透压过高抑制酵母菌活性 考点2 微生物的培养与应用 1．（25-26高三上·黑龙江绥化·期中）多环芳烃PAHs是一种有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的“三致效应”，细菌X可有效分解PAHs。下列说法正确的是（　　） A．可利用以PAHs为唯一碳源的选择培养基筛选出X B．向培养基中添加高浓度氮源可促进X生长，抑制其他微生物生长 C．为获得X的纯培养物，应将分解PAHs的微生物接种于液体培养基中培养 D．对X菌液进行稀释，在平板上进行多次划线以统计X的菌落数 2．（25-26高三上·内蒙古包头·期中）某同学假期预习时，想利用我国人工智能大棋型检索、学习一些生物学问题，下列检索的问题不合理的是（　　） A．蛙的红细胞进行无丝分裂的过程包含几个阶段 B．线粒体内膜上哪些酶参与催化ATP的合成 C．服用哪种抗生素可以有效治疗甲型流感 D．破坏人体内环境酸碱平衡的最低乳酸量是多少 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）如图是平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5。下列叙述错误的是（　　） A．划线操作必须在酒精灯火焰旁进行 B．不一定在5区域中才可以得到所需菌落 C．在5次划线的前后都要对接种环灭菌 D．平板划线法可以对微生物分离与计数 4．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）研究小组从保鲜即食湿面条中分离出6株能引起面条表面液化的致腐菌株A1、A2、A3、A4、A5、A6，对菌株分别进行高温处理和不同酸度处理，分析其生长特性，结果如下表。以下分析正确的是（　　） 菌株编号 100℃加热5min芽孢存活率/% pH 7.22 6.75 5.74 5.19 4.70 4.18 3.63 3.17 2.57 A1 92.71±0.83 + + + + + – – – – A2 91.80±0.64 + + + + + – – – – A3 84.99±3.28 + + + + + – – – – A4 88.09±2.35 + + + + – – – – – A5 0 + + – – – – – – – A6 0 + + + + + + + – – 注：“+”表示有菌体生长，“–”表示未见明显菌体生长 A．推测A1、A5、A6不是同一类致腐菌 B．采用接种环进行接种，可同时实现菌种的分离纯化与活菌计数 C．生产过程中通过蒸煮和巴氏消毒能使致腐菌株彻底失活 D．蒸煮后调整pH为4.50保存，面条表面不会液化腐败 5．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨九中·期中）炭疽是一种由炭疽芽孢杆菌引起的人兽共患性传染病，皮肤炭疽病在人类炭疽病中最为常见，这类患者的皮肤渗出物中含有炭疽芽孢杆菌。回答下列有关问题： （1）皮肤炭疽病疑似患者就医时，医生先要取患者的皮肤渗出物稀释后涂布到固体培养基上，经过一段时间的培养获得的平板不可能是______。 A． B． C． D． （2）挑取上述培养基上的菌落进行如图所示实验（注：实验组中的噬菌体能特异性地侵染炭疽芽孢杆菌）。 ①对照组试管中应加入_______，在实验室培养微生物时，需要对所用的培养基和玻璃器皿进行灭菌，可采用的方法分别是_______。 ②实验过程中需将锥形瓶固定在摇床上，在35℃下振荡培养24h，直至液体培养基变浑浊。振荡培养说明炭疽芽孢杆菌的代谢类型是________。液体培养基变浑浊的原因是_______。 ③实验结果为实验组液体培养基的浑浊度比对照组______（填“高”或“低”或“相近”）时，表明该疑似患者被炭疽芽孢杆菌感染。 （3）对炭疽芽孢杆菌进行计数时，选用104、105、106三个稀释倍数的菌液，各取0.2mL涂布，每个稀释度作三次重复，经24h恒温培养后结果如表。 稀释倍数 104 105 106 平板编号 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 菌落数 315 298 302 45 54 51 12 9 11 由表可知，最适合计数的稀释倍数为______，该稀释度下，原菌液中炭疽芽孢杆菌的密度为______个/mL。 考点3 植物细胞工程 1．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）科研人员运用植物体细胞杂交技术实现了抗病毒板蓝根（2n=38）和传统油菜（2n=14）的远缘杂交，成功获得了菘油1号板蓝根青菜。下列分析错误的是（　　） A．高Ca2+-高pH可以促进原生质体融合 B．细胞分裂素和生长素浓度、比例会影响细胞发育方向 C．融合后的原生质体均含有52条染色体 D．与传统油菜相比，菘油1号板蓝根青菜可能具有抗病毒特性 2．（25-26高三上·黑龙江绥化·期中）（多选）植物组织培养技术可用于作物脱毒，将热处理与茎尖培养两种方法相结合，可大大提高脱毒率。下列说法不正确的是（　　） A．热处理可使所有病毒蛋白发生变性 B．作物脱毒的原理为植物细胞的全能性 C．脱毒苗必需经过病毒检测才可推广种植 D．茎尖分裂旺盛，所取茎尖越大脱毒效果越好 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图，下列叙述正确的是（　　） A．过程①②分别表示再分化和脱分化过程 B．获得辣椒素的两条途径都反映了植物细胞的全能性 C．两条途径分别利用了植物组织培养和植物细胞培养技术 D．脱毒苗的获得利用了芽尖等分生区能抗病毒的特性 4．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）野生苔藓的次生代谢产物丰富，利用植物组织培养技术可快速繁殖野生苔藓。下列叙述正确的是（　　） A．植物组织培养技术的原理是细胞膜的流动性 B．苔藓细胞可进行光合作用，培养过程无需添加碳源 C．欲启动细胞分裂，仅需施加适宜浓度的生长素 D．通过诱导愈伤组织可从其中获取所需次生代谢产物 考点4 动物细胞工程 1．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，可用于流感疫苗的生产。下列叙述错误的是（    ） A．悬浮培养单克隆细胞可有效避免接触抑制 B．用于培养单克隆细胞的培养基通常需加血清 C．当病毒达到一定数量时会影响细胞的增殖 D．培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量 2．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）（多选）柑橘感染橘青霉产生的橘霉素可导致肾功能障碍并存在致癌风险。利用杂交瘤技术制备相应的单克隆抗体，可用来检测橘霉素的残留。下列叙述错误的是（　　） A．免疫小鼠所用的抗原与单克隆抗体所识别的抗原均为橘霉素 B．灭活的病毒因其抗原结构被破坏而失去感染能力，故能用来诱导细胞融合 C．克隆化培养的目的是确保最终获得的细胞群由单一杂交瘤细胞增殖而来 D．该抗体与放射性同位素结合形成抗体—药物偶联物，可定向杀伤癌细胞 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨师范大学附属中学·期中）北极狼是起源于30万年前的冰河时期幸存者，有着驰骋于极寒雪域的生存能力，野性十足，更是身披“银光战袍”的闪电捕猎者。2022年6月10日，世界首例体细胞克隆北极狼在北京呱呱坠地。克隆北极狼的供体细胞来自哈尔滨极地公园引进的一只野生北极狼的皮肤样本，其培育过程如图所示。回答下列问题： （1）欲获得多个卵母细胞，可对比格犬进行的处理是_________（具体操作）。 （2）选用去核卵母细胞与细胞核融合的原因是_______。野生北极狼皮肤细胞可用于克隆的关键在于_______。 （3）过程②激活重构胚的方法是______（填一种方法）；目的是_______；早期胚胎中，将来发育成胎盘和胎膜的是____________（填图中字母和名称）。 （4）过程③中是否需要对代孕动物使用抗免疫排斥反应的药物，并说明理由____ 考点5 胚胎工程 1．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）将供核细胞移入去核卵母细胞激活培养，再取重构胚的核移入处理过的受精卵中，可提升克隆猪的胚胎发育能力。下列关于该过程的叙述错误的是（　　） A．初次核移植的受体细胞是去核的MⅡ期卵母细胞 B．重构胚的核移入的受体细胞需显微操作去核 C．克隆猪遗传物质来自供核细胞和卵母细胞的细胞质 D．受体母猪需进行发情处理以提高胚胎着床率 2．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）下列关于生物工程技术叙述错误的是（　　） A．动物细胞培养中，两次胰蛋白酶处理的目的依次为：使组织分散成单个细胞、使贴壁生长的细胞脱落下来并分散成单个细胞 B．早期胚胎培养中，不同生长发育阶段的特点为：未分化的桑葚胚细胞具有全能性、已分化的囊胚期细胞不具有全能性 C．农杆菌转化法中，目的基因插入的对象依次为：农杆菌细胞中Ti质粒的T-DNA、植物细胞中染色体的DNA D．单克隆抗体制备中，两次筛选的目的依次为：筛选出杂交瘤细胞、筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞 3．（25-26高三上·内蒙古包头·期中）（多选）为保护濒危哺乳动物甲，科研工作者将甲的近亲物种乙（种群数量多）进行了如下图所示的研究，下列叙述正确的是（　　） A．克隆动物的核基因组来源于甲 B．体外受精需用获能的精子与MI期的卵母细胞受精 C．囊胚①的内细胞团可发育为胎盘、个体 D．滋养层可影响内细胞团的发育 考点6 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（25-26高三上·辽宁营口·期中）研究发现，某种土壤杆菌的基因会通过T-DNA进入甜菜细胞，这些基因的表达产物可调控甜菜根部的糖分积累，使其含糖量显著提高。下列相关叙述错误的是（　　） A．土壤杆菌的基因在甜菜细胞中的遗传可遵循孟德尔遗传规律 B．土壤杆菌和甜菜的基因均遵循碱基互补配对原则 C．糖的含量属于甜菜的性状，该性状是甜菜和大肠杆菌基因作用的结果 D．上述现象说明土壤杆菌和甜菜共用一套遗传密码 2．（25-26高三上·辽宁葫芦岛市县协作校·期中）某植物4号染色体上的A基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该种植物会死亡。实验人员通过诱变处理得到了两种A基因的突变体甲（AA21-）和乙（AA25-），A21-和A25-是A基因分别缺失21个和25个碱基对产生的基因。回答下列问题： （1）基因突变除了题目中的碱基缺失，还有碱基的_____两种类型。 （2）为了探究这两个突变基因是否会影响植酸的合成，实验人员将突变体甲和突变体乙分别进行自交。自交后代进行PCR，正向引物分别与A21-和A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0．5kb处，PCR后进行电泳，所得条带类型如表所示。 项目 子代类型1 子代类型2 子代类型3 突变体甲自交 亮条带 暗条带 无条带 突变体乙自交 亮条带 暗条带 注：条带的亮和暗表示扩增产物的多少。 ①突变体甲自交子代类型3的基因型为______，该子代类型经PCR扩增电泳后无条带的原因是______。 ②突变体乙自交子代经PCR扩增电泳后全为有条带，没有无条带类型，分析其原因可能是_____。在突变体乙自交产生的子代中类型2所占的比例为_____。 （3）将突变体甲和突变体乙进行杂交，所得子代按上述（2）中的方法进行PCR扩增电泳，子代中条带类型及比例为______。 考点7 基因工程综合 1．（25-26高三上·辽宁沈阳法库郊联体·期中）番茄是一种双子叶植物，果实中含有的类黄酮是一种具有抗氧化和保健功能的营养物质。科学家利用基因工程技术抑制番茄类黄酮-3＇-羟化酶基因（即F3＇H基因）的表达，获得了类黄酮显著提高的番茄。请回答下列问题： （1）需对F3＇H基因进行PCR扩增，PCR是__________的简称，反应需要在一定的_________中才能进行，在PCR循环之前通常进行_________，以使模板DNA充分解聚为单链。 （2）F3＇H基因及质粒如图1所示，为保证F3＇H基因与质粒能高效连接，应选用图1中的限制酶__________进行切割。 欲将F3＇H基因反向连接到质粒中，以构建反义基因表达载体。F3＇H基因、重组表达载体的部分结构图2所示，a~d表示F3＇H基因的4个位点。将F3＇H基因的__________（填图中的字母）位点连接到重组表达载体模板链启动子端。这样构建的重组表达载体转录产生的mRNA可抑制细胞内F3＇H基因的表达，其原因是重组表达载体中目的基因的转录产物会抑制F3＇H基因的________过程。 （3）将F3＇H基因导入番茄受体细胞可以采用多种方法，图3所示的方式为其中一种。在番茄授粉后的一定时间内，剪去__________，将外源DNA溶液滴加在其切面上，使目的基因借助_________进入胚囊，该方法后续________（填“需要”或“不需要”）用到植物组织培养技术。 2．（25-26高三上·内蒙古赤峰·期中）乳酸菌是一种非致病性微生物，可作为异源蛋白进入动物体内的载体，具有广阔的应用前景。研究人员尝试制备重组乳酸菌作为口服疫苗，为提升免疫效果，研究人员采用重叠延伸PCR技术将GFP基因与高表达启动子P11连接，构建重组质粒（如下图）。已知GFP是来源于水母的绿色荧光蛋白，作为本研究的抗原蛋白，Gm为氯霉素抗性基因。回答下列问题： （1）乳酸菌获取与纯化：获取动物消化道内壁刮取物，加入无菌生理盐水振荡摇匀，采用______法接种于固体培养基上，培养一段时间后挑取单菌落接种于液体培养基中进行______。培养基中加入磷酸氢二钾（K2HPO4）与磷酸二氢钾（KHPO4）的作用是______，为乳酸菌生长繁殖提供有利环境条件。 （2）构建重组乳酸菌： ①获取GFP基因：提取水母的基因组，通过PCR技术扩增GFP基因。PCR之初要进行预变性，以基因组作为模板进行PCR时需要更高的预变性温度和时间，这是为了______。 ②构建P11-GFP串联序列：PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，据图分析原因是______；为保证P11-GFP串联序列能定向接入质粒，由图分析设计引物时需在引物1的5'端加入BglⅡ限制酶的识别序列，在引物4的5'端加入EcoRⅠ限制酶的识别序列。 ③构建重组质粒：利用BglⅡ限制酶、EcoRⅠ限制酶和______酶，将P11-GFP串联序列与质粒载体连接，形成重组质粒。 ④转化乳酸菌：将重组质粒导入经______处理的乳酸菌中，将处理过的乳酸菌涂布在含______的LB琼脂平板中筛选重组乳酸菌。欲测定重组乳酸菌中GFP基因的转录水平，可用______处理样品以避免乳酸菌中GFP基因的干扰，也可通过测定重组乳酸菌的______来评估其GFP基因的表达水平。 （3）检测乳酸菌口服疫苗的免疫效果：给小鼠灌胃重组乳酸菌，可以通过检测小鼠体内______的来评估乳酸菌口服疫苗的免疫效果。 3．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨六中·期中）下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为氨苄青霉素抗性基因）。回答下列问题： （1）转基因抗冻番茄培育过程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、________、________。 （2）获取鱼的抗冻蛋白基因的PCR技术可以分为_____、复性和延伸三步。 （3）图中对质粒和含鱼的抗冻蛋白基因的DNA进行剪切，选用的限制酶可以是SmaⅠ和_______。构建的基因表达载体包括的基本结构有目的基因、_______、终止子、标记基因和复制原点等。 （4）过程②常利用_____法将目的基因导入受体细胞，构建基因表达载体时需使用的质粒是______。 （5）可通过PCR 等技术检测番茄的染色体DNA上是否插入了鱼的抗冻蛋白基因或检测鱼的抗冻蛋白基因是否_______。 4．（25-26高三上·黑龙江大庆实验中学·期中）血栓病是心脑血管疾病中死亡率和严重致残率较高的重大疾病之一。组织纤溶酶原激活剂（t-PA）可选择性高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者可水解血栓中纤维蛋白，使血管畅通，故t-PA能应用于预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病。研究人员获取t-PA基因的cDNA，利用pUC19质粒、pPIC9K质粒构建基因表达载体，过程如图所示，图中①②③④表示过程。回答下列问题∶ 注∶pPIC9K质粒中的AmpR、KanR表示标记基因，Ori表示复制原点，带箭头的序列表示启动子，指示线指示酶切位点。 （1）图示过程中，需要用到DNA连接酶、逆转录酶的过程分别是__________、__________（填图中的数字）。经过程②③获取的目的基因含有山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动子，故构建重组质粒时，宜选用限制酶__________对pPIC9K质粒进行酶切。 （2）挑选未发情的成年母兔肌肉注射促性腺激素，连续注射4天后与公兔配种，第5天后手术取卵，这些步骤的目的是__________。将重组质粒导入受体细胞内，再通过__________技术获得转基因兔。待转基因母兔产仔后收集其乳汁，将乳汁离心获得乳清，采用__________方法检测乳清中是否存在t-PA. （3）用纤维蛋白平板溶圈法测定纯化乳清中t-PA的活性。在含有纤维蛋白（呈乳白色）和纤溶酶原的平板上打出大小相同的孔隙，将t-PA标准品和待测样品加入各孔隙中，在37℃条件下培养至出现透明圈，测定各透明圈的直径，参照标准曲线即可测得t-PA的活性。该检测方法的原理∶若t-PA的活性高，则__________，透明圈直径大。 5．（25-26高三上·黑龙江绥化·期中）将含纳豆激酶原基因的表达组件Pnis-aprN整合到乳酸菌的基因组上，即可构建出食品级的基因工程菌，过程如图。XhoI、HindⅢ、EcoRI、BamHI、SphI为限制酶，origin表示复制原点，amp为氨苄抗性基因，cm为氯霉素抗性基因。请回答下列问题： （1）图1为载体pFY006的构建过程：首先利用限制酶________获得质粒pFY005上的HisH基因，为保证载体pFY004与HisH基因正确连接，扩增HisH基因时，需在引物的______（填3′或5'）端添加限制酶_____的识别序列。 （2）图2为载体pFY007，研究团队利用限制酶SphI对载体pFY006和pFY007进行同源重组，将纳豆激酶原基因的表达组件Pnis-aprIN整合到载体pFY006上，构建出长度为4791bp的基因表达载体pFY008。为验证重组载体pFY008是否构建成功，需利用限制酶______，通过_________技术检测酶切产物，得到大约________bp的条带，若此条带大小与目的基因Pnis-aprN序列大小相符，则表明构建成功。 （3）当pH值<5.0时，纳豆激酶迅速失活，乳酸菌发酵后培养基pH值往往为3~4，分泌到细胞外的纳豆激酶可能失活。某科研团队欲利用蛋白质工程来解决此问题，应从________出发，设计_____，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的________或合成新的基因，从而获得所需要的纳豆激酶。 6．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨市第三中学校·期中）研究发现，某些植物的种子脱水数十年后复水仍能够恢复活性，原因是细胞中积累了海藻糖。科研人员拟将酵母菌的海藻糖合成酶基因（TPS）转入小麦中，培育具备抗旱特性的小麦。下图标注了载体、TPS基因的酶切位点和预期的基因表达载体的结构，表格列举了限制酶的识别序列。 酶 BamHI SacI HindⅢ XbaI 识别序列 5'-GGATCC-3' 5'-GAGCTC-3' 5'-AAGCTT-3' 5'-TCTAGA-3′ （1）利用PCR技术获取和扩增目的基因时，引物的作用是______。为了特异性地扩增TPS基因，并使其能与图中质粒正确连接，需根据______、______设计两种引物。据图分析，合适的2种引物序列分别是_______（填写选项字母）。 A．5'-GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT-3′ B．5'-GGATCCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3' C．5'-GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3' D．5'-GAGCTCGAATCGAACGATTAGCAACT-3' （2）在基因工程的操作程序中，_______是核心工作，其目的是让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使________。在此项工作中，可利用_______将扩增得到的TPS基因与相应限制酶切割后的质粒拼接起来。 （3）将TPS基因导入小麦细胞常用的方法有_______（答出2点即可）。图中Bar基因是抗除草剂基因，实验中可通过在获得的植株叶片上涂抹_______辅助筛选可能含有TPS基因的植株，在此项工作中，Bar基因作为载体上的_______基因。 （4）筛选得到的TPS转基因小麦植株还需要进行个体生物学水平的鉴定，即将获得的小麦植株种植在______胁迫的环境中并检测小麦的生长情况来确定TPS基因是否赋予了小麦相应的特性及抗性的程度。 考点8 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（25-26高三上·内蒙古兴安盟名校联盟·期中）细胞分裂素在马铃薯抵御外界胁迫方面发挥重要作用，研究人员推测细胞分裂素合成关键酶（IPT，编码基因为）通过与其他蛋白相互作用来实现其功能。利用酵母双杂交系统寻找IPT的互作蛋白，其原理是AD蛋白与BD蛋白互相接近时，能够与酵母细胞中基因启动子上游激活序列结合，启动基因表达，基因表达产物能催化培养基中X-gal形成蓝色物质。回答下列问题。 （1）利用马铃薯进行组织培养时应选择______作为外植体获得脱毒苗，原因是______。 （2）研究人员可利用DNA不溶于______的特性析出DNA；也可提取分离马铃薯植株和块茎的总RNA，纯化得到mRNA后进行逆转录获得互作蛋白基因，纯化mRNA的目的是______。 （3）下图是寻找IPT的互作蛋白的核心过程： ①饵蛋白载体中与增殖相关的元件是______。将饵蛋白载体和靶蛋白载体共同导入色氨酸-亮 氨酸营养缺陷型酵母菌中，通过观察菌落特征确定蛋白质是否互作，为达成实验目的，所用培养基在组成成分上的特点是______。 ②为使实验更加严谨，还应设计3组对照组，对照组1的饵蛋白载体和靶蛋白载体上分别携带基因和基因，对照组2饵蛋白载体和靶蛋白载体分别携带______基因，对照组3的饵蛋白载体和靶蛋白载体分别携带______基因。 ③若在培养基上观察到______，表明IPT蛋白能够与VOZ1蛋白发生相互作用。 （4）科研人员想优化IPT蛋白的功能，使其更易与抗逆相关的互作蛋白结合，需先明确IPT蛋白的______，再根据该信息设计改造方案，最终通过基因合成获得改造后的基因。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题11 生物技术工程 考点1 传统发酵技术的应用 1.【答案】D 2.【答案】A 考点2 微生物的培养与应用 1.【答案】A 2.【答案】C 3.【答案】D 4.【答案】A 5.【答案】（1）D （2）等量的生理盐水 高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌）和干热灭菌法 异养需氧型 炭疽芽孢杆菌大量繁殖 低 （3）105 2.5×107 考点3 植物细胞工程 1.【答案】C 2.【答案】ABD 3.【答案】C 4.【答案】D 考点4 动物细胞工程 1.【答案】D 2.【答案】BD 3.【答案】（1）注射一定量的促性腺激素 （2）卵母细胞体积大、营养丰富、更容易激活细胞核的全能性 北极狼皮肤细胞的细胞核中含有该物种一整套遗传信息 （3）电刺激、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂 使其完成细胞分裂和发育进程 a滋养层 （4）不需要，代孕动物对移植入子宫的外来胚胎基本不会发生免疫排斥反应 考点5 胚胎工程 1.【答案】C 2.【答案】B 3.【答案】AD 考点6 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】C 2.【答案】（1）增添、替换 （2）A21-A21- 缺失21个碱基对的A21-基因无法与正向引物配对，从而不能扩增，因此A21-A21-个体无条带 A25-基因不能指导植酸的合成，基因型为A25-A25-的个体无法存活 2/3 （3）亮条带：暗条带：无条带=1：2：1 考点7 基因工程综合 1.【答案】（1）聚合酶链式反应 缓冲液 预变性 （2）XmaⅠ和BglⅡ b 翻译 （3）柱头 花粉管通道 不需要 2.【答案】（1）稀释涂布平板法或平板划线法 扩大培养 维持pH稳定 （2）确保DNA双链之间氢键完全打开，以便引物与模板结合 引物2和引物3存在互补序列 DNA连接酶 Ca2+ 氯霉素 DNA酶 绿色荧光强度/绿色荧光蛋白含量 （3）抗绿色荧光蛋白抗体的含量 3.【答案】（1）将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 （2）变性 （3）PstⅠ 启动子 （4）农杆菌转化 Ti质粒 （5）转录出了mRNA 4.【答案】（1）②④ ① Sac Ⅰ、SnaB Ⅰ （2）促进雌兔超数排卵，与公兔配种后获得多枚受精卵，作为转基因的受体细胞 胚胎移植 抗原-抗体杂交 （3）t-PA激活纤溶酶原生成的纤溶酶含量高，水解纤维蛋白多 5.【答案】（1）BamH I 5′ Hind Ⅲ和EcoR I （2）Sph I 琼脂糖凝胶电泳 1484 （3）预期的纳豆激酶的功能 预期的纳豆激酶的结构 脱氧核苷酸序列 6.【答案】（1）使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核糖核苷酸 TPS基因两端的核苷酸序列 BamH I和Sac I识别核苷酸序列 AC （2）构建基因表达载体 使TPS基因能够表达和发挥作用 DNA连接酶 （3）花粉管通道法、农杆菌转化法 除草剂 标记 （4）干旱 考点8 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】（1）茎尖组织（分生区） 分生区附近病毒极少，甚至无病毒 （2）酒精 去除总RNA中的rRNA、tRNA等杂质，保证逆转录获得的DNA均为编码蛋白质的基因 （3）复制原点 该培养基含有X-gal、不含色氨酸和亮 氨酸 StIPT-BD融合基因和AD基因 BD基因和StVOZ1-AD融合基因 蓝色菌落 （4）空间结构 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $