专题14 基因工程（期中真题汇编，广东专用）高三生物上学期

专题14 基因工程 考点1 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1.【答案】D 2.【答案】D 3.【答案】B 4.【答案】B 5.【答案】A 6.【答案】C 7.【答案】（1） 大肠杆菌（细菌） 抗原-抗体杂交 （2） 不会 抗EcoRI的抗体 强 （3） 逆转录 该文库中有抗原phOx亲和力的噬菌体比例过低 （4）随着基质上抗原的密度不断减少，能结合的噬菌体亲和力越来越高，有利于筛选出亲和力更高的抗体 8.【答案】（1） Ca2+转化 氨苄青霉素 当传感器检测到NO时，fimE重组酶能切割黄色荧光蛋白 （YFP）基因，并将切割后的DNA片段重新连接 （2） 用NarX和NarL基因替代norR基因，并用硝酸盐响应启动子替换Pnorv 青色 （3）防止工程菌在非肠道环境中过度扩散，避免对自然环境中的微生物群落造成干扰 考点2 基因工程综合 1.【答案】D 2.【答案】C 3.【答案】（1） DNA半保留复制 DNA聚合酶需要Mg2+激活 （2）BamHⅠ和XbaⅠ （3） 四尾栅藻 PCR、PCR和电泳、抗原一抗体杂交 （4）应添加对照组:用相同废水培养基培养等量非转基因四尾栅藻（其余条件相同），11天后检测对照组总氮、总磷和氟化物的含量并与实验组进行比较 4.【答案】（1）基因数据库 （2） 5’ 防止自身成环和反向连接 单菌落 （3） 除去农杆菌 内 脱分化 （4） 核酸分子杂交 表达载体 特异性条带 害虫和除草剂 转基因玉米 连续自交 单倍体育种 减少单一抗虫基因的选择压力（或增加害虫克服所有抗虫机制的难度） 5.【答案】（1） 扩大培养 发酵罐内的发酵 （2） 脱离R后，启动子P启动GFP基因、PE基因转录 不摄取葡萄糖时，M蛋白阻止 GFP基因转录，无荧光;摄取葡萄糖时，M蛋白 脱离R，启动GFP基因转录，有荧光;伴随PE基因的转录，摄取的葡萄糖越多， 荧光强度越高。 葡萄糖摄取量 （3） ①+ ②- ③- ④- 6.【答案】（1） 变性、复性和延伸 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、引物 （2） X Z （3） Hind Ⅲ会破坏目的基因（或目的基因上有HindⅢ的切割位点） 该启动子可只在番茄果实细胞中启动下游目的基因的转录，避免在其他部位表达 （4）控制半乳糖醛酸酶活性表达的反义基因转入番茄体内后，转录产生的mRNA与半乳糖醛酸酶基因转录产生的mRNA互补，这两种mRNA会通过氢键结合在一起，进而导致半乳糖醛酸酶基因无法表达，番茄不易变软 7.【答案】（1） RNA聚合酶 具有多个限制酶切割位点、有标记基因、能在受体细胞内复制和表达 （2） 激活DNA聚合酶 复性 5’端 （3） SmaⅠ、XbaⅠ 能吸收周围环境中DNA分子 卡那霉素 （4）PCR（或PCR+琼脂糖凝胶电泳或DNA分子杂交技术） 8.【答案】（1） 生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等 未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱 （2） 氯霉素 测序 （3） crtE、crtB、crtI crtB与crtI （4） L-4番茄红素合成酶单独游离表达作为对照，评估双酶组装代谢体生产番茄红素的效率 将crtB和crtI这2个酶组装在一起的L-3重组菌株番茄红素产量最高，其他实验组产量均降低 9.【答案】（1） 浓度为0.3%以上的NaCl溶液 过滤除菌或G6玻璃砂漏斗过滤 盐碱地或周边土壤 用无菌绒布影印（或“影印”接种） 接种到试管斜面冷冻保存 （2） 限制性核酸内切 克隆 溶菌 （3）方案一：植物组织培养：取野生海水稻体细胞经脱分化成愈伤组织再分化成胚状体发育成植株；方案二：将野生海水稻与普通水稻杂交，收获种子种植在盐碱地上筛选 （4） 碱基互补配对 农杆菌转化 10.【答案】（1） 反转录/逆转录 琼脂糖凝胶电泳/电泳 测序 诱导前和诱导后 （2） 上清液 使小鼠产生更多的浆细胞（B 细胞），从而产生更多的抗体 （3）cDNA中无内含子，能在大肠杆菌中正确表达IL-10 （4）SDS使所有蛋白质都带有相同的负电荷，使得迁移速率不再受原始电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小 （5）划线 （6） 提取常见的致病菌DNA作为模板，以该引物进行PCR 扩增，PCR后进行电泳，观察条带情况 只有迟缓爱德华氏菌PCR扩增后出现条带 （7） 100倍 等温条件下进行扩增，不需要模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵精密实验仪器的要求，只需恒温水浴即可完成反应 11.【答案】（1） 将不同来源的DNA 拼接在一起（或者形成重组DNA 分子） 限制性内切核酸酶、DNA 连接酶 （2）避免动物胰岛素进入人体引起过敏反应；成本低，产量高；动物胰岛素可能效果差 （3） cDNA 文库中 真核基因编码区有内含子序列，而大肠杆菌基因没有内含子 （4） GGGCTT 蛋白质工程 （5）B （6） 转录和翻译 大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网和高尔基体 12.【答案】（1） 引物2和引物3 50℃ （2） EcoR V 启动子和终止子 Xho I和Pst I （3） 普通细菌和MT工程菌 培养液 13.【答案】（1） 启动（或促进） 过氧化氢酶（或CAT） （2） 75%酒精 脱分化 生长素和细胞分裂素 潮霉素抗性基因（标记基因） （3） 过氧化物酶体 卡尔文循环（或暗反应） 14.【答案】（1） 识别和结合 模板 （2） 探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响 A蛋白表达量高，苏氨酸运出速率高，菌体中苏氨酸浓度低，对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱 （3）外源基因表达及苏氨酸大量合成消耗菌体中的物质和能量 （4）①氯霉素抗性基因     ②终止子     ③活性低的启动子 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 1.【答案】C 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 3大高频考点 1. 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2. 基因工程综合 3. 基因工程和蛋白质工程的应用 考点1 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（25-26高三上·广东深圳龙岗·期中）科学家利用CRISPR-Cas9技术对水稻直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子区进行定点编辑，需设计sgRNA引导Cas9蛋白切割目标DNA。实验结果发现修饰后的突变体的直链淀粉明显低于野生型，下列叙述错误的是（    ） A．sgRNA的序列需与Wx基因启动子区部分序列互补配对 B．Cas9蛋白通过切割磷酸二酯键断开DNA双链 C．启动子区编辑可能改变RNA聚合酶的结合效率 D．编辑后的Wx基因编码区碱基序列必然发生改变 【答案】D 【解析】A、CRISPR-Cas9 系统中，sgRNA 需与目标 DNA（Wx 基因启动子区）的部分序列互补配对，才能引导 Cas9 蛋白精准切割，A正确； B、Cas9 蛋白的功能是切割DNA双链的磷酸二酯键，从而实现对目标DNA的编辑，B正确； C、启动子是RNA 聚合酶的结合位点，对启动子区进行编辑，可能改变 RNA 聚合酶的结合效率，进而影响基因的转录水平，C正确； D、启动子区属于非编码区，编辑启动子区不一定会改变编码区的碱基序列，D错误。 故选D。 2．（25-26高三上·广东金山中学·期中）温度是影响生物系统稳定性和功能的关键物理因素。无论是高温还是低温，都会对分子结构、生理过程产生影响。下列叙述正确的是（    ） A．低温不会影响酶的活性，所以一般选择低温来保存酶制剂 B．酿酒时，将发酵温度从28℃升高到40℃，有利于发酵的进行 C．处于高温环境时，哺乳动物主要通过减少流向皮肤的血液来降低体温 D．PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚和结合 【答案】D 【解析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 A、低温会影响酶的活性，且不会破坏酶的空间结构，所以一般选择低温来保存酶制剂，A错误； B、酿酒时的适宜温度是18到30℃，将发酵温度从28℃升高到40℃不利于发酵的进行，B错误； C、处于高温环境时，哺乳动物皮肤毛细血管舒张，因而可通过增加流向皮肤的血液来降低体温，C错误； D、PCR基于DNA热变性原理，通过温度循环控制：高温（约95°C）使DNA双链解聚（变性），降温（约50-65°C）使引物与模板结合（复性），中温（约72°C）进行DNA合成（延伸），D正确。 故选D。 3．（25-26高三上·广东深圳坪山高级中学·期中）2000-3000米水深的海底热泉喷口温度高达350-400℃，喷发大量多金属硫化物，富含多种金属。研究发现这里的嗜热硫还原菌为生产者，还有与细菌共生的没有消化系统的巨型管栖动物、管水母、腹足类和一些鱼类组成了繁荣的生态系统。下列相关叙述正确的是（　　） A．嗜热硫还原菌通过光合作用完成无机物到有机物的转化 B．从热泉口的细菌细胞提取的DNA聚合酶可用于PCR技术 C．巨型管栖动物摄入的能量一部分同化，一部分随粪便排出 D．深海热泉的物质和能量可以自给自足，不与生物圈其他生态系统交流 【答案】B 【解析】A、深海热泉口没有光，嗜热硫还原菌进行化能合成作用，把无机物合成为有机物，A错误； B、热泉口的温度很高，这里的细菌细胞中的 DNA 聚合酶可以耐高温，能用于PCR 技术，B正确； C、根据题意，巨型管栖动物没有消化系统，通过体表渗透营养，相当于营腐生生活，没有粪便，C错误； D、深海热泉口的鱼类可以游动，能与其他生态系统进行物质和能量的交流，D错误。 故选B。 4．（25-26高三上·广东潮阳实验学校·期中）在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（    ） A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接 B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中 C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点 D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达 【答案】B 【解析】1、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。 2、基因表达载体的组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因 （1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始； （2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束； （3）标记基因便于目的基因的鉴定和筛选； （4）在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 A、同尾酶识别的核苷酸序列不同，但是产生的末端相同，因此用同尾酶切割运载体和目的基因，可以产生相同的黏性末端而进行互补再次连接，A错误； B、要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中，转录形成的两种mRNA可碱基互补配对，抑制该基因的翻译过程，从而使该基因表达量下降，B正确； C、由于DNA子链延伸时总是从5’到3’，如果目的基因没有合适的酶切位点，那么可以在引物5’端末尾设计加入酶切位点，C错误； D、表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达，D错误。 故选B。 （25-26高三上·广东省肇庆市第二中学·期中）根据下述资料内容，完成下面小题： PCR扩增技术近来年被广泛的应用于基因检测。运用PCR扩增技术检测的简要步骤是：根据目的基因的序列设计PCR扩增引物，引物设计依DNA分子结构特点，要区分正向引物与反向引物，以便于确定DNA分子的复制方向。利用待检DNA为模板进行PCR扩增，再通过凝胶电泳或DNA测序技术鉴定PCR扩增产物。下列为某家系某基因正常片段与突变片段（图中数字为省略掉的碱基，正常基因与突变基因是相同）： 正常基因单链片段：5'-GCTTAGCATTCCAGATC……（293个碱基）……GATCCATGCCCAG-3" 突变基因单链片段：5'-GCTTAGCATTCCATATC……（293个碱基）……GATCCATGCCCAG-3" 为了检测该家系成员基因突变情况，医学工作者先将该家系成员的相关基因提取并进行PCR扩增，然后设计一种特殊的限制性核酸内切酶对PCR扩增产物进行酶切。对酶切结果进行凝胶电泳来判断基因突变情况。 5．在对该基因片段进行PCR扩增前，需要设计引物，现已设计了一条引物为5'-TGGGCATGGATC-3'，下列序列可作为另一条引物的是（    ） A．5'-CTTAGCATTCCA-3' B．5'-TTAGCATTCCAG-3' C．5'-TAGCATTCCAGA-3' D．5'-AGCATTCCAGAT-3' 6．科研工作者选择了某限制酶（识别序列及切割位点为，未标注的碱基部分无该酶的识别位点）。现对该家系三个孩子进行基因检测，通过提取目的基因进行PCR扩增，再用该限制酶切PCR扩增产物进行凝胶电泳，得到电泳图如下，下列叙述正确的是（    ） A．Ⅰ号个体与Ⅲ号个体都有该突变基因 B．如果该突变基因是隐性致病基因，则可以判断孩子的父母有一方一定是患病者 C．b端是电泳槽的负极 D．图中1为致病基因条带所在的位置 【答案】5．A 6．C 【解析】5．检测家系成员基因突变情况，要先对正常基因与突变基因进行PCR扩增后再酶切检测。要使用同一引物既能扩增正常基因又能扩增病基因。观察正常基因片段与突变基因片段，发现只有一个碱基改变（从左往右数第14位）导致。现已经设计的一条引物5'-TGGGCATGGATC-3'，配对在右端（从右往左数第2个碱基开始）位置。那应该考虑另一个引物配对在左侧，而且要将突变位点也能扩增下来。根据DNA双链碱基互补，另一个引物应该配在左侧另一条互补链的3'端，A正确。 故选A。 6．AB、根据限制酶的识别及切割情况，这种限制酶只识别并切割正常基因片段，不能识别并切割突变基因片段。经PCR后电泳，I号个体有3条电泳带，应该是杂合体个体，假设记为Aa。II号个体只有一条电泳带，应是纯合子，但不可能是正常基因的纯合子，因为正常基因被限制酶切成不同长度的两段了，会出现两条电泳带。所以II号个体为隐性纯合子，记为aa。III个体有两条电泳带，结合与II号的位置不同，可以判定III号为正常基因纯合子，记为AA。由于一对夫妻所生子女情况有Aa、AA、aa三种基因型，所以夫妻双方不一定有一方为患病，可能双方都是Aa，AB错误； CD、DNA电泳时，因为自身带负电，所以一般从电泳槽的负极开始电泳。移动的速度与DNA片段的长度有关系，短的片段电泳速度快。根据上面的分析，3号位置应该为突变基因的位置，所以b端为电泳槽的负极，C正确，D错误。 故选C。 7．（25-26高三上·广东金山中学·期中）噬菌体表面展示技术是一种基因工程技术，通过将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外源蛋白以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，这种技术可用于筛选高亲和力抗体。丝状噬菌体呈细长管状，由衣壳蛋白和DNA组成，衣壳蛋白中有一类衣壳蛋白III（PIII）与噬菌体感染有关。回答下列问题： （1）研究人员将EcoRI基因和PIII基因融合进行表面展示，过程如图。首先将EcoRI基因插入PIII基因中；再将重组噬菌体DNA成功导入______________进行培养，获得子代重组噬菌体；为检测EcoRI蛋白是否成功展示在重组噬菌体表面，可采用_____________对重组噬菌体进行检测。 （2）根据噬菌体表面展示技术的目的，推测展示在噬菌体表面的EcoRI蛋白________（填“会”或“不会”）影响重组噬菌体的感染过程。为证明该推测，研究人员设计如下表实验并检测感染能力。根据以上信息，完成下列表格。 对照组1 对照组2 对照组3 实验组 野生型噬菌体 - + + - 重组噬菌体 + - - + 过量游离的EcoRI蛋白 + - + - ____的抗体 + + + + 感染能力 强 ______ 强 弱 注：“-”表示未添加，“+”表示添加 （3）抗体的结构包含VH和VL。研究人员从抗原phOx免疫的小鼠脾脏中提取mRNA，经________过程获得VH和VL的cDNA。将一系列VH和VL的cDNA随机两两组合后，插入PIII基因，构建出2×105种噬菌体克隆作为文库。从文库中选择568种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx结合的噬菌体极少，若实验操作没有问题，则表明该噬菌体文库中__________________。 （4）研究人员将抗原phOx附着在特定基质上，将噬菌体文库中的噬菌体通过基质，并进行多次重复，每次重复时减少基质上抗原phOx的密度，推测多次重复的意义_____________。 【答案】（1） 大肠杆菌（细菌） 抗原-抗体杂交 （2） 不会 抗EcoRI的抗体 强 （3） 逆转录 该文库中有抗原phOx亲和力的噬菌体比例过低 （4）随着基质上抗原的密度不断减少，能结合的噬菌体亲和力越来越高，有利于筛选出亲和力更高的抗体 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 （1）噬菌体可以侵染大肠杆菌，可将重组噬菌体DNA成功导入大肠杆菌（细菌）；抗原-抗体杂交可以检测抗体，可采用抗原-抗体杂交对重组噬菌体进行检测。 （2）对照组1和对照组3均含过量游离的EcoRI蛋白，感染能力均较强，因此推测展示在噬菌体表面的EcoRI蛋白不会影响重组噬菌体的感染过程；检测各组的EcoRI蛋白，利用抗原-抗体杂交，需要加入抗EcoRI的抗体；对照组2为野生型噬菌体，感染能力强。 （3）逆转录以mRNA为模板，可以获得cDNA；该文库中有抗原phOx亲和力的噬菌体比例过低，因此选择568种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx结合的噬菌体极少。 （4）随着基质上抗原的密度不断减少，能结合的噬菌体亲和力越来越高，有利于筛选出亲和力更高的抗体，每次重复时减少基质上抗原phOx的密度。 8．（25-26高三上·广东惠来一中·期中）研究发现，肠道炎症可以上调宿主诱导型一氧化氮合酶的表达，从而导致一氧化氮（NO）浓度增加，NO在肠道内可被迅速转化为硝酸盐。研究人员利用对NO具有高度特异性的调控蛋白norR开发了一种对NO响应的细菌传感器。当NO与norR结合时，norR结构发生改变，并启动Pnorv启动子的转录，研究人员将fimE重组酶基因（能催化下游的DNA分子进行切割和重新连接）置于Pnorv启动子的控制下，当传感器检测到NO时，细菌从表达黄色荧光蛋白切换到表达青色荧光蛋白。该质粒图谱如图所示。回答下列问题： （1）基因工程中可通过_____法将NO响应的细菌传感器导入大肠杆菌，然后在含有_____的选择培养基上筛选成功导入NO响应的细菌传感器的大肠杆菌。根据题意分析，fimE重组酶基因调控细菌从表达黄色荧光蛋白切换到表达青色荧光蛋白的可能机制为_____。 （2）研究发现NarX蛋白可感应硝酸盐并激活NarL蛋白，激活的NarL能结合硝酸盐响应启动子，启动下游基因的表达。若要设计另一套质粒，在NO响应的细菌传感器的基础上进行改造，使改造的质粒能和NO响应的细菌传感器同时导入大肠杆菌中，实现NO和硝酸盐的双重检测。从启动子相关角度需进行的改造为_____，从荧光蛋白基因的角度，需进行的改造为将_____（填“青色”或“黄色”）荧光蛋白基因替换为其他易于区分的非黄色的荧光蛋白基因。 （3）实验小组在NO响应的细菌传感器中还引入了一个特殊的温度敏感型自杀基因，该基因可在非肠道环境中启动表达，引入该自杀基因的意义在于_____。 【答案】（1） Ca2+转化 氨苄青霉素 当传感器检测到NO时，fimE重组酶能切割黄色荧光蛋白 （YFP）基因，并将切割后的DNA片段重新连接 （2） 用NarX和NarL基因替代norR基因，并用硝酸盐响应启动子替换Pnorv 青色 （3）防止工程菌在非肠道环境中过度扩散，避免对自然环境中的微生物群落造成干扰 【解析】基因工程的基本操作程序主要包括以下四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）将目的基因导入大肠杆菌细胞常用感受态细胞法，可通过Ca2+转化使其称为感受态细胞。质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此可在含有氨苄青霉素的选择培养基上筛选成功导入NO响应的细菌传感器的大肠杆菌。 由题意可知，fimE重组酶基因能催化下游的DNA分子进行切割和重新连接，当传感器检测到NO时，fimE重组酶能切割黄色荧光蛋白 （YFP）基因，并将切割后的DNA片段重新连接，从而调控细菌从表达黄色荧光蛋白切换到表达青色荧光蛋白。 （2）要实现NO和硝酸盐的双重检测，需让硝酸盐信号也能启动特定基因表达。题干表明“NarX蛋白可感应硝酸盐并激活NarL蛋白，激活的NarL能结合硝酸盐响应启动子，启动下游基因的表达”，因此可以用NarX和NarL基因替代norR基因，并用硝酸盐响应启动子替换Pnorv，并将该启动子与一个“易于区分的非黄色荧光蛋白基因”相连（确保硝酸盐存在时，该启动子驱动独特荧光信号表达）。同时，为了与检测NO时的荧光信号区分开，需将原有的青色荧光蛋白基因替换为其他报告基因，如红色荧光蛋白基因，以便在检测硝酸盐时产生不同的荧光信号。 （3）引入温度敏感型自杀基因，可使工程菌在非肠道环境（如自然环境）中启动该基因表达，导致自身死亡，从而防止工程菌过度扩散，避免对自然环境中的微生物群落等造成不必要的干扰。 考点2 基因工程综合 1．（25-26高三上·广东金山中学·期中）番茄中的PG基因控制合成的多聚半乳糖醛酸酶，能破坏细胞壁使番茄软化。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，其合成的mRNA能与PG基因合成的mRNA 相结合，从而培育出抗软化的转基因番茄。下列叙述错误的是（    ） A．PG基因与抗PG基因的碱基序列不完全相同 B．利用PCR 技术可检测抗PG基因是否正常转录 C．转基因番茄可能会由于花粉扩散导致基因污染问题 D．抗PG基因通过抑制PG基因的转录使其mRNA无法合成 【答案】D 【解析】真核细胞基因的表达包括转录和翻译，转录指的是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，翻译指的是以mRNA为模板合成蛋白质的过程。 A、根据题干信息可知，抗PG基因合成的mRNA与PG基因合成的mRNA相结合，因此可以推测，PG基因和抗PG基因是同一段DNA分子序列，转录时模板链不同，所以转录产生的mRNA能发生碱基互补配对，A正确； B、可以提取RNA，进行逆转录形成DNA，再进行PCR扩增，最后通过电泳检测PCR产物来判断抗PG基因是否正常转录，B正确； C、若抗PG基因整合到染色体DNA上，则花粉中可能含有抗PG基因，转基因番茄可能会由于花粉扩散到其他植物导致基因污染问题，C正确； D、抗PG基因合成的mRNA与PG基因合成的mRNA相结合，从而阻止了PG基因的mRNA的翻译过程，使细胞不能合成PG蛋白，D错误。 故选D。 2．（25-26高三上·广东·期中）基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学的基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。下列关于基因工程的诞生和发展叙述错误的是（　　） A．艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验证明了DNA是遗传物质，还可推断DNA可以在同种生物的不同个体间转移 B．科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA导入受体细胞，外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世 C．桑格等科学家发明了DNA序列分析仪，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，可以在体外完成DNA的复制 D．我国科学家独创了花粉管通道法，可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中完成导入 【答案】C 【解析】A、艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验不仅证明了DNA是遗传物质，还通过不同菌株间的转化现象表明DNA可在同种生物的不同个体间转移，为基因工程提供理论基础，A正确； B、科学家利用质粒作为载体构建重组DNA，并成功在原核细胞中表达外源基因，标志着基因工程正式问世，B正确； C、桑格发明的DNA测序技术（双脱氧终止法）用于分析DNA序列，但体外DNA复制依赖于PCR技术，与测序仪无直接关联，C错误； D、我国科学家首创的花粉管通道法，通过微量注射将目的基因DNA溶液注入植物子房，属于基因工程中目的基因导入的方法之一，D正确。 故选C。 3．（25-26高三上·广东东莞七校·期中）研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的DGAT1基因导入四尾栅藻（操作过程如下图所示），获得转基因的产油微藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题： （1）PCR 技术的原理是________，PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+原因是________________。 （2）将DGAT1基因与pBH21构建基因表达载体时，需在DGAT1基因的两端添加限制酶________________________________的识别序列。 （3）启动子往往具有物种特异性，在载体pBH21质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择__________（填“紫苏 DGAT1基因”“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。对获得的转基因四尾栅藻进行不同的分子水平检测，可采用的技术有_____________________（答出2种）。 （4）为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。 表培养转基因四尾栅藻的地热废水培养基各项指标测定结果 各项指标 总氮/（mg·L⁻¹） 总磷/（mg·L⁻¹） 氟化物/（mg·L⁻¹） 初始 23.2 4.32 4.56 培养转基因四尾栅藻 11天后 1.9 0.45 0.84 该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计：_________________。 【答案】（1） DNA半保留复制 DNA聚合酶需要Mg2+激活 （2）BamHⅠ和XbaⅠ （3） 四尾栅藻 PCR、PCR和电泳、抗原一抗体杂交 （4）应添加对照组:用相同废水培养基培养等量非转基因四尾栅藻（其余条件相同），11天后检测对照组总氮、总磷和氟化物的含量并与实验组进行比较 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 （1）PCR技术即聚合酶链式反应，是一种用于体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术，其原理是DNA的半保留复制；DNA聚合酶需要Mg2+激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+； （2）基因表达载体的构建需要将目的基因插入启动子和终止子之间，且不能破坏卡那霉素抗性基因。观察质粒pBH21的酶切位点，只有BamHⅠ和XbaⅠ能满足在不破坏关键元件的情况下插入目的基因，所以将DGAT1基因与pBH21构建基因表达载体时，需在DGAT1基因的两端添加限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的识别序列； （3）启动子是一端特殊的DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动基因的 转录，故要达到让紫苏DGAT1基因在四尾栅藻细胞中表达的目的，应该添加四尾栅藻启动子；对获得的转基因四尾栅藻进行分子水平的检测，通过PCR等技术检测四尾栅藻的染色体DNA上是否插入了DGATI基因（或DGATI基因是否转录出了mRNA）；用抗DGATl的抗体与从转基因四尾栅藻中提取的蛋白质进行抗原—抗体杂交以检测DGAT1基因是否翻译出蛋白质； （4）要想证明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，应增加非转基因四尾栅藻对废水的去污能力，将转基因四尾栅藻与非转基因组结果进行比较，即应添加对照组，废水培养非转基因四尾栅藻11天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。 4．（25-26高三上·广东光明区高级中学·期中）近年来复合性状逐渐成为转基因作物开发的重要特性。科研工作者通过转基因技术获得抗虫耐除草剂的转基因玉米新品种。回答下列问题： （1）设计融合基因。C1和V3是两种不同的杀虫蛋白，通过检索________获得C1和V3基因的有关信息，利用软件分析和预测，将两种蛋白的主要结构域组合形成融合蛋白，设计出融合基因cl-v3。 （2）构建表达载体。用PCR扩增c1-v3基因时，一对引物的________端分别添加限制酶XbaⅠ和SacⅠ的识别序列，使用两种而不是一种限制酶的作用是________。将c1-v3基因和耐除草剂基因bar连接到Ti质粒上。取出低温保存的农杆菌菌种划线培养，培养至长出________，验证活性后制备成菌液并导入表达载体。 （3）玉米的转化和筛选。用农杆菌菌液侵染玉米幼胚，5min后将幼胚置于灭菌的滤纸上吸去菌液，转移至添加头孢霉素和潮霉素的培养基上筛选。头孢霉素只能抑制细菌不能抑制植物细胞，添加头孢霉素的作用是________；潮霉素既能抑制细菌也能抑制植物细胞，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA片段________（填“内”或“外”）。玉米幼胚经过________形成愈伤组织，最后获得转化植株。 （4）转基因玉米的鉴定。 ①提取转化植株的基因组DNA，以c1-v3基因和bar基因的特异区段序列为模板合成探针进行________，以________作为阳性对照，以非转基因玉米作为阴性对照，结果显示与阳性对照出现相同的________，表明目的基因成功整合到玉米基因组中。 ②进一步检测性状，可采用________处理________，根据结果筛选已成功获得转基因玉米新品种。 ③导入1个融合基因的转基因玉米绝大多数是杂合子，不能稳定遗传，可通过________方法获得纯种，也可用________技术更快获得理想品种。 ④同时导入2个或更多抗虫机制不同的针对同一害虫的抗虫基因，与导入单一抗虫基因比更能有效延缓害虫产生抗性的时间，原因是________。 【答案】（1）基因数据库 （2） 5’ 防止自身成环和反向连接 单菌落 （3） 除去农杆菌 内 脱分化 （4） 核酸分子杂交 表达载体 特异性条带 害虫和除草剂 转基因玉米 连续自交 单倍体育种 减少单一抗虫基因的选择压力（或增加害虫克服所有抗虫机制的难度） 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）设计融合基因。c1和v3是两种不同的杀虫蛋白，通过检索基因数据库获得c1和v3基因的有关信息，利用软件分析和预测，将两种蛋白的主要结构域组合形成融合蛋白，设计出融合基因c1-v3。 （2）构建表达载体。用PCR扩增c1-v3基因时，一对引物的5’端分别添加限制酶XbaⅠ和SacⅠ的识别序列，使用两种而不是一种限制酶的作用是防止自身成环和反向连接。将c1-v3基因和耐除草剂基因bar连接到Ti质粒上。取出低温保存的农杆菌菌种划线培养，培养至长出单菌落，验证活性后制备成菌液并导入表达载体。 （3）玉米的转化和筛选。用农杆菌菌液浸染玉米幼胚，5min后将幼胚置于灭菌的滤纸上吸去菌液，转移至添加头孢霉素和潮霉素的培养基上筛选。头孢霉素只能抑制细菌不能抑制植物细胞，添加头孢霉素的作用是除去农杆菌；潮霉素既能抑制细菌也能抑制植物细胞，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA片段内。玉米幼胚经过脱分化形成愈伤组织，最后获得转化植株。 （4）转基因玉米的鉴定。①提取转化植株的基因组DNA，以c1-v3基因和bar基因的特异区段序列为模板合成探针进行核酸分子杂交，以表达载体作为阳性对照，以非转基因玉米作为阴性对照，结果显示与阳性对照出现相同的特异性条带，表明目的基因成功整合到玉米基因组中。②进一步检测性状，可采用害虫和除草剂处理转基因玉米，根据结果筛选已成功获得转基因玉米新品种。③导入1个融合基因的转基因玉米绝大多数是杂合子，不能稳定遗传，可通过连续自交方法获得纯种，也可用单倍体育种技术更快获得理想品种。④同时导入2个或更多抗虫机制不同的针对同一害虫的抗虫基因，比与导入单一抗虫基因能有效延缓害虫产生抗性的时间，原因是减少单一抗虫基因的选择压力（或增加害虫克服所有抗虫机制的难度）。 5．（25-26高三上·广东广州铁一中学·期中）发酵工程离不开微生物培养，为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌。 （1）发酵工程一般包括菌种的选育、________、培养基的配制、灭菌、接种、发酵产品的分离、提纯等方面。其中________是发酵工程的中心环节。 （2）PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。 ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，M蛋白________，PE表达的产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理________。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测________和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 （3）在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pc，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中c蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ①________ ②________ 高浓度葡萄糖 ③________ ④________ 【答案】（1） 扩大培养 发酵罐内的发酵 （2） 脱离R后，启动子P启动GFP基因、PE基因转录 不摄取葡萄糖时，M蛋白阻止 GFP基因转录，无荧光;摄取葡萄糖时，M蛋白 脱离R，启动GFP基因转录，有荧光;伴随PE基因的转录，摄取的葡萄糖越多， 荧光强度越高。 葡萄糖摄取量 （3） ①+ ②- ③- ④- 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法；（4）目的基因的检测与鉴定。 （1）发酵工程一般包括菌种的选育、扩大培养、培养基的配制、灭菌、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，其中发酵罐内的发酵是发酵工程的中心环节 （2）①推测M蛋白的作用：当存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，此时M蛋白脱离R后，启动子P启动GFP基因、PE基因转录。 ②生物传感器的工作原理：无葡萄糖时M蛋白结合在R上，抑制PE基因和GFP基因的转录，因此细胞不产生GFP，无荧光信号。有葡萄糖时葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞并被磷酸化，导致M蛋白脱离R。此时，启动子P启动PE基因和GFP基因的转录，PE酶使E蛋白重新磷酸化以维持葡萄糖摄取，同时GFP表达产生荧光。荧光强度与葡萄糖摄取量正相关，从而实现对葡萄糖摄取状态的监测。 ③验证生物传感器可靠性的检测指标：在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测葡萄糖消耗量和荧光强度。若二者呈正相关，则证明荧光信号可反映葡萄糖摄取量。 （3）调控机制解释：低浓度葡萄糖时C蛋白仍能结合Pc（+），启动子Pc被激活；同时，葡萄糖的存在使M蛋白脱离启动子（-），PE基因和GFP基因高效表达，促进葡萄糖摄取。高浓度葡萄糖抑制C蛋白与Pc的结合（-），启动子Pc活性降低；同时，M蛋白仍保持脱离状态（-），但由于Pc失活，PE基因和GFP基因表达量下降，从而减少葡萄糖摄取，避免浪费。这种双调控机制使生物传感器能根据葡萄糖浓度动态调整基因表达，优化目标产物的生产过程。 6．（25-26高三上·广东深圳·期中）英国科学家凯茜·马丁及其团队通过基因工程，成功培育出了富含花青素的紫色番茄，这引起了全球的广泛关注。马丁团队从金鱼草中提取了花青素合成的关键基因Del和Rosl。为了使Del基因和Rosl基因能够更好地表达，科研人员试图将两基因融合为Del-Rosl基因（部分过程如图1所示），从而获得活性更高的花青素合成酶。同时从拟南芥中提取了MYB12基因，该基因能促进类黄酮生物合成的黄酮醇特异性激活。当这三个基因被巧妙地引入普通番茄的基因组后，番茄仿佛被施了魔法，番茄中原本沉默的花青素合成机制被瞬间唤醒。回答下列问题： （1）PCR循环的三个步骤包括_______。PCR3过程中除原料、含Mg2+的缓冲液、PCR1和PCR2的产物外，还需要加入的物质有________。 （2）Del基因以a链为模板转录，Rosl基因以d链为模板转录，为获得Del-Rosl基因，在PCR1和PCR2过程前，在引物________和引物________的5'端添加互补序列。 （3）含MYB12基因的DNA片段中相关限制酶的酶切位点如图2所示。构建基因表达载体时不能选用HindⅢ切割MYB12基因，原因是_____________。构建Del、Rosl、MYB12三个基因的表达载体时，科研人员将三个基因串联在番茄果实的特异性启动子下游，选择该启动子的优势为_______。 （4）研究发现，番茄体内的半乳糖醛酸酶能破坏细胞壁的果胶层，从而使果实很快变软，不耐贮藏。科学家采用基因工程技术将控制半乳糖醛酸酶表达的反义基因转入番茄细胞中，从而解决了这一问题。请从基因表达的角度简要解释原因：_________。 【答案】（1） 变性、复性和延伸 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、引物 （2） X Z （3） Hind Ⅲ会破坏目的基因（或目的基因上有HindⅢ的切割位点） 该启动子可只在番茄果实细胞中启动下游目的基因的转录，避免在其他部位表达 （4）控制半乳糖醛酸酶活性表达的反义基因转入番茄体内后，转录产生的mRNA与半乳糖醛酸酶基因转录产生的mRNA互补，这两种mRNA会通过氢键结合在一起，进而导致半乳糖醛酸酶基因无法表达，番茄不易变软 【解析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 （1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。包括高温变性、低温复性、中温延伸三个步骤。PCR3过程中除原料、含Mg2+的缓冲液、PCR1和PCR2的产物外，还需要加入的物质有耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、引物。 （2）Del 基因以a链为模板转录，PCR1扩增Del基因；Ros1基因以d链为模板转录，PCR2扩增Ros1基因。为使两者产物能重叠延伸，需在引物 X和引物Z的 5' 端添加互补序列，使它们的扩增产物形成重叠区域，进而通过重叠延伸得到Del-Ros1基因。 （3）从图2可知，Hind Ⅲ的酶切位点位于MYB12基因内部，若用Hind Ⅲ切割，会破坏MYB12基因（目的基因），因此不能选用 HindⅢ 切割 MYB12 基因。选择 “番茄果实特异性启动子” 的优势是：该启动子可只在番茄果实细胞中启动下游目的基因的转录，避免在其他部位表达，避免对番茄其他组织的代谢和发育产生不必要的影响（实现特异性表达，节省细胞内的物质和能量）。 （4）反义基因转录出的mRNA，能与 “控制半乳糖醛酸酶表达的正常mRNA”互补配对，这两种mRNA会通过氢键结合在一起，进而导致半乳糖醛酸酶基因无法表达，减少半乳糖醛酸酶的合成，使果实细胞壁的果胶层不易被破坏，果实不易变软，利于贮藏。 7．（25-26高三上·广东湛江·期中）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造（如图所示），利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个插入种子休眠基因的纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。回答下列问题： （1）基因表达载体中启动子是_______识别并结合的位点，质粒作为常用的载体，其特点有_______（答出两点）。 （2）PCR扩增休眠基因X时，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是_______。PCR过程中需要控制温度条件，其中温度最低的阶段为_______。在引物的_______（填“3’端”或“5’端”）添加限制酶的识别序列。 （3）根据图示信息，切割目的基因与Ti质粒用_______限制酶酶切，以防止反向连接。将重组Ti质粒导入农杆菌时需要用Ca2+处理农杆菌，使其处于_______的生理状态。为筛选出含重组质粒的农杆菌，需在培养基中添加_______。 （4）对培养的受体细胞进行检测时，可通过_______技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上。 【答案】（1） RNA聚合酶 具有多个限制酶切割位点、有标记基因、能在受体细胞内复制和表达 （2） 激活DNA聚合酶 复性 5’端 （3） SmaⅠ、XbaⅠ 能吸收周围环境中DNA分子 卡那霉素 （4）PCR（或PCR+琼脂糖凝胶电泳或DNA分子杂交技术） 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 （1）基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，质粒作为常用的运载体，其特点有具有多个限制酶切割位点、有标记基因、能在受体细胞内复制和表达。 （2）PCR扩增休眠基因X时，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是激活DNA聚合酶。PCR过程中需要控制温度条件，其中温度最低的阶段为复性。在引物的5'端添加限制酶的识别序列。 （3）根据图示信息可知，切割目的基因与Ti质粒时，为防止反向连接可选用SmaⅠ和XbaⅠ进行双酶切。将重组Ti质粒导入农杆菌时需要用Ca2+处理农杆菌，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为筛选出含重组质粒的农杆菌，需在培养基中添加卡那霉素，因为重组质粒上含有卡那霉素抗性基因，只有含有重组质粒的农杆菌才能在含有卡那霉素的培养基上生存。 （4）对培养的受体细胞进行检测时，可通过PCR技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上。 8．（25-26高三上·广东·期中）番茄红素是一种强效抗氧化剂，属于类胡萝卜素家族，广泛存在于番茄、西瓜等红色果蔬中。为了提升大肠杆菌中番茄红素的生物合成效率，优化合成酶的代谢通路（大肠杆菌生产番茄红素代谢途径如图a），构建番茄红素合成酶组装调控代谢体。由于三酶以上融合较困难，研究者构建了双酶组装质粒，如图b。此外构建了质粒L-4如图c。回答下列问题： （1）对大肠杆菌等微生物的基因改造在基因工程研究最早、最广泛和成果最多，其优点有_______（至少答两点）；转化前一般需先处理大肠杆菌，使其成为感受态，不直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________。 （2）将转化后的大肠杆菌感受态细胞，涂在含________的平板上进行筛选，并进行菌落PCR验证。PCR验证正确的质粒，还需进一步进行________。 （3）EcCas6e和Csy4蛋白能通过一定机制将与之融合表达的任意2个酶进行体内组装。构建好的3种质粒分别命名为L-1、L-2和L-3。其中L-1质粒中crtE蛋白与EcCas6e融合表达，crtB蛋白与Csy4蛋白融合表达，并借助EcCas6e和Csy4形成的复合体将crtE蛋白和crtB蛋白组装在一起。crtl蛋白单独游离表达；则图b中，①②③处应分别为________；依此规律L-2质粒中crtE蛋白与crtl蛋白组装在一起，crtB蛋白单独游离表达。则L-3质粒中________蛋白完成组装。 （4）将构建好的质粒L-1、L-2、L-3、L-4分别转化大肠杆菌并对番茄红素产量进行检测，实验数据如图d。构建质粒L-4的目的是________；依据实验结果可得出：_________。 【答案】（1） 生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等 未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱 （2） 氯霉素 测序 （3） crtE、crtB、crtI crtB与crtI （4） L-4番茄红素合成酶单独游离表达作为对照，评估双酶组装代谢体生产番茄红素的效率 将crtB和crtI这2个酶组装在一起的L-3重组菌株番茄红素产量最高，其他实验组产量均降低 【解析】基因工程技术的基本步骤:1、目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定:（1）分子水平上的检测:①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）大肠杆菌具有生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作等优点；未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱，所以转化前一般需先处理大肠杆菌，使其成为感受态。 （2）由图中质粒结构可知，含有氯霉素抗性基因（CmR），故将转化后的大肠杆菌感受态细胞，涂在含氯霉素的平板上进行筛选；PCR验证正确的质粒，代表质粒大小正确；需进一步确认碱基顺序，即测序。 （3）图b为双酶组装质粒，将三种酶进行两两组装。借助EcCas6e和Csy4蛋白通过一定机制将与之融合表达（融合基因，共用同一个启动子和终止子可融合表达）的任意2个酶进行体内组装。L-1质粒中crtE蛋白与EcCas6e融合表达，crtB蛋白与Csy4蛋白融合表达，crtI蛋白单独游离表达；故①②③分别为crtE、crtB、crtI。以此类推。依此规律L-2质粒中crtE蛋白与crtI蛋白组装在一起，crtB蛋白单独游离表达。则L-3质粒中crtB与crtI蛋白完成组装，crtE蛋白单独游离表达。 （4）L-4番茄红素合成酶单独游离表达作为对照，评估双酶组装代谢体生产番茄红素的效率。L-3为将crtB和crtI这2个酶组装在一起，结合图可知，L-3重组菌株的番茄红素与对照组相比有明显提升，其他实验组产量均降低。 9．（25-26高三上·广东省肇庆市第二中学·期中）近年来，“海水稻”已经在全球范围推广种植，为解决国际社会粮食危机作出了巨大贡献。海水稻是指能在盐（碱）浓度0.3%以上的盐碱地生长，且单产可达300kg/亩以上的一类水稻品种。对海水稻的改良有多种方案，请思考下列流程，回答问题： 普通水稻海水稻 （1）耐高盐碱细菌的筛选：育种专家发现生活在盐碱地上的微生物体内有抗盐碱基因。请从普通培养基培养得到的菌落中筛选耐高盐碱细菌并保存菌种，完成下列表格中的内容： 耐“高盐碱细菌”的筛选 步骤及项目 普通培养基 选择培养基 配制培养基 LB固体培养基 LB固体培养基+① 培养基灭菌 高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌+② 菌种来源 ③ 普通培养基上长出的菌落。 接种方案 涂布接种法 ④ 菌种保存 / ⑤ ①________  ②________  ③________  ④________  ⑤________ （2）通过基因组文库获取抗盐碱基因：将筛选得到的菌种的基因组DNA用________酶切成适当大小，分别与载体组合，导入细菌细胞，形成________，构成基因组文库。提取时，先用________酶破坏细菌细胞，经过滤、离心、提纯等操作获取DNA分子。获取抗盐碱基因后通过转基因技术改造普通水稻使其成为海水稻。 （12）1986年，广东海洋大学研究员陈日胜在湛江海边发现了第一株野生海水稻，如果你是育种工作者，请写出另一种与上述不同的育种方案：________。 （4）有人觉得海水稻的口感偏硬，这与其生长环境与所含基因均有关。科学家通过基因敲除的方法来改善口感：用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，在受体细胞中得以表达。同源重组依据DNA分子结构上的________原则。一般使用________法将重组DNA分子导入到 【答案】（1） 浓度为0.3%以上的NaCl溶液 过滤除菌或G6玻璃砂漏斗过滤 盐碱地或周边土壤 用无菌绒布影印（或“影印”接种） 接种到试管斜面冷冻保存 （2） 限制性核酸内切 克隆 溶菌 （3）方案一：植物组织培养：取野生海水稻体细胞经脱分化成愈伤组织再分化成胚状体发育成植株；方案二：将野生海水稻与普通水稻杂交，收获种子种植在盐碱地上筛选 （4） 碱基互补配对 农杆菌转化 【解析】（1）筛选耐盐碱菌必须在高盐碱的环境中选择。对于有浓度要求的食盐溶液灭菌不可以使用高压蒸汽灭菌，这样会改变浓度，改用过滤除菌。自然界菌应与其生活的环境相适应，所以耐盐碱的菌应在盐碱地中获取。为了筛选目标菌，在普通培养基上长出的菌落上对应接种到选择培养基上，以确定是否有抗盐碱。这种方法称影印操作或盖章。保存菌种应使用试管斜面冷冻保存。 （2）基因组文库构建是一种相当于转基因操作。用限制性核酸内切酶获得相关基因所在的DNA片段，并进行克隆，分别导入到受体微生物体内保存。当要提取目的基因时需将细菌裂解，裂解细菌的方法是用溶菌酶消化。 （3）野生海水稻中的抗盐碱基因，可以通过植物组织培养的方案进行，因为无性繁殖能保持亲本的优良性状。也可以用杂交育种方案，因为杂交育种能使双亲的优良性状得以保存。 （4）基因敲除是指导入一个新的基因以替代原基因进行表达，从而达到改变性状的目的。这中间涉及DNA分子结构中的碱基互补配对原则。导入植物细胞中经常采用农杆菌转化法。 10．（25-26高三上·广东广州六校·期中）白细胞介素-10（IL-10）是大黄鱼先天性免疫因子之一，在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。某科研小组希望将大黄鱼IL-10基因导入到大肠杆菌，以获得IL-10，并使用纯化的IL-10免疫小鼠以获取抗血清，为IL-10的进一步研究奠定基础。 （1）实验步骤如下： ①大黄鱼IL-10基因的克隆 采集大黄鱼肝脏组织提取mRNA，_____合成cDNA，对cDNA进行PCR扩增，PCR产物先经_____检测，对目的条带切胶回收后连入载体，转化大肠杆菌，经含有抗生素的平板筛选后对阳性菌落扩大培养，经PCR扩增后进行_____得到正确的原核表达工程菌序列。 ②诱导IL-10基因表达 ③SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证IL-10基因表达。 用移液器吸取低分子量蛋白Marker和_____（诱导前、诱导后、诱导前和诱导后）收集的菌体样品10μL进行电泳，用以鉴定IL-10基因表达的结果。 ④IL-10的纯化 ⑤抗血清的制备 （2）小鼠共免疫注射三次，其中每隔一周注射一次，在第14天后，将小鼠麻醉并从心脏取血，将收集到的小鼠血液放于4℃冰箱中静置12小时，用离心机低温离心10分钟，收集_____，以获取抗血清。 免疫注射三次的原因是：_____。 （3）选择cDNA导入到大肠杆菌而不是将目的基因导入大肠杆菌的原因是_____。 （4）SDS（十二烷基硫酸钠）是一种表面活性剂，可以与蛋白质结合并使其表面带有负电荷，推测电泳中SDS的作用是_____。 （5）该科研小组发现某养殖塘大黄鱼大批死亡，并伴有鱼鳍和皮肤溃烂出血等症状，怀疑受到某种致病菌的影响，对该致病菌进行分离培养和生化鉴定。在无菌条件下，从患病濒死大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏中取样，用接种环_____接种于固体培养基上，培养24~48h分离病原菌。观察培养基上的菌落形态、荚膜染色等，最终确定该致病菌为迟缓爱德华氏菌。 （6）科研小组尝试建立常规PCR方法用以检测迟缓爱德华氏菌，根据迟缓爱德华氏菌外膜蛋白A基因设计引物；提取迟缓爱德华氏菌DNA（1．0×107CFU/mL），以该DNA作为模板，PCR扩增后出现条带。 ①验证该引物特异性的实验思路：_____，若该引物特异性良好，预测实验结果：_____。 ②灵敏度验证，提取迟缓爱德华氏菌DNA（1．0×107CFU/mL），依次梯度稀释获得1．0×107CFU/mL-1．0×101CFU/mLDNA进行PCR扩增，将PCR产物电泳，观察有无条带出现。 （7）科研小组尝试建立环介导等温扩增技术（LAMP）用来检测迟缓爱德华氏菌，LAMP是一种新型核酸扩增技术，根据靶基因的6个区域设计4条引物，利用链置换型DNA聚合酶只需在恒温条件下即可完成扩增反应，图一、图二分别为常规PCR和LAMP灵敏度验证电泳条带情况，出现电泳条带表示检测出相对浓度下的迟缓爱德华氏菌，LAMP检测灵敏度是PCR的_____倍。与PCR相比较，LAMP检测的优点是_____。 注：NC：阴性对照；1~7：分别为CFU/mL迟缓爱德华氏菌DNA 【答案】（1） 反转录/逆转录 琼脂糖凝胶电泳/电泳 测序 诱导前和诱导后 （2） 上清液 使小鼠产生更多的浆细胞（B 细胞），从而产生更多的抗体 （3）cDNA中无内含子，能在大肠杆菌中正确表达IL-10 （4）SDS使所有蛋白质都带有相同的负电荷，使得迁移速率不再受原始电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小 （5）划线 （6） 提取常见的致病菌DNA作为模板，以该引物进行PCR 扩增，PCR后进行电泳，观察条带情况 只有迟缓爱德华氏菌PCR扩增后出现条带 （7） 100倍 等温条件下进行扩增，不需要模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵精密实验仪器的要求，只需恒温水浴即可完成反应 【解析】PCR技术的条件：模板DNA、dNTP、一对引物、耐高温DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 （1）以mRNA 为模板合成 cDNA 的过程是逆转录（反转录），需要逆转录酶催化；PCR 产物（DNA 片段）通常用琼脂糖凝胶电泳检测，可分离不同长度的 DNA 片段并观察目的条带；要确定重组工程菌中插入的基因序列正确，需对 PCR 产物进行DNA 测序；SDS-PAGE 验证基因表达，需对比诱导前（未表达）和诱导后（可能表达）的菌体样品，观察是否出现新的蛋白条带。 （2）血液静置、离心后，上清液有血清（含抗体），因此收集上清液；三次免疫可刺激小鼠机体产生更多的浆细胞，从而分泌更多的抗 IL-10 的抗体（增强免疫应答，提高抗血清中抗体的浓度）。 （3）大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，不能对真核基因的初始转录产物（含内含子）进行剪接加工；而 cDNA 是 mRNA 逆转录的产物（已去除内含子），可在大肠杆菌中直接翻译表达。 （4）SDS使所有蛋白质都带有相同的负电荷（消除蛋白质自身电荷差异的影响），使得迁移速率不再受原始电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小。 （5）从患病鱼组织中取样后，需用接种环通过分区划线法接种于固体培养基，可将混杂的微生物分离，获得单菌落，便于后续纯化和鉴定，这里使用接种环而不是涂布器，不能使用涂布方法。 （6）引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，能识别特定的DNA序列，要验证特异性，可以使用该引物来扩增其他无关细菌的DNA，PCR后进行电泳，然后观察条带情况，只有以迟缓爱德华氏菌 DNA 为模板的反应出现条带，其他病原菌 DNA 模板组和阴性对照组均无条带，这说明该引物只能识别迟缓爱德华氏菌 DNA 特定序列，不能识别其他细菌DNA（如果能识别其他细菌DNA，也会出现条带），则具有良好的特异性。 （7）图一中 PCR 的条带在 1~3（对应浓度 1.0×107~1.0×104CFU/mL）出现，最低检测浓度为 1.0×104 CFU/mL； 图二中 LAMP 的条带在 1~6（对应浓度 1.0×107~1.0×102 CFU/mL）出现，最低检测浓度为 1.0×102CFU/mL； 灵敏度倍数为：（1.0×104） ÷ （1.0×102） = 100 倍；与PCR相比较，LAMP检测的优点是等温条件下进行扩增，不需要模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵精密实验仪器的要求，只需恒温水浴即可完成反应。 11．（25-26高三上·广东深圳坪山高级中学·期中）目前中国有几十家制药公司利用基因工程生产重组胰岛素，不同的公司采用不同的技术路线，生产出来的产品也有不同的效果。 回答下列问题： （1）生物的DNA都是由四种脱氧核苷酸聚合而成说明基因工程中______是可行的，与此相对应的则是______酶的发现使这一过程在技术上得以实现。 （2）制药公司用基因工程技术取代动物胰脏分离纯化工艺生产治疗用胰岛素的优点是______（写出两点）。 （3）如果受体细胞是大肠杆菌，则目的基因应从______（“基因组文库”或“cDNA文库中”）获取，因为______。 （4）研究表明，人胰岛素容易形成多分子聚合物，导致降血糖效果大打折扣，其根本原因是胰岛素B链基因中编码第28位脯氨酸和第29位赖氨酸的序列分别为CCC和AAG，如果B链的这两个氨基酸序列颠倒，变成第28位赖氨酸第29位脯氨酸，形成的突变型人胰岛素不容易形成多分子聚合物，注射进入糖尿病人体内之后，降血糖的效果更好。这种技术被称为定点突变技术，可以通过人工合成或者PCR的方法来实现，设计引物时，需要将突变引物中处的序列改为5'______3'，这种在基因层面改造蛋白质的技术称为______。 （5）突变基因最终需要与质粒重组才能构建表达载体。为了与质粒高效正确连接，胰岛素B链突变基因的两端应携带相应的限制性内切核酸酶识别序列，根据下图质粒图谱和突变基因上的相应序列，正确的做法是______。 A．将EcoRI识别序列设计在正常引物的3'端，将NotI识别序列设计在突变引物的3'端 B．将EcoRI识别序列设计在正常引物的5'端，将NotI识别序列设计在突变引物的5'端 C．将EcoRI识别序列设计在正常引物的5'端，将NotI识别序列设计在正常引物的3'端 D．将EcoRI识别序列设计在突变引物的5'端，将NotI识别序列设计在突变引物的3'端 （6）大肠杆菌工程菌获得目的基因之后，通过______表达出胰岛素原，胰岛素原需要经过人工加工才能得到有活性的胰岛素，这是因为______。 【答案】（1） 将不同来源的DNA 拼接在一起（或者形成重组DNA 分子） 限制性内切核酸酶、DNA 连接酶 （2）避免动物胰岛素进入人体引起过敏反应；成本低，产量高；动物胰岛素可能效果差 （3） cDNA 文库中 真核基因编码区有内含子序列，而大肠杆菌基因没有内含子 （4） GGGCTT 蛋白质工程 （5）B （6） 转录和翻译 大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网和高尔基体 【解析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）基因工程的理论基础包括两个方面，一方面是遗传物质 DNA 的结构相似，都是由四种脱氧核苷酸聚合而来的，这说明了基因工程中进行不同来源的 DNA 的拼接是可行的；第二方面则是不同生物的基因的表达都是通过转录和翻译完成的，这个过程中大家所有生物都遵循中心法则， 公用同一套遗传密码，这说明了细胞中表达外源基因是可行的。基因工程的技术保障则是限制性内切核酸酶、DNA 连接酶，以及质粒载体的发现。 （2）从其他哺乳动物提取的胰岛素用于人的话可能会引起引起过敏反应，而且成本高，产量低效果差（因为动物胰岛素的结构可能与人体胰岛素的结构不同）。制药公司用基因工程技术取代动物胰脏分离纯化工艺生产治疗用胰岛素的优点是避免动物胰岛素进入人体引起过敏反应；成本低，产量高；动物胰岛素可能效果差。 （3）因为大肠杆菌是原核生物，原核基因没有内含子，没有转录后加工的过程，所以把真核基因转入原核细胞，需要去掉真核基因的内含子，cDNA 中没有内含子，符合这个要求，即真核基因编码区有内含子序列，而大肠杆菌基因没有内含子，故如果受体细胞是大肠杆菌，则目的基因应从cDNA文库中获取。 （4）根据题意，第 28、29 位氨基酸变成赖氨酸-脯氨酸，编码链序列位 AAGCCC，则突变引物的对应序列应该为从左到右 3'TTCGGG5'，按照先写 5'端的规则，顺序就是 5'GGGCTT3'。这种在基因层面改造蛋白质的技术称为蛋白质工程。 （5）考虑到外源基因整合的方向和避免反接，基因上游也就是普通引物端需要有 EcoR I 识别序列， 基因下游也就是突变引物端需要有 No I 识别序列，即将EcoR I识别序列设计在正常引物的5'端，将Not I识别序列设计在突变引物的5'端，B正确，ACD错误。 故选B。 （6）大肠杆菌工程菌获得目的基因之后，通过转录和翻译表达出胰岛素原；大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行精细加工，所以大肠杆菌生产的胰岛素原需要人工加工。 12．（25-26高三上·广东梅县东山中学·期中）选择微生物吸收重金属是废水的处理方法之一，金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将芦苇的MT基因导入某种细菌，构建成处理重金属废水的工程菌。回答下列问题： （1）如下图所示，MT基因位于A位点和B位点之间。通过PCR扩增MT基因，根据MT基因的核苷酸序列设计了相应的四种引物，应选用的引物组合应为________。PCR扩增过程中，引物与cDNA结合的温度大约是_________。 （2）PCR扩增出的MT基因为平末端，由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助载体P才能将MT基因连接到载体E中。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如下图所示。 ①选用_______酶将载体P切开，再用DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构建重组载体P’。 ②由于载体P’不具有MT基因表达所需的_______，选用________酶组合对载体P’和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用Ca2+处理的大肠杆菌，筛选出工程菌。 （3）将普通细菌和MT工程菌分别培养在含重金属的培养液中，从个体水平检测______中的重金属含量或______中的重金属含量来判断MT工程菌是否培育成功。 【答案】（1） 引物2和引物3 50℃ （2） EcoR V 启动子和终止子 Xho I和Pst I （3） 普通细菌和MT工程菌 培养液 【解析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （1）已知MT基因位于A位点和B位点之间，而DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA单链，因此利于PCR扩增MT基因时，应选用的引物组合应为引物2和引物3。PCR扩增过程中，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，其中的复性是指：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。可见，引物与cDNA结合的温度是50℃。 （2）①PCR扩增出的MT基因为平末端，根据图中不同限制酶识别的序列和切割位点可知，需要用EcoR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P'和载体E连接，故需将MT基因插入Xho I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E. coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构建重组载体P'。 ②据图可知，载体P不含启动子和终止子，构建的载体P'是重组质粒，也不具有MT基因表达所需的启动子和终止子。为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P'和载体E均含有Xho I和Pst I酶，故可选用Xho I和Pst I酶进行酶切。将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用Ca2+处理的大肠杆菌，筛选出工程菌。 （3）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。将普通细菌和MT工程菌分别培养在含重金属的培养液中，从个体水平检测普通细菌和MT工程菌中的重金属含量或检测培养液中的重金属含量来判断MT工程菌是否培育成功。 13．（25-26高三上·广东深圳龙岗·期中）为探究叶绿体中过表达乙醇酸氧化酶（GLO）对水稻光合作用与生长的影响。科研人员将GLO与过氧化氢酶（CAT）组合，由pUbi启动子驱动，以构建基因表达载体并转入水稻中，获得叶绿体过表达株系。以实现GLO催化叶绿体中的乙醇酸生成乙醛酸，测定植株光合相关代谢物含量，来探究水稻植株叶绿体中乙醇酸被氧化为乙醛酸后是否可进一步转化为CO2，从而提升水稻的光合效率。回答下列问题： （1）为了获得叶绿体过表达株系，选用pUbi这种组成型强启动子，它的甲基化程度低，通常会_________转录。据图可知，GLO在氧化乙醇酸生成乙醛酸的同时会产生过氧化氢，而________可清除过氧化氢。 （2）为培育出转基因水稻，外植体需用________（填“50%酒精”“75%酒精”“95%酒精”）溶液消毒30s，再用无菌水冲洗。之后诱导出愈伤组织的过程称为________，该过程中主要添加________这两种植物激素并通过调整比例来调控其培育过程。收获种子后种植 T1代和T2代，使用潮霉素筛选纯合株系，意味着基因表达载体上需要有________。 （3）研究者发现水稻叶绿体自身无法催化乙醛酸生成CO2，结合图1信息，思考能否通过跨细胞器协作，将叶绿体中的乙醛酸转运至________和线粒体等具有乙醛酸代谢能力的细胞器，使乙醛酸转化为CO2后再回流至叶绿体参与________，从而弥补叶绿体代谢缺陷、提升光合固碳效率。 【答案】（1） 启动（或促进） 过氧化氢酶（或CAT） （2） 75%酒精 脱分化 生长素和细胞分裂素 潮霉素抗性基因（标记基因） （3） 过氧化物酶体 卡尔文循环（或暗反应） 【解析】1、光合作用的过程包括光反应和暗反应。光反应的物质变化包括水的光解和ATP的合成，场所是类囊体薄膜；暗反应的物质变化包括二氧化碳的固定和三碳化合物的还原，场所是叶绿体基质。 2、光呼吸是所有进行光合作用的细胞在光照和高氧、低二氧化碳情况下发生的一个生化过程。它是光合作用一个损耗能量的副反应，绿色植物在照光条件下的呼吸作用。特点是呼吸基质在被分解转化过程中虽也放出CO2，但不能产生ATP，而使光合产物被白白地耗费掉。 （1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。pUbi这种组成型强启动子甲基化程度低，通常会启动（或促进）转录。由图可知，GLO氧化乙醇酸产生乙醛酸的同时生成过氧化氢，过氧化氢酶（CAT）可清除过氧化氢。 （2）在植物组织培养中，对外植体消毒常用75%酒精溶液。诱导外植体脱分化形成愈伤组织的过程称为脱分化。植物组织培养过程中，主要添加生长素和细胞分裂素这两种植物激素来调控培育过程。使用潮霉素筛选纯合株系，说明基因表达载体上需要有潮霉素抗性基因。 （3）结合图1信息，要将叶绿体中的乙醛酸转化为CO2，可将其转运至过氧化物酶体和线粒体等具有乙醛酸代谢能力的细胞器，CO2回流至叶绿体参与卡尔文循环（或暗反应），从而弥补叶绿体代谢缺陷、提升光合固碳效率。 14．（25-26高三上·广东潮阳实验学校·期中）苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。 （1）大肠杆菌苏氨酸合成酶基因的启动子是RNA聚合酶___________的部位，驱动基因转录出mRNA。细胞中氨基酸以该mRNA为___________合成苏氨酸合成酶。 （2）当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。分别利用三种具有持续表达活性的启动子和A基因、红色荧光蛋白（RFP）基因构建表达载体并导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图。    ①该实验的目的是___________。 ②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于W的原因是___________。 （3）W-01菌株具有更高的苏氨酸产量，但其生长明显弱于菌株W和其他工程菌，从物质与能量的角度，推测原因是___________。 （4）大肠杆菌拟核中有一个环状DNA分子，其上的F基因是调控细胞分裂的主要基因，当其表达水平较低时.可产生含有多个拟核DNA的多倍体菌株，这种菌株细胞体积和细胞内基因表达产物增加。综合利用上述信息，设计一个插入W-01菌株F基因启动子与编码区之间的表达元件（如图），制备高产苏氨酸的多倍体工程菌，且该工程菌能够在含氯霉素的培养基中生长___________。    【答案】（1） 识别和结合 模板 （2） 探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响 A蛋白表达量高，苏氨酸运出速率高，菌体中苏氨酸浓度低，对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱 （3）外源基因表达及苏氨酸大量合成消耗菌体中的物质和能量 （4）①氯霉素抗性基因     ②终止子     ③活性低的启动子 【解析】基因工程的基本步骤包括筛选目的基因、基因表达载体构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中目的基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 （1）RNA聚合酶可以识别并结合大肠杆菌苏氨酸合成酶基因的启动子，驱动基因转录出mRNA。翻译的模板是mRNA，原料是氨基酸，因此细胞中氨基酸以该mRNA为模板合成苏氨酸合成酶。 （2）①图示的处理是构建了三种不同的A基因表达载体，实验结果显示不同的A基因表达载体会影响大肠杆菌菌株苏氨酸的产量，因此分析可知，该实验的目的是探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响。 ②与菌株W相比，工程菌W-01的不同点是导入了A基因，且已知A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞，因此推测工程菌W-01苏氨酸产量显著高于W的原因是A蛋白表达量高，苏氨酸运出速率高，菌体中苏氨酸浓度低，对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱。 （3）各种菌株细胞代谢产生的总能量基本相同，但W-01菌株中更多的能量用于外源基因表达及苏氨酸大量合成，而用于生长的能量较少，因此W-01菌株生长明显弱于菌株W和其他工程菌。 （4）实验目的是通过基因工程的手段制备高产苏氨酸的多倍体工程菌，只有当F基因表达水平较低时.可产生含有多个拟核DNA的多倍体菌株，因此在F基因编码区前面插入活性低的启动子，减少F基因的表达。本实验要求工程菌能够在含氯霉素的培养基中生长，因此表达元件中需要插入氯霉素抗性基因，此外基因的转录需要启动子和终止子，综合分析，①②③分别是氯霉素抗性基因、终止子、活性低的启动子。 考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（25-26高三上·广东·期中）人工智能（Artificial Intelligence，英文缩写为AI）是研究、开发用于模拟、延伸和扩展人的智能的理论、方法、技术及应用系统的一门新技术科学。利用人工智能模型（AI）预测蛋白质的结构和功能，极大地加速了人类对蛋白质的了解。下列叙述错误的是（　　） A．利用AI设计蛋白质可提高预测效率和精度 B．利用AI设计蛋白质可推动生物学和医学发展 C．AI分析氨基酸的差异不能用于进化亲缘关系比较 D．AI可能对理解疾病发生机制有一定帮助 【答案】C 【解析】A、利用AI强大的数据处理和模型预测能力，可高效模拟蛋白质结构，显著提升设计蛋白质的效率和精度，A正确； B、AI辅助的蛋白质设计能够加速新药研发、酶工程等应用，推动生物学和医学领域的技术进步，B正确； C、不同物种间同源蛋白质的氨基酸序列差异可反映进化距离，AI分析此类差异数据（如分子钟）是研究生物亲缘关系的有效手段，C错误； D、AI通过预测异常蛋白质结构或功能变异，可辅助解析蛋白质异常导致的疾病机制（如阿尔茨海默病与β-淀粉样蛋白），D正确。 故选C。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 3大高频考点 1. 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 2. 基因工程综合 3. 基因工程和蛋白质工程的应用 考点1 基因工程的基本操作程序（PCR技术及其应用） 1．（25-26高三上·广东深圳龙岗·期中）科学家利用CRISPR-Cas9技术对水稻直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子区进行定点编辑，需设计sgRNA引导Cas9蛋白切割目标DNA。实验结果发现修饰后的突变体的直链淀粉明显低于野生型，下列叙述错误的是（    ） A．sgRNA的序列需与Wx基因启动子区部分序列互补配对 B．Cas9蛋白通过切割磷酸二酯键断开DNA双链 C．启动子区编辑可能改变RNA聚合酶的结合效率 D．编辑后的Wx基因编码区碱基序列必然发生改变 2．（25-26高三上·广东金山中学·期中）温度是影响生物系统稳定性和功能的关键物理因素。无论是高温还是低温，都会对分子结构、生理过程产生影响。下列叙述正确的是（    ） A．低温不会影响酶的活性，所以一般选择低温来保存酶制剂 B．酿酒时，将发酵温度从28℃升高到40℃，有利于发酵的进行 C．处于高温环境时，哺乳动物主要通过减少流向皮肤的血液来降低体温 D．PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚和结合 3．（25-26高三上·广东深圳坪山高级中学·期中）2000-3000米水深的海底热泉喷口温度高达350-400℃，喷发大量多金属硫化物，富含多种金属。研究发现这里的嗜热硫还原菌为生产者，还有与细菌共生的没有消化系统的巨型管栖动物、管水母、腹足类和一些鱼类组成了繁荣的生态系统。下列相关叙述正确的是（　　） A．嗜热硫还原菌通过光合作用完成无机物到有机物的转化 B．从热泉口的细菌细胞提取的DNA聚合酶可用于PCR技术 C．巨型管栖动物摄入的能量一部分同化，一部分随粪便排出 D．深海热泉的物质和能量可以自给自足，不与生物圈其他生态系统交流 4．（25-26高三上·广东潮阳实验学校·期中）在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（    ） A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接 B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中 C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点 D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达 （25-26高三上·广东省肇庆市第二中学·期中）根据下述资料内容，完成下面小题： PCR扩增技术近来年被广泛的应用于基因检测。运用PCR扩增技术检测的简要步骤是：根据目的基因的序列设计PCR扩增引物，引物设计依DNA分子结构特点，要区分正向引物与反向引物，以便于确定DNA分子的复制方向。利用待检DNA为模板进行PCR扩增，再通过凝胶电泳或DNA测序技术鉴定PCR扩增产物。下列为某家系某基因正常片段与突变片段（图中数字为省略掉的碱基，正常基因与突变基因是相同）： 正常基因单链片段：5'-GCTTAGCATTCCAGATC……（293个碱基）……GATCCATGCCCAG-3" 突变基因单链片段：5'-GCTTAGCATTCCATATC……（293个碱基）……GATCCATGCCCAG-3" 为了检测该家系成员基因突变情况，医学工作者先将该家系成员的相关基因提取并进行PCR扩增，然后设计一种特殊的限制性核酸内切酶对PCR扩增产物进行酶切。对酶切结果进行凝胶电泳来判断基因突变情况。 5．在对该基因片段进行PCR扩增前，需要设计引物，现已设计了一条引物为5'-TGGGCATGGATC-3'，下列序列可作为另一条引物的是（    ） A．5'-CTTAGCATTCCA-3' B．5'-TTAGCATTCCAG-3' C．5'-TAGCATTCCAGA-3' D．5'-AGCATTCCAGAT-3' 6．科研工作者选择了某限制酶（识别序列及切割位点为，未标注的碱基部分无该酶的识别位点）。现对该家系三个孩子进行基因检测，通过提取目的基因进行PCR扩增，再用该限制酶切PCR扩增产物进行凝胶电泳，得到电泳图如下，下列叙述正确的是（    ） A．Ⅰ号个体与Ⅲ号个体都有该突变基因 B．如果该突变基因是隐性致病基因，则可以判断孩子的父母有一方一定是患病者 C．b端是电泳槽的负极 D．图中1为致病基因条带所在的位置 7．（25-26高三上·广东金山中学·期中）噬菌体表面展示技术是一种基因工程技术，通过将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使外源蛋白以融合蛋白形式表达在噬菌体表面，这种技术可用于筛选高亲和力抗体。丝状噬菌体呈细长管状，由衣壳蛋白和DNA组成，衣壳蛋白中有一类衣壳蛋白III（PIII）与噬菌体感染有关。回答下列问题： （1）研究人员将EcoRI基因和PIII基因融合进行表面展示，过程如图。首先将EcoRI基因插入PIII基因中；再将重组噬菌体DNA成功导入______________进行培养，获得子代重组噬菌体；为检测EcoRI蛋白是否成功展示在重组噬菌体表面，可采用_____________对重组噬菌体进行检测。 （2）根据噬菌体表面展示技术的目的，推测展示在噬菌体表面的EcoRI蛋白________（填“会”或“不会”）影响重组噬菌体的感染过程。为证明该推测，研究人员设计如下表实验并检测感染能力。根据以上信息，完成下列表格。 对照组1 对照组2 对照组3 实验组 野生型噬菌体 - + + - 重组噬菌体 + - - + 过量游离的EcoRI蛋白 + - + - ____的抗体 + + + + 感染能力 强 ______ 强 弱 注：“-”表示未添加，“+”表示添加 （3）抗体的结构包含VH和VL。研究人员从抗原phOx免疫的小鼠脾脏中提取mRNA，经________过程获得VH和VL的cDNA。将一系列VH和VL的cDNA随机两两组合后，插入PIII基因，构建出2×105种噬菌体克隆作为文库。从文库中选择568种噬菌体进行检测后发现，能与抗原phOx结合的噬菌体极少，若实验操作没有问题，则表明该噬菌体文库中__________________。 （4）研究人员将抗原phOx附着在特定基质上，将噬菌体文库中的噬菌体通过基质，并进行多次重复，每次重复时减少基质上抗原phOx的密度，推测多次重复的意义_____________。 8．（25-26高三上·广东惠来一中·期中）研究发现，肠道炎症可以上调宿主诱导型一氧化氮合酶的表达，从而导致一氧化氮（NO）浓度增加，NO在肠道内可被迅速转化为硝酸盐。研究人员利用对NO具有高度特异性的调控蛋白norR开发了一种对NO响应的细菌传感器。当NO与norR结合时，norR结构发生改变，并启动Pnorv启动子的转录，研究人员将fimE重组酶基因（能催化下游的DNA分子进行切割和重新连接）置于Pnorv启动子的控制下，当传感器检测到NO时，细菌从表达黄色荧光蛋白切换到表达青色荧光蛋白。该质粒图谱如图所示。回答下列问题： （1）基因工程中可通过_____法将NO响应的细菌传感器导入大肠杆菌，然后在含有_____的选择培养基上筛选成功导入NO响应的细菌传感器的大肠杆菌。根据题意分析，fimE重组酶基因调控细菌从表达黄色荧光蛋白切换到表达青色荧光蛋白的可能机制为_____。 （2）研究发现NarX蛋白可感应硝酸盐并激活NarL蛋白，激活的NarL能结合硝酸盐响应启动子，启动下游基因的表达。若要设计另一套质粒，在NO响应的细菌传感器的基础上进行改造，使改造的质粒能和NO响应的细菌传感器同时导入大肠杆菌中，实现NO和硝酸盐的双重检测。从启动子相关角度需进行的改造为_____，从荧光蛋白基因的角度，需进行的改造为将_____（填“青色”或“黄色”）荧光蛋白基因替换为其他易于区分的非黄色的荧光蛋白基因。 （3）实验小组在NO响应的细菌传感器中还引入了一个特殊的温度敏感型自杀基因，该基因可在非肠道环境中启动表达，引入该自杀基因的意义在于_____。 考点2 基因工程综合 1．（25-26高三上·广东金山中学·期中）番茄中的PG基因控制合成的多聚半乳糖醛酸酶，能破坏细胞壁使番茄软化。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，其合成的mRNA能与PG基因合成的mRNA 相结合，从而培育出抗软化的转基因番茄。下列叙述错误的是（    ） A．PG基因与抗PG基因的碱基序列不完全相同 B．利用PCR 技术可检测抗PG基因是否正常转录 C．转基因番茄可能会由于花粉扩散导致基因污染问题 D．抗PG基因通过抑制PG基因的转录使其mRNA无法合成 2．（25-26高三上·广东·期中）基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学的基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。下列关于基因工程的诞生和发展叙述错误的是（　　） A．艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验证明了DNA是遗传物质，还可推断DNA可以在同种生物的不同个体间转移 B．科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA导入受体细胞，外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世 C．桑格等科学家发明了DNA序列分析仪，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，可以在体外完成DNA的复制 D．我国科学家独创了花粉管通道法，可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中完成导入 3．（25-26高三上·广东东莞七校·期中）研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的DGAT1基因导入四尾栅藻（操作过程如下图所示），获得转基因的产油微藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题： （1）PCR 技术的原理是________，PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+原因是________________。 （2）将DGAT1基因与pBH21构建基因表达载体时，需在DGAT1基因的两端添加限制酶________________________________的识别序列。 （3）启动子往往具有物种特异性，在载体pBH21质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择__________（填“紫苏 DGAT1基因”“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。对获得的转基因四尾栅藻进行不同的分子水平检测，可采用的技术有_____________________（答出2种）。 （4）为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。 表培养转基因四尾栅藻的地热废水培养基各项指标测定结果 各项指标 总氮/（mg·L⁻¹） 总磷/（mg·L⁻¹） 氟化物/（mg·L⁻¹） 初始 23.2 4.32 4.56 培养转基因四尾栅藻 11天后 1.9 0.45 0.84 该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计：_________________。 4．（25-26高三上·广东光明区高级中学·期中）近年来复合性状逐渐成为转基因作物开发的重要特性。科研工作者通过转基因技术获得抗虫耐除草剂的转基因玉米新品种。回答下列问题： （1）设计融合基因。C1和V3是两种不同的杀虫蛋白，通过检索________获得C1和V3基因的有关信息，利用软件分析和预测，将两种蛋白的主要结构域组合形成融合蛋白，设计出融合基因cl-v3。 （2）构建表达载体。用PCR扩增c1-v3基因时，一对引物的________端分别添加限制酶XbaⅠ和SacⅠ的识别序列，使用两种而不是一种限制酶的作用是________。将c1-v3基因和耐除草剂基因bar连接到Ti质粒上。取出低温保存的农杆菌菌种划线培养，培养至长出________，验证活性后制备成菌液并导入表达载体。 （3）玉米的转化和筛选。用农杆菌菌液侵染玉米幼胚，5min后将幼胚置于灭菌的滤纸上吸去菌液，转移至添加头孢霉素和潮霉素的培养基上筛选。头孢霉素只能抑制细菌不能抑制植物细胞，添加头孢霉素的作用是________；潮霉素既能抑制细菌也能抑制植物细胞，潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA片段________（填“内”或“外”）。玉米幼胚经过________形成愈伤组织，最后获得转化植株。 （4）转基因玉米的鉴定。 ①提取转化植株的基因组DNA，以c1-v3基因和bar基因的特异区段序列为模板合成探针进行________，以________作为阳性对照，以非转基因玉米作为阴性对照，结果显示与阳性对照出现相同的________，表明目的基因成功整合到玉米基因组中。 ②进一步检测性状，可采用________处理________，根据结果筛选已成功获得转基因玉米新品种。 ③导入1个融合基因的转基因玉米绝大多数是杂合子，不能稳定遗传，可通过________方法获得纯种，也可用________技术更快获得理想品种。 ④同时导入2个或更多抗虫机制不同的针对同一害虫的抗虫基因，与导入单一抗虫基因比更能有效延缓害虫产生抗性的时间，原因是________。 5．（25-26高三上·广东广州铁一中学·期中）发酵工程离不开微生物培养，为监测、调控和利用细菌的葡萄糖代谢途径，优化目标产物的生产过程，研究者尝试通过基因工程技术构建生物传感器。将GFP（绿色荧光蛋白）基因作为报告基因，构建出基因表达载体（R），将其导入大肠杆菌。 （1）发酵工程一般包括菌种的选育、________、培养基的配制、灭菌、接种、发酵产品的分离、提纯等方面。其中________是发酵工程的中心环节。 （2）PE基因编码的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可转运葡萄糖进入大肠杆菌细胞，转运葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一种转录抑制因子。R作为生物传感器，包括启动子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作过程如图1、图2。 ①据图1、图2可知，存在葡萄糖时，葡萄糖通过E蛋白转运进入细胞中后被磷酸化，M蛋白________，PE表达的产物可使E蛋白重新磷酸化。 ②在周围环境中葡萄糖存在状态不同时，R均可监测大肠杆菌的葡萄糖摄取状态，请阐释其工作原理________。 ③在含有葡萄糖的培养基中培养转入R的大肠杆菌，分别在不同培养时间检测________和荧光强度。若结果显示二者呈正相关，则可确定该生物传感器具有检测可靠性。 （3）在工业发酵生产色氨酸过程中，研究者利用R监测大肠杆菌对葡萄糖的摄取，发现菌体摄入的葡萄糖偏多，因为代谢过程中形成了一些副产品，导致生产成本偏高。已知大肠杆菌C基因编码的蛋白C可结合启动子Pc，促进RNA聚合酶也结合Pc；当胞内葡萄糖含量较高时，C蛋白无法结合Pc，Pc无法启动下游基因转录。研究者将R的启动子P更换为启动子Pc，解决葡萄糖摄取偏多导致浪费的问题。请在表格中补充不同条件下，2个调控元件对R的精准调控过程。“+”表示相应蛋白结合、“-”表示相应蛋白脱离。 条件 Pc中c蛋白的结合序列 M蛋白的结合序列 无葡萄糖 + + 低浓度葡萄糖 ①________ ②________ 高浓度葡萄糖 ③________ ④________ 6．（25-26高三上·广东深圳·期中）英国科学家凯茜·马丁及其团队通过基因工程，成功培育出了富含花青素的紫色番茄，这引起了全球的广泛关注。马丁团队从金鱼草中提取了花青素合成的关键基因Del和Rosl。为了使Del基因和Rosl基因能够更好地表达，科研人员试图将两基因融合为Del-Rosl基因（部分过程如图1所示），从而获得活性更高的花青素合成酶。同时从拟南芥中提取了MYB12基因，该基因能促进类黄酮生物合成的黄酮醇特异性激活。当这三个基因被巧妙地引入普通番茄的基因组后，番茄仿佛被施了魔法，番茄中原本沉默的花青素合成机制被瞬间唤醒。回答下列问题： （1）PCR循环的三个步骤包括_______。PCR3过程中除原料、含Mg2+的缓冲液、PCR1和PCR2的产物外，还需要加入的物质有________。 （2）Del基因以a链为模板转录，Rosl基因以d链为模板转录，为获得Del-Rosl基因，在PCR1和PCR2过程前，在引物________和引物________的5'端添加互补序列。 （3）含MYB12基因的DNA片段中相关限制酶的酶切位点如图2所示。构建基因表达载体时不能选用HindⅢ切割MYB12基因，原因是_____________。构建Del、Rosl、MYB12三个基因的表达载体时，科研人员将三个基因串联在番茄果实的特异性启动子下游，选择该启动子的优势为_______。 （4）研究发现，番茄体内的半乳糖醛酸酶能破坏细胞壁的果胶层，从而使果实很快变软，不耐贮藏。科学家采用基因工程技术将控制半乳糖醛酸酶表达的反义基因转入番茄细胞中，从而解决了这一问题。请从基因表达的角度简要解释原因：_________。 7．（25-26高三上·广东湛江·期中）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造（如图所示），利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个插入种子休眠基因的纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。回答下列问题： （1）基因表达载体中启动子是_______识别并结合的位点，质粒作为常用的载体，其特点有_______（答出两点）。 （2）PCR扩增休眠基因X时，需在反应体系中加入适量的Mg2+，其作用是_______。PCR过程中需要控制温度条件，其中温度最低的阶段为_______。在引物的_______（填“3’端”或“5’端”）添加限制酶的识别序列。 （3）根据图示信息，切割目的基因与Ti质粒用_______限制酶酶切，以防止反向连接。将重组Ti质粒导入农杆菌时需要用Ca2+处理农杆菌，使其处于_______的生理状态。为筛选出含重组质粒的农杆菌，需在培养基中添加_______。 （4）对培养的受体细胞进行检测时，可通过_______技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上。 8．（25-26高三上·广东·期中）番茄红素是一种强效抗氧化剂，属于类胡萝卜素家族，广泛存在于番茄、西瓜等红色果蔬中。为了提升大肠杆菌中番茄红素的生物合成效率，优化合成酶的代谢通路（大肠杆菌生产番茄红素代谢途径如图a），构建番茄红素合成酶组装调控代谢体。由于三酶以上融合较困难，研究者构建了双酶组装质粒，如图b。此外构建了质粒L-4如图c。回答下列问题： （1）对大肠杆菌等微生物的基因改造在基因工程研究最早、最广泛和成果最多，其优点有_______（至少答两点）；转化前一般需先处理大肠杆菌，使其成为感受态，不直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________。 （2）将转化后的大肠杆菌感受态细胞，涂在含________的平板上进行筛选，并进行菌落PCR验证。PCR验证正确的质粒，还需进一步进行________。 （3）EcCas6e和Csy4蛋白能通过一定机制将与之融合表达的任意2个酶进行体内组装。构建好的3种质粒分别命名为L-1、L-2和L-3。其中L-1质粒中crtE蛋白与EcCas6e融合表达，crtB蛋白与Csy4蛋白融合表达，并借助EcCas6e和Csy4形成的复合体将crtE蛋白和crtB蛋白组装在一起。crtl蛋白单独游离表达；则图b中，①②③处应分别为________；依此规律L-2质粒中crtE蛋白与crtl蛋白组装在一起，crtB蛋白单独游离表达。则L-3质粒中________蛋白完成组装。 （4）将构建好的质粒L-1、L-2、L-3、L-4分别转化大肠杆菌并对番茄红素产量进行检测，实验数据如图d。构建质粒L-4的目的是________；依据实验结果可得出：_________。 9．（25-26高三上·广东省肇庆市第二中学·期中）近年来，“海水稻”已经在全球范围推广种植，为解决国际社会粮食危机作出了巨大贡献。海水稻是指能在盐（碱）浓度0.3%以上的盐碱地生长，且单产可达300kg/亩以上的一类水稻品种。对海水稻的改良有多种方案，请思考下列流程，回答问题： 普通水稻海水稻 （1）耐高盐碱细菌的筛选：育种专家发现生活在盐碱地上的微生物体内有抗盐碱基因。请从普通培养基培养得到的菌落中筛选耐高盐碱细菌并保存菌种，完成下列表格中的内容： 耐“高盐碱细菌”的筛选 步骤及项目 普通培养基 选择培养基 配制培养基 LB固体培养基 LB固体培养基+① 培养基灭菌 高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌+② 菌种来源 ③ 普通培养基上长出的菌落。 接种方案 涂布接种法 ④ 菌种保存 / ⑤ ①________  ②________  ③________  ④________  ⑤________ （2）通过基因组文库获取抗盐碱基因：将筛选得到的菌种的基因组DNA用________酶切成适当大小，分别与载体组合，导入细菌细胞，形成________，构成基因组文库。提取时，先用________酶破坏细菌细胞，经过滤、离心、提纯等操作获取DNA分子。获取抗盐碱基因后通过转基因技术改造普通水稻使其成为海水稻。 （12）1986年，广东海洋大学研究员陈日胜在湛江海边发现了第一株野生海水稻，如果你是育种工作者，请写出另一种与上述不同的育种方案：________。 （4）有人觉得海水稻的口感偏硬，这与其生长环境与所含基因均有关。科学家通过基因敲除的方法来改善口感：用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，在受体细胞中得以表达。同源重组依据DNA分子结构上的________原则。一般使用________法将重组DNA分子导入到 10．（25-26高三上·广东广州六校·期中）白细胞介素-10（IL-10）是大黄鱼先天性免疫因子之一，在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。某科研小组希望将大黄鱼IL-10基因导入到大肠杆菌，以获得IL-10，并使用纯化的IL-10免疫小鼠以获取抗血清，为IL-10的进一步研究奠定基础。 （1）实验步骤如下： ①大黄鱼IL-10基因的克隆 采集大黄鱼肝脏组织提取mRNA，_____合成cDNA，对cDNA进行PCR扩增，PCR产物先经_____检测，对目的条带切胶回收后连入载体，转化大肠杆菌，经含有抗生素的平板筛选后对阳性菌落扩大培养，经PCR扩增后进行_____得到正确的原核表达工程菌序列。 ②诱导IL-10基因表达 ③SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证IL-10基因表达。 用移液器吸取低分子量蛋白Marker和_____（诱导前、诱导后、诱导前和诱导后）收集的菌体样品10μL进行电泳，用以鉴定IL-10基因表达的结果。 ④IL-10的纯化 ⑤抗血清的制备 （2）小鼠共免疫注射三次，其中每隔一周注射一次，在第14天后，将小鼠麻醉并从心脏取血，将收集到的小鼠血液放于4℃冰箱中静置12小时，用离心机低温离心10分钟，收集_____，以获取抗血清。 免疫注射三次的原因是：_____。 （3）选择cDNA导入到大肠杆菌而不是将目的基因导入大肠杆菌的原因是_____。 （4）SDS（十二烷基硫酸钠）是一种表面活性剂，可以与蛋白质结合并使其表面带有负电荷，推测电泳中SDS的作用是_____。 （5）该科研小组发现某养殖塘大黄鱼大批死亡，并伴有鱼鳍和皮肤溃烂出血等症状，怀疑受到某种致病菌的影响，对该致病菌进行分离培养和生化鉴定。在无菌条件下，从患病濒死大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏中取样，用接种环_____接种于固体培养基上，培养24~48h分离病原菌。观察培养基上的菌落形态、荚膜染色等，最终确定该致病菌为迟缓爱德华氏菌。 （6）科研小组尝试建立常规PCR方法用以检测迟缓爱德华氏菌，根据迟缓爱德华氏菌外膜蛋白A基因设计引物；提取迟缓爱德华氏菌DNA（1．0×107CFU/mL），以该DNA作为模板，PCR扩增后出现条带。 ①验证该引物特异性的实验思路：_____，若该引物特异性良好，预测实验结果：_____。 ②灵敏度验证，提取迟缓爱德华氏菌DNA（1．0×107CFU/mL），依次梯度稀释获得1．0×107CFU/mL-1．0×101CFU/mLDNA进行PCR扩增，将PCR产物电泳，观察有无条带出现。 （7）科研小组尝试建立环介导等温扩增技术（LAMP）用来检测迟缓爱德华氏菌，LAMP是一种新型核酸扩增技术，根据靶基因的6个区域设计4条引物，利用链置换型DNA聚合酶只需在恒温条件下即可完成扩增反应，图一、图二分别为常规PCR和LAMP灵敏度验证电泳条带情况，出现电泳条带表示检测出相对浓度下的迟缓爱德华氏菌，LAMP检测灵敏度是PCR的_____倍。与PCR相比较，LAMP检测的优点是_____。 注：NC：阴性对照；1~7：分别为CFU/mL迟缓爱德华氏菌DNA 11．（25-26高三上·广东深圳坪山高级中学·期中）目前中国有几十家制药公司利用基因工程生产重组胰岛素，不同的公司采用不同的技术路线，生产出来的产品也有不同的效果。 回答下列问题： （1）生物的DNA都是由四种脱氧核苷酸聚合而成说明基因工程中______是可行的，与此相对应的则是______酶的发现使这一过程在技术上得以实现。 （2）制药公司用基因工程技术取代动物胰脏分离纯化工艺生产治疗用胰岛素的优点是______（写出两点）。 （3）如果受体细胞是大肠杆菌，则目的基因应从______（“基因组文库”或“cDNA文库中”）获取，因为______。 （4）研究表明，人胰岛素容易形成多分子聚合物，导致降血糖效果大打折扣，其根本原因是胰岛素B链基因中编码第28位脯氨酸和第29位赖氨酸的序列分别为CCC和AAG，如果B链的这两个氨基酸序列颠倒，变成第28位赖氨酸第29位脯氨酸，形成的突变型人胰岛素不容易形成多分子聚合物，注射进入糖尿病人体内之后，降血糖的效果更好。这种技术被称为定点突变技术，可以通过人工合成或者PCR的方法来实现，设计引物时，需要将突变引物中处的序列改为5'______3'，这种在基因层面改造蛋白质的技术称为______。 （5）突变基因最终需要与质粒重组才能构建表达载体。为了与质粒高效正确连接，胰岛素B链突变基因的两端应携带相应的限制性内切核酸酶识别序列，根据下图质粒图谱和突变基因上的相应序列，正确的做法是______。 A．将EcoRI识别序列设计在正常引物的3'端，将NotI识别序列设计在突变引物的3'端 B．将EcoRI识别序列设计在正常引物的5'端，将NotI识别序列设计在突变引物的5'端 C．将EcoRI识别序列设计在正常引物的5'端，将NotI识别序列设计在正常引物的3'端 D．将EcoRI识别序列设计在突变引物的5'端，将NotI识别序列设计在突变引物的3'端 （6）大肠杆菌工程菌获得目的基因之后，通过______表达出胰岛素原，胰岛素原需要经过人工加工才能得到有活性的胰岛素，这是因为______。 12．（25-26高三上·广东梅县东山中学·期中）选择微生物吸收重金属是废水的处理方法之一，金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将芦苇的MT基因导入某种细菌，构建成处理重金属废水的工程菌。回答下列问题： （1）如下图所示，MT基因位于A位点和B位点之间。通过PCR扩增MT基因，根据MT基因的核苷酸序列设计了相应的四种引物，应选用的引物组合应为________。PCR扩增过程中，引物与cDNA结合的温度大约是_________。 （2）PCR扩增出的MT基因为平末端，由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助载体P才能将MT基因连接到载体E中。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如下图所示。 ①选用_______酶将载体P切开，再用DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构建重组载体P’。 ②由于载体P’不具有MT基因表达所需的_______，选用________酶组合对载体P’和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用Ca2+处理的大肠杆菌，筛选出工程菌。 （3）将普通细菌和MT工程菌分别培养在含重金属的培养液中，从个体水平检测______中的重金属含量或______中的重金属含量来判断MT工程菌是否培育成功。 13．（25-26高三上·广东深圳龙岗·期中）为探究叶绿体中过表达乙醇酸氧化酶（GLO）对水稻光合作用与生长的影响。科研人员将GLO与过氧化氢酶（CAT）组合，由pUbi启动子驱动，以构建基因表达载体并转入水稻中，获得叶绿体过表达株系。以实现GLO催化叶绿体中的乙醇酸生成乙醛酸，测定植株光合相关代谢物含量，来探究水稻植株叶绿体中乙醇酸被氧化为乙醛酸后是否可进一步转化为CO2，从而提升水稻的光合效率。回答下列问题： （1）为了获得叶绿体过表达株系，选用pUbi这种组成型强启动子，它的甲基化程度低，通常会_________转录。据图可知，GLO在氧化乙醇酸生成乙醛酸的同时会产生过氧化氢，而________可清除过氧化氢。 （2）为培育出转基因水稻，外植体需用________（填“50%酒精”“75%酒精”“95%酒精”）溶液消毒30s，再用无菌水冲洗。之后诱导出愈伤组织的过程称为________，该过程中主要添加________这两种植物激素并通过调整比例来调控其培育过程。收获种子后种植 T1代和T2代，使用潮霉素筛选纯合株系，意味着基因表达载体上需要有________。 （3）研究者发现水稻叶绿体自身无法催化乙醛酸生成CO2，结合图1信息，思考能否通过跨细胞器协作，将叶绿体中的乙醛酸转运至________和线粒体等具有乙醛酸代谢能力的细胞器，使乙醛酸转化为CO2后再回流至叶绿体参与________，从而弥补叶绿体代谢缺陷、提升光合固碳效率。 14．（25-26高三上·广东潮阳实验学校·期中）苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。 （1）大肠杆菌苏氨酸合成酶基因的启动子是RNA聚合酶___________的部位，驱动基因转录出mRNA。细胞中氨基酸以该mRNA为___________合成苏氨酸合成酶。 （2）当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。分别利用三种具有持续表达活性的启动子和A基因、红色荧光蛋白（RFP）基因构建表达载体并导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图。    ①该实验的目的是___________。 ②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于W的原因是___________。 （3）W-01菌株具有更高的苏氨酸产量，但其生长明显弱于菌株W和其他工程菌，从物质与能量的角度，推测原因是___________。 （4）大肠杆菌拟核中有一个环状DNA分子，其上的F基因是调控细胞分裂的主要基因，当其表达水平较低时.可产生含有多个拟核DNA的多倍体菌株，这种菌株细胞体积和细胞内基因表达产物增加。综合利用上述信息，设计一个插入W-01菌株F基因启动子与编码区之间的表达元件（如图），制备高产苏氨酸的多倍体工程菌，且该工程菌能够在含氯霉素的培养基中生长___________。    考点3 基因工程和蛋白质工程的应用 1．（25-26高三上·广东·期中）人工智能（Artificial Intelligence，英文缩写为AI）是研究、开发用于模拟、延伸和扩展人的智能的理论、方法、技术及应用系统的一门新技术科学。利用人工智能模型（AI）预测蛋白质的结构和功能，极大地加速了人类对蛋白质的了解。下列叙述错误的是（　　） A．利用AI设计蛋白质可提高预测效率和精度 B．利用AI设计蛋白质可推动生物学和医学发展 C．AI分析氨基酸的差异不能用于进化亲缘关系比较 D．AI可能对理解疾病发生机制有一定帮助 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $