专题14 基因工程（期中真题汇编，天津专用）高三生物上学期

**基本信息** 聚焦基因工程核心考点，汇编天津多校期中试题，以水稻产量提升、微藻CO₂耐受等真实科研情境为载体，融合基因操作程序与安全伦理，突出实验分析与应用能力。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|2题/约10分|基因工程操作程序、生物技术安全伦理|结合载体构建（如多基因表达载体）考查基础概念| |非选择题|8题/约90分|PCR技术、限制酶选择、基因表达调控、重组质粒筛选|以微藻处理工业废气为情境，设计限制酶选择（如EcoRV与SpeI）、胞内pH与光合速率分析等层次化问题，体现科学思维与探究实践|

专题14 基因工程 考点1 基因工程的基本操作程序 1.【答案】B 2.【答案】（1）热变性和DNA半保留复制 （2）P2和P3 丙的基因型为BB，不含b基因，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物 1:1 3.【答案】（1）能量 中下部冠层光照强度弱，光反应弱；中下部通风不畅，CO2浓度低，暗反应弱 （2）随种植密度增加，甲的光穿透率和净光合速率始终高于野生型，甲净光合速率未发生显著降低 （3）缺乏亮氨酸和色氨酸、含X-gal 实验组为蓝色，对照组均为白色 （4） 4.【答案】（1）①⑤ （2）扩增重组质粒（目的基因） （3）④ ① （4）藻株b的胞内pH升高幅度较大，避免了胞质酸化，有利于微藻增殖，吸收更多CO2且藻株b总光合速率比较高；但藻株b的总光合速率小于藻株a，综合考虑胞质酸化对增殖的影响和光合速率，藻株b的吸收CO2的总量不一定高于藻株a；而且，实验只进行了2h，随之实验时间的增加，二者的胞内pH和总光合速率可能还会发生变化 （5）ABD （6）显微镜计数法 稀释涂布平板法 ②③ 5.【答案】（1）引物1和引物4 3 （2）DNA聚合 （3）XhoⅠ EcoRV ② （4）以甲苯为（唯一）碳源且高盐培养液中 甲苯含量明显低于对照组 6.【答案】（1）耐高温的 DNA 聚合酶 激活 DNA 聚合酶 （2）DNA 连接 限制酶Ⅲ （3）农杆菌中的 T-DNA 能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体 DNA 上 （含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的 T-DNA 转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上） （4）PCR 技术 抗原-抗体杂交技术 7.【答案】（1）原油污染土壤 无菌 （2）Csp45 I、Xba I 连接到两个质粒上的目的基因一致（两个重组质粒酶切后分别产生5144bp、1254bp和4768bp、1254bp，说明两个重组质粒中都有长度约为1300bp的bdlA基因） （3）（导入普通质粒的）目标菌A 在36t/h时KT2和KT5两种工程菌的生物被膜量相对值显著提高 （4）如何扩大培养、工程菌降解原油的效率、对生态环境的影响等。 8.【答案】（1）农杆菌转化 白叶枯细菌 感病 子一代性状分离比 （2）B品系中的d基因发生了碱基替换A//T→G//C，导致相应蛋白质氨基酸序列中该位置的苏氨酸替换为丙氨酸，导致蛋白结构发生变化引起其功能发生改变，导致品系B的植株产生抗病性。 D表达量降低会导致抗病，d基因表达量下降会导致抗性增强 （3）总RNA 能够促进D基因的转录，不能促进d基因的转录 （4）降低D基因的表达水平（转录和翻译），如修改感病品系中D基因的启动子的突变序列或导入D基因转录形成的mRNA的反义RNA等 9.【答案】（1）RNA聚合酶 启动子 （2）将靶标序列和供体序列结合在一起，使其在空间上相互靠近 （3）剪切和拼接 abc （4）桥接RNA基因和重组酶基因以及启动子序列 卡那霉素 考点2 生物技术的安全与伦理问题 1.【答案】B 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 2大高频考点 1. 基因工程的基本操作程序 2. 生物技术的安全与伦理问题 考点1 基因工程的基本操作程序 1．（25-26高三上·天津河西·期中）科研人员将四种酶的基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图），在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法正确的是（　　） A．导入的四种目的基因均在水稻叶绿体内进行转录和翻译 B．OsGLO1和EcCAT基因转录时以DNA不同的单链为模板 C．利用PCR技术检测EcGCL基因是否转录时，需要的酶是耐高温的DNA聚合酶 D．含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 【答案】B 【解析】A、导入的目的基因需整合到水稻核基因组中，因此转录在细胞核进行，翻译在细胞质核糖体进行，仅合成的蛋白质通过叶绿体转运肽进入叶绿体；并非在叶绿体内完成转录和翻译，A错误； B、观察载体结构：OsGLO1的启动子与EcCAT的启动子方向相反（OsGLO1启动子驱动转录的方向向左，EcCAT启动子驱动转录的方向向右）。基因转录的模板链由启动子方向决定，因此二者可以DNA的不同单链为模板进行转录，B正确； C、检测基因 “是否转录” 需检测mRNA（转录产物），需采用逆转录 PCR（RT-PCR），除耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）外，还需要逆转录酶（将mRNA逆转录为cDNA）；仅用耐高温DNA聚合酶无法完成检测，C错误； D、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，因为卡那霉素抗性基因在载体的非T-DNA区域，即使T-DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，D错误。 故选B。 2．（25-26高三上·天津益中学校·期中）某二倍体作物的叶姿势有直立叶和水平叶两类。直立叶能减少叶片间相互遮挡，更适合在高密度种植时提高群体光能利用率。为研究控制叶姿势的基因，研究者将科研基地里偶然发现的一株直立叶植株与纯合水平叶植株杂交，F1均为水平叶，F2中水平叶：直立叶=3∶1.假设控制该性状的基因为B/b．回答下列问题： （1）实验过程中研究者利用PCR技术来测定植株基因型，PCR的原理是______。 （2）研究人员设计了3种引物（P1~P3），在B基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到b基因，位置如图18I（→表示引物5’→3’方向）。取F2单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，用不同引物进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图Ⅱ-①和Ⅱ-②所示，不考虑PCR结果异常）。 ①图Ⅱ-①中使用的引物是______；丙单株无扩增条带的原因是______。 ②结合图Ⅱ-②的扩增结果，在图Ⅱ-②中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑）______。 ③将F2样本中的水平叶植株随机交配获得F3，使用图Ⅱ-①中的引物组合扩增F3全部样本，有扩增条带水平叶个体数：无扩增条带水平叶个体数=______。 【答案】（1）热变性和DNA半保留复制 （2）P2和P3 丙的基因型为BB，不含b基因，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物 1:1 【解析】基因分离定律的实质：杂合体内，等位基因在减数分裂形成配子时随同源染色体的分开而分离，进入两个不同的配子，独立的随配子遗传给后代。 （1）PCR（聚合酶链式反应）的原理是DNA热变性和DNA半保留复制。 （2）①子二代中的基因型为BB、Bb、bb，根据图示可知，B和b基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有b基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则B基因和b基因均能扩增出相应产物，只是b基因扩增的产物长度要大于B基因扩增的产物，即BB的个体扩增产物的电泳条带与bb的个体扩增产物的电泳条带不同，且Bb的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图II-①不符，若选择引物P3和P2进行扩增，则只有Bb和bb的个体中因含有b基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，而BB的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图II-①中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为BB，不含b基因，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。 ②图II-①是利用引物P3和P2扩增后电泳的结果，则图II-②是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于b基因扩增出来的产物长度大于B基因扩增的产物，因此bb（乙水平叶）、BB（丙直立叶）基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，且bb基因的个体扩增的产物电泳时形成的电泳条带距离点样孔近，而Bb（甲水平叶）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带，故乙与丙的电泳条带为： 。 ③F2中1/4BB（水平叶）、1/2Bb（水平叶）、1/4bb（直立叶）；将F2样本中的水平叶（1/3BB（水平叶）、2/3Bb（水平叶）植株随机交配（根据配子法，2/3B、1/3b）获得F3【4/9BB（水平叶）、4/9Bb（水平叶）、1/9bb（直立叶）】。使用图Ⅱ-①中的引物组合（P3和P2）扩增，由于只有含b基因的个体才能扩增出相应产物，有扩增条带水平叶（基因型为4/9Bb）个体数：无扩增条带水平叶（基因型为4/9BB）个体数=1:1。 3．（25-26高三上·天津第七中学·期中）增加种植密度是提高玉米产量的关键策略。 （1）光是植物光合作用的________来源，密植导致植株的中下部冠层光合作用强度降低的原因 是________。 （2）品系甲的上中下部叶片角度较野生型有不同程度减小，根据图1实验结果，甲更适宜密植体现在________。经鉴定品系甲的Lac1基因发生突变，Lac1是激素BRs合成的关键酶。 （3）已知RAVL1是调控叶角度的关键因子，为检测其是否能结合Lac1基因的启动子序列，构建含有下列基因组件的重组质粒： 酵母菌E自身不能合成色氨酸和亮氨酸这两种必需氨基酸。将重组质粒c和d共同导入E作为实验组，以分别导入a和b，a和d、b和c的E作为对照组。在进行转化操作时，酵母菌应接种于__________的培养基中进行筛选与鉴定。  培养后，实验组和对照组的菌落颜色分别为__________。经过后续实验，最终证明RAVL1可结合Lac1启动子并激活基因转录。 （4）密植导致玉米植株叶片角度减小。当密植时红光和远红光比率（R/FR）降低，诱导R/FR感受器PhyA含量升高。实验发现PhyA可与RAVL1结合，为探究二者之间的调控关系，将等量标记的RAVL1蛋白与不同处理的植株叶片提取液混合，24分钟后检测标记的RAVL1蛋白含量，结果如图2。 请综合上述结果，完善玉米通过叶片角度动态响应植株密度变化的机制图_______（任选一个过程，以未选择的条件为对照，在方框中以文字和箭头的形式作答）。 【答案】（1）能量 中下部冠层光照强度弱，光反应弱；中下部通风不畅，CO2浓度低，暗反应弱 （2）随种植密度增加，甲的光穿透率和净光合速率始终高于野生型，甲净光合速率未发生显著降低 （3）缺乏亮氨酸和色氨酸、含X-gal 实验组为蓝色，对照组均为白色 （4） 【解析】光合作用，通常是指绿色植物（包括藻类）吸收光能，把二氧化碳和水合成富能有机物，同时释放氧气的过程。其主要包括光反应、暗反应两个阶段，涉及光吸收、电子传递、光合磷酸化、碳同化等重要反应步骤，对实现自然界的能量转换、维持大气的碳-氧平衡具有重要意义。 （1）光合作用的本质是将光能转化为化学能，因此光是植物光合作用的能量来源。中下部冠层光照强度弱，光反应弱（光反应依赖光照，弱光导致ATP和NADPH生成不足）。中下部通风不畅，CO₂浓度低，暗反应弱（暗反应依赖CO₂固定，低CO₂抑制卡尔文循环）。 （2）根据图1实验结果分析，品系甲叶角度减小，相较于乙，中下部叶片能接收更多光照（光穿透率高），维持较高的光合速率。因此甲更适宜密植原因是随种植密度增加，甲的光穿透率和净光合速率始终高于野生型，甲净光合速率未发生显著降低。 （3）酵母菌E自身不能合成色氨酸和亮氨酸这两种必需氨基酸，重组质粒c和d分别携带亮氨酸（Leu）和色氨酸（Trp）合成基因及完整的lacZ基因，因此在进行转化操作时，酵母菌应接种于缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基中进行筛选。根据题意，鉴定lacZ基因是否表达则需在培养基添加X-gal，观察菌落颜色。实验组（c+d）中RAVL1结合Lac1启动子激活lacZ表达，分解X-gal生成蓝色产物。对照组中无法激活lacZ，菌落为白色。因此培养后，实验组和对照组的菌落颜色分别为实验组为蓝色，对照组均为白色。 （4）密植时R/FR降低（红光减少，远红光增加），PhyA作为光受体被激活，含量升高。PhyA结合RAVL1蛋白（图2显示PhyA存在时RAVL1蛋白含量下降），RAVL1降解增加，减少其对Lac1基因的激活。Lac1表达下降导致BRs合成减少，叶角度减小，适应密植环境。因此总结答案为： 4．（25-26高三上·天津第七中学·期中）微藻（如衣藻）可通过光合作用等代谢途径将CO2转化为多种有机物，可被用于处理工业废气、制备生物柴油，但高浓度CO2条件下微藻的细胞质酸化会抑制其增殖。研究人员从烟草中提取了一种能特异性转运的载体蛋白基因——PMA基因（4691bp）导入微藻细胞，以提高其对CO2的耐受度。图1展示了构建转基因微藻的部分过程，其中表示氨苄青霉素抗性基因，表示博来霉素抗性基因，氨苄青霉素对细菌有毒性，博来霉素对藻类、哺乳动物、植物有毒性。 （1）获取目的基因时，经常在引物末端引入限制酶识别序列，方便后续的DNA重组。图2所示的DNA分子经PCR扩增后应选用的限制酶为______。（编号选填） ①EcoRI5'-GAATTC-3' ②AftII5'-CTTAAG-3' ③XhoI5'-CTCGAG-3' ④BamHI5'-GGATCC-3' ⑤BglII5'-AGATCT-3' ⑥XbaI5'-TCTAGA-3' （2）图1中先将重组质粒导入大肠杆菌的目的是_________。 （3）图1中的培养基1和培养基2的成分分别为_________和_________。（编号选填） ①NH4Cl、博来霉素 ②NH4Cl、氨苄青霉素 ③牛肉膏、蛋白胨、博来霉素 ④牛肉膏、蛋白胨、氨苄青霉素 ⑤牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、博来霉素 ⑥牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、氨苄青霉素 （4）经筛选和基因鉴定后获得了a、b两个藻株，为了评估其对高浓度CO2的耐受度，科学家检测了实验开始2h时各藻株的胞内pH以及总光合速率等指标如下表。若选择藻株b作为后续工业应用的微藻，试阐明其优势与不足________。 项目 野生藻株 藻株a 藻株b 胞内pH 6.56 6.65 6.76 总光合速率/ 1.073 2.926 2.061 （5）研究人员尝试利用发酵罐培养转基因微藻来处理燃煤烟气，以评估转基因微藻工业应用的可行性。如果要设计实验所需的发酵罐，需要考虑的有_________。 A．在进气口处安装空气过滤除菌装置 B．罐体选择透光材质，并增加补光灯 C．添加搅拌器以满足转基因微藻对溶解氧的需求 D．添加温度、pH电极等以便对培养环境进行监测 （6）14天后，科研人员对罐中的微藻液进行取样，欲检测微藻的细胞数量，可采用的方法是______或______。此外，为评估微藻对燃煤烟气的转化能力，可用于检测的指标有______。（编号选填） ①O2的消耗速率 ②有机物积累速率 ③进入与排出气体中的CO2含量 【答案】（1）①⑤ （2）扩增重组质粒（目的基因） （3）④ ① （4）藻株b的胞内pH升高幅度较大，避免了胞质酸化，有利于微藻增殖，吸收更多CO2且藻株b总光合速率比较高；但藻株b的总光合速率小于藻株a，综合考虑胞质酸化对增殖的影响和光合速率，藻株b的吸收CO2的总量不一定高于藻株a；而且，实验只进行了2h，随之实验时间的增加，二者的胞内pH和总光合速率可能还会发生变化 （5）ABD （6）显微镜计数法 稀释涂布平板法 ②③ 【解析】本题以构建转基因微藻为例，考查了基因工程的操作步骤、培养基的选择、微生物的计数方法等知识点，具体内容有：1、基因工程的基本操作步骤：目的基因的获取：从基因组文库或cDNA文库筛选、PCR扩增、设计引物扩增特定基因片段等；基因表达载体的构建：将目的基因与载体用限制酶切割后，通过DNA连接酶连接；将重组DNA导入受体细胞，对于原核细胞（如大肠杆菌）：用Ca²⁺处理使其成为感受态细胞，吸收重组质粒，对于真核细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法；筛选与鉴定：抗性筛选、PCR鉴定、核酸杂交、表达产物检测。2、培养基的选择：在基因工程中，导入了重组质粒（通常带抗性基因，比如氨苄青霉素抗性）的大肠杆菌/微藻，培养基要选择含对应抗性物质的选择培养基。 3、微生物的计数方法：微生物的计数方法主要分为直接计数法（显微镜直接计数法）和间接计数法（平板菌落计数法 、稀释涂布平板法 ）。 （1） PCR扩增时从模板链的3'→5'，引物和DNA模板链复制起始端互补配对，因此扩增PMA基因时选择引物2和3，根据引物2的碱基序列可知对应的限制酶为⑤BglII，根据引物3的碱基序列可知对应的限制酶是①EcoRI。 （2） 将重组质粒导入大肠杆菌，大肠杆菌繁殖速度快，在适宜条件下能够大量增殖。在大肠杆菌增殖过程中，重组质粒会随着大肠杆菌的DNA复制而复制，从而实现重组质粒（目的基因）的扩增。 （3） 已知氨苄青霉素对细菌有毒性，而成功导入重组质粒的大肠杆菌含有氨苄青霉素抗性基因，因此利用氨苄青霉素可以筛选成功导入重组质粒的大肠杆菌，此外大肠杆菌在培养时需要氮源和碳源，即牛肉膏和蛋白胨，故培养基1的成分是④。已知博来霉素对藻类、哺乳动物、植物有毒性，而重组质粒含有博来霉素抗性基因，因此利用博来霉素可以筛选成功导入质粒的微藻，微藻是自养型生物，所需的碳源来自二氧化碳，氮源则来自NH4Cl，故培养基2的成分为①。 （4）选择藻株b作为后续工业应用的微藻有合理性。首先，藻株b的胞内pH升高幅度较大，避免了胞质酸化，有利于微藻增殖，吸收更多CO2；同时，藻株b的总光合速率比较高，能吸收更多的CO2。但是，藻株b的总光合速率小于藻株a，综合考虑胞质酸化对增殖的影响和光合速率，藻株b的吸收CO2，的总量不一定高于藻株a；而且，实验只进行了2h，随之实验时间的增加，二者的胞内pH和总光合速率可能还会发生变化。 （5）A、发酵需防止杂菌污染，进气口安装空气过滤除菌装置可过滤空气中杂菌，A正确； B、如果发酵的是转基因微藻，微藻进行光合作用需要光，罐体选择透光材质并增加补光灯可以为微藻的光合作用提供充足的光照条件，B正确； C、微藻是自养型生物，其能量来源主要是光合作用，而不是通过搅拌来满足对溶解氧的需求（搅拌一般用于异养型微生物发酵时增加溶氧等作用），C错误； D、温度、pH会影响微生物生长代谢，添加温度、pH电极等以便对培养环境进行监测，能够 及时调整培养条件，保证发酵的顺利进行，D正确。 故选ABD。 （6） 检测微藻的细胞数量可采用的方法是血细胞计数板计数法或稀释涂布平板法。评估微藻对燃煤烟气的转化能力，可检测的指标有②有机物积累速率，反映微藻将CO₂转化为有机物的能力；③进入与排出气体中的CO₂含量，直接体现微藻对CO₂的吸收转化情况。而O₂的消耗速率与微藻对 CO₂的转化能力无关。 5．（25-26高三上·天津河西·期中）科学家从富含甲苯的污水中筛选出能高效分解甲苯的菌株M，克隆其相关分解酶基因X，并将此基因导入有高盐需求的需纳弧菌，用于治理海洋污染。回答下列问题。 （1）获取目的基因X：由于基因X含部分未知序列，科学家利用已知同源序列设计引物，通过反向PCR扩增两侧未知序列，后续通过测序和进一步实验获取X基因全长序列。反向PCR过程如图甲，据此回答：过程③应选用的一对引物为_________；获得双链等长的目标产物至少需扩增________轮。    （2）构建重组质粒：载体质粒和由（1）获得的基因X部分信息如图乙，据此设计方案：先用EcoRV对基因X两端进行完全酶切；再用EcoRV和SpeI对载体质粒进行完全酶切，并用_________酶将质粒的黏性末端补平；最后将酶切后包含基因X的片段与酶切并补平的质粒进行连接，获得重组质粒。 （3）筛选含正向连接质粒的受体菌：为检测连接方向，将导入重组质粒的需纳弧菌接种到含有卡那霉素的固体培养基，一段时间后挑取单菌落扩大培养并分别提取质粒，再选用限制酶________和________对质粒进行完全酶切，取酶切产物进行电泳。由图乙电泳结果可知，_______号样品来自正向连接质粒。    （4）重组受体菌的效能验证：将等量的野生型需纳弧菌（对照组）和含正向连接质粒的重组需纳弧菌（实验组）接种到_________的液体培养基中，在相同条件下培养并定期检测相关指标。若实验组_________，则表明重组菌株能高效发挥作用。 【答案】（1）引物1和引物4 3 （2）DNA聚合 （3）XhoⅠ EcoRV ② （4）以甲苯为（唯一）碳源且高盐培养液中 甲苯含量明显低于对照组 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）反向PCR是扩增已知序列两侧的未知序列，需要根据已知同源序列设计引物，从图甲可知，引物1和引物4能结合到模板链上，从而扩增出两侧未知序列，所以应选用引物1和引物4。 PCR扩增时，第一轮得到的是两条链不等长的产物，第二轮得到的产物中部分是不等长的，第三轮才能得到双链等长的目标产物，所以至少需扩增3轮。 （2）用EcoRV和SpeI对载体质粒进行完全酶切后，载体质粒会产生黏性末端，要将黏性末端补平，需要用DNA聚合酶，它可以催化DNA链的延伸，从而将黏性末端补成平末端，以便后续与酶切后包含基因X的平末端片段连接。 （3）要检测连接方向，需要选择能识别特定序列且在正向连接和反向连接中酶切结果不同的限制酶。从图乙可知，选用XhoI和EcoRV对质粒进行完全酶切。根据图乙中基因X的结构和酶切位点，正向连接时，酶切后得到的片段大小与反向连接不同。电泳结果中，②号样品的条带符合正向连接质粒酶切后的片段大小，所以②号样品来自正向连接质粒。 （4）要验证重组菌能否高效分解甲苯，需要将重组菌和野生型菌接种到以甲苯为（唯一）碳源且高盐的液体培养基中（因为需纳弧菌有高盐需求，且要以甲苯为碳源来检测分解能力）。 若实验组（含正向连接质粒的重组需纳弧菌）培养液中甲苯含量明显低于对照组（野生型需纳弧菌），说明重组菌能高效分解甲苯，从而表明重组菌能高效发挥作用。 6．（25-26高三上·天津第五十五中学·期中）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因 afp 整合到土壤农杆菌的 Ti 质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。所用农杆菌的 Ti 质粒的结构如图所示，其中 Vir 区的基因活化能促进 T-DNA 的加工和转移，回答下列问题: （1）利用 PCR 可以快速扩增抗冻蛋白基因 afp，PCR 反应需要提供 DNA 模板、引物、脱氧核苷酸和__________，需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中 Mg²⁺的作用是________________。 （2）构建含有 afp 基因的 Ti 质粒需要限制酶和_______________酶。根据图中农杆菌的 Ti 质粒的结构，为提高农杆菌的转化效率，构建重组质粒应选择的限制酶是_______________。 （3）采用农杆菌转化法能将 afp 基因导入番茄细胞利用了农杆菌的特点是______________。 （4）为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有____________和__________。 【答案】（1）耐高温的 DNA 聚合酶 激活 DNA 聚合酶 （2）DNA 连接 限制酶Ⅲ （3）农杆菌中的 T-DNA 能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体 DNA 上 （含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的 T-DNA 转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上） （4）PCR 技术 抗原-抗体杂交技术 【解析】基因工程基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 （1）PCR反应需要提供DNA模板、2 种引物、4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中Mg²⁺的作用是激活DNA聚合酶。 （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶和DNA连接酶。构建重组质粒，应选择的限制酶是限制酶Ⅲ，使用限制酶Ⅰ会破坏标记基因（四环素抗性基因），使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区活化基因。 （3）农杆菌的特点是T-DNA能转移到番茄细胞内，并整合到其染色体DNA上 （含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞并将其整合到该细胞的染色体上）。 （4）为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有通过PCR技术检测番茄细胞的染色体DNA上是否插入了含基因afp的T-DNA，或检测基因afp是否转录出mRNA，利用抗原-抗体杂交技术检测基因afp是否翻译出抗冻蛋白。 7．（25-26高三上·天津南开·期中）自然界中某些细菌可通过代谢将原油转化为稳定无害的终产物，科学家为获得能有效修复原油污染土壤的工程菌展开相关研究。 （1）获得能降解原油的目标菌可从_____取样，样品经_____水稀释后涂布于以原油为唯一碳源的固体培养基上培养，分离纯化后获得目标菌A。 （2）假单胞菌遭受环境压力时，会分泌大量胞外复合物将自身包裹于其中形成细菌聚集膜样物（生物被膜）。目标菌A成膜性差，不能有效控制原油向深层土壤渗透。研究人员将假单胞菌的bdlA基因（约1300bp）导入目标菌A体内，尝试构建成膜性好的工程菌。 图1为bdlA基因与pX系列质粒连接构建的重组质粒模式图，为确认是否获得重组DNA分子，可选用限制酶_______对其切割，并对酶切产物及重组质粒进行凝胶电泳检测，结果如图2。据图可初步判断重组质粒构建成功，依据是______。 （3）上述方法获得的两种工程菌命名为KT2和KT5，在不同时间测定实验组中工程菌及对照组中______的生物被膜总量相对值，结果如图3所示。该结果表明________。 （4）若要将以上工程菌用于原油污染土壤的修复，举一例说明下一步还应进行哪些方面的研究______。 【答案】（1）原油污染土壤 无菌 （2）Csp45 I、Xba I 连接到两个质粒上的目的基因一致（两个重组质粒酶切后分别产生5144bp、1254bp和4768bp、1254bp，说明两个重组质粒中都有长度约为1300bp的bdlA基因） （3）（导入普通质粒的）目标菌A 在36t/h时KT2和KT5两种工程菌的生物被膜量相对值显著提高 （4）如何扩大培养、工程菌降解原油的效率、对生态环境的影响等。 【解析】分析图1：图1为bdIA基因与pX系列质粒连接构建的重组质粒模式图，根据目的基因（bdIA基因）两侧的限制酶分布可知，构建基因表达载体时，使用的限制酶是Csp45 I、Xba I。分子图2：图片右边M是Marker，标记大小的；1、2号泳道是两个质粒全长；3、4号泳道是酶切后目的基因和质粒的大小。分析图3：在36t/h时KT2和KT5两种工程菌的生物被膜量相对值显著提高。 （1）能降解原油的目标菌生活在富含原油的环境中，因此获得能降解原油的目标菌可从被原油污染的土壤取样，为避免杂菌污染，样品需经无菌水稀释后涂布于以原油为唯一碳源的固体培养基上培养，分离纯化后获得目标菌A。 （2）两种重组质粒含有的目的基因应该一致，根据图1中限制酶的作用位点，为确认是否获得重组DNA分子，可选用限制酶Csp45 I、Xba I对其切割，看切下的目的基因是否一致，初步判断重组质粒构建是否成功，从图2可知，连接到两个质粒上的目的基因一致（两个重组质粒酶切后分别产生5144bp、1254bp和4768bp、1254bp，说明两个重组质粒中都有长度约为1300bp的bdlA基因），所以据图可初步判断重组质粒构建成功。 （3）实验的自变量是工程菌的种类和时间，因变量是生物被膜总量相对值，所以在不同时间测定实验组中工程菌及对照组中（导入普通质粒的）目标菌A的生物被膜总量相对值。由图3可知，导入bdlA基因的工程菌（KT2和KT5）形成的生物被膜总量均高于对照组，且在一定的时间范围内，随着时间的延长，生物被膜总量越高，KT5形成的生物被膜总量与KT2形成的生物被膜总量有显著性差异，因此该结果表明在36t/h时KT2和KT5两种工程菌的生物被膜量相对值显著提高。 （4）若要将以上工程菌用于原油污染土壤的修复，下一步还应进行许多研究，如：如何扩大培养工程菌、工程菌降解原油的效率、对生态环境的影响等。 8．（25-26高三上·天津耀华中学·期中）白叶枯细菌可导致水稻籽粒重量降低、减产，研究水稻的抗白叶枯病基因及其机理具有重要意义。 （1）水稻A品系感病，B品系抗病，两者只有极少数基因存在差异，研究者将从A品种中获得的基因D连接到Ti质粒中，用_____法将D基因转入到B品系中。检测发现有30株转入成功的突变体，表型均为感病。将其中的4个突变株自交，向其子一代接种_____，检测感病情况并统计，结果如下表。 突变株1的子一代 突变株2的子一代 突变株3的子一代 突变株4的子一代 总数 14 19 40 15 感病株数 11 13 28 12 抗病株数 3 6 12 3 据表中结果可知，_____是显性性状，根据4个突变株的_____可以推测控制该性状的基因遵循基因的分离定律。 （2）为研究D/d基因与水稻抗病的关系，研究者通过序列对比，在B品系中发现了与D基因序列非常相似的基因d，两基因在编码区和非编码区均存在差异。 ①D基因编码区中一个碱基对的替换造成该基因编码的氨基酸由丙氨酸（密码子为GCU、GCC、GCA、GCG）变为苏氨酸（密码子为ACU、ACC、ACA、ACG）。据此可以推测B品系产生抗病性的原因可能是_____。 ②科研人员使用RNA干扰技术减少D、d基因的翻译。使用RNA干扰后，A品系植株表型由感病变为抗病，B品系植株抗病性进一步增强。由此可知，D/d基因与抗病性的关系为_____。 （3）为进一步确定白叶枯细菌和D/d基因表达调控的关系，科研人员对A、B两品系分别接种白叶枯细菌，然后提取它们的_____，经逆转录合成cDNA片段。以cDNA片段为模板，分别用D、d基因的特异性引物进行PCR，结果见下图所示。对照组除未接种病菌外其他处理与实验组相同。由图可知白叶枯细菌_____。 （4）综合上述研究结果，请你提出一种水稻白叶枯病的防治思路。_____ 【答案】（1）农杆菌转化 白叶枯细菌 感病 子一代性状分离比 （2）B品系中的d基因发生了碱基替换A//T→G//C，导致相应蛋白质氨基酸序列中该位置的苏氨酸替换为丙氨酸，导致蛋白结构发生变化引起其功能发生改变，导致品系B的植株产生抗病性。 D表达量降低会导致抗病，d基因表达量下降会导致抗性增强 （3）总RNA 能够促进D基因的转录，不能促进d基因的转录 （4）降低D基因的表达水平（转录和翻译），如修改感病品系中D基因的启动子的突变序列或导入D基因转录形成的mRNA的反义RNA等 【解析】基因表达产物通常是蛋白质；基因表达包括转录和翻译；转录过程由RNA聚合酶进行，以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对的原则，合成相对应的RNA分子，翻译过程是以信使RNA（mRNA）为模板，指导合成蛋白质的过程。 （1）用农杆菌转化法可以将含D基因的重组质粒转入到B品系中。将其中的4个突变株自交，向其子一代接种白叶枯细菌，检测感病情况并统计，观察子代的感病情况推测4个突变株的基因型。由表中结果可知，突变株为感病，子代却有抗病，因此感病是显性性状。根据上述4个突变株的子一代性状分离比可以推测亲本产生配子过程中发生了等位基因的分离，控制该性状的基因遵循分离定律。 （2）①B品系中的d基因发生了碱基替换A//T→G//C，导致相应蛋白质的氨基酸序列中该位置的苏氨酸替换为丙氨酸，从而导致蛋白结构发生变化，进而引起蛋白功能发生改变，导致品系B的植株产生抗病性。 ②使用了RNA干扰技术来减少D、d基因的翻译。使用RNA干扰后，发现A品系（含D基因）植株表型由感病变为抗病，B品系（含d基因）的植株抗性进一步增强。说明D表达量降低会导致抗病，d基因表达量下降会导致抗性增强。 （3）逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，因此提取了它们的总RNA，经逆转录合成cDNA片段。由图可知接种白叶枯细菌的A品系的PCR循环次数减少，而B品系的不变，可知接种白叶枯细菌的A品系的RNA含量较多，而B品系的RNA含量与对照组相同。由此可知，白叶枯细菌能够促进D基因的转录；白叶枯细菌不能促进d基因的转录。 （4）白叶枯细菌能够促进D基因的转录，可以这样防治水稻白叶枯病，降低D基因的表达水平（转录和翻译），如修改感病品系中D基因的启动子的突变序列或导入D基因转录形成的mRNA的反义RNA。 【点睛】本题主要考查学生对基因表达的原理及调控的理解，要求学生有一定的处理信息及分析问题的能力。 9．（25-26高三上·天津一中·期中）科研人员新近发现一种更加精准有效的用于基因组编辑的工具——桥接RNA 。S基因能编码重组酶，但其发挥作用的过程中，需要一段特殊的RNA参与，这一段特殊的RNA由S 基因上游的非编码区转录而来。这段RNA发生折叠，在空间上形成三个茎环，其中第二、三茎环中间各自形成一个大的泡状结构，如图1，第二茎环与可插入目标片段的靶标序列结合，其中上半链和下半链分别有一部分与靶标序列的左侧和右侧序列结合。第三茎环与含有目标片段的供体序列结合，其中上半链和下半链分别有一部分与供体序列的左侧和右侧序列结合。第二、三茎环将靶标序列和供体 序列结合在一起，使其在空间上相互靠近，所以称其为桥接RNA，再与重组酶结合形成图2所示的复合物。重组酶可以识别并切割靶标序列和供体序列的特定部位，将供体序列中的目标片段插入到靶标序列中，形成基因重组片段，如图3。科研人员还可以对桥接RNA的第二、三茎环进行人工设计，用以结合和重组不同的DNA片段，突破了以往基因编辑中目标片段大小的限制，为基因组设计敞开新的大门。 （1）控制重组酶和桥接RNA 合成的DNA上有______结合位点，从而实现桥接RNA与重组酶的形成。该位点为______。 （2）结合题干信息，桥接RNA的主要功能为______。 （3）分析图1图2可知，重组酶可以对靶标序列和供体序列的特定部位进行______，以形成基因重组片段，依据该作用，重组酶还可以完成下图所示的______操作（填字母）。 （4）科研人员发现大肠杆菌中质粒B上的卡那霉素抗性基因不能表达，欲用文中的工具向质粒B中插入启动子，实验流程为：向大肠杆菌中转入一人为构建的质粒，其应包含______→将该质粒转入大肠杆菌→使用含有______的培养基筛选 → 获取基因编辑成功的菌株。 【答案】（1）RNA聚合酶 启动子 （2）将靶标序列和供体序列结合在一起，使其在空间上相互靠近 （3）剪切和拼接 abc （4）桥接RNA基因和重组酶基因以及启动子序列 卡那霉素 【解析】RNA的合成需要RNA聚合酶的催化，而RNA聚合酶结合在DNA的特定部位（启动子）才能启动转录过程。 （1）RNA的合成需要RNA聚合酶的催化，而RNA聚合酶结合在DNA的特定部位（启动子）才能启动转录过程，所以控制重组酶和桥接RNA合成的DNA上有RNA聚合酶结合位点。RNA聚合酶结合位点是启动子，它是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA 。 （2）由题干 “第二茎环与可插入目标片段的靶标序列结合，第三茎环与含有目标片段的供体序列结合，第二、三茎环将靶标序列和供体序列结合在一起，使其在空间上相互靠近” 可知，桥接RNA的主要功能为将靶标序列和供体序列结合在一起，使其在空间上相互靠近。 （3）分析图1、图2可知，重组酶可以对靶标序列和供体序列的特定部位进行剪切和拼接，以形成基因重组片段，依据该作用，重组酶还可以完成a（剪切目的基因和载体，并进行拼接）、b（剪切目的基因、环化）、c（反向连接）这三种操作。 （4）要向质粒B中插入启动子，转入的另一质粒应包含桥接RNA基因和重组酶基因以及启动子序列，这样才能表达出桥接RNA和重组酶，从而利用重组酶-桥接RNA复合物将启动子插入到质粒B中。因为要筛选出基因编辑成功的菌株，而基因编辑成功的菌株会因为获得了启动子而使卡那霉素抗性基因表达，具有卡那霉素抗性，所以使用含有卡那霉素的培养基筛选，能在该培养基上生长的即为基因编辑成功的菌株。 考点2 生物技术的安全与伦理问题 1．（25-26高三上·天津南开·期中）基因工程产物可能存在着一些安全性问题，但不必担心（    ） A．运载体的标记基因（如抗生素基因）可能指导合成有利于抗性进化的产物 B．三倍体转基因鲤鱼与正常鲤鱼的杂交后代生存能力极强，进而导致自然种群被淘汰 C．目的基因（如杀虫基因）本身编码的产物可能会对人体产生毒性 D．转基因生物体释放到环境中，可能会对生物多样性构成危害 【答案】B 【解析】1、转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。 2、生物安全问题：①转基因植物扩散到种植区外变成野生种或杂草；②转基因植物竞争能力强，可能成为“入侵的外来物种”；③转基因植物的外源基因与细菌或病毒杂交，重组出有害的病原体；④可能使杂草成为有抗除草剂基因的“超级杂草”。 A、运载体的标记基因（如抗生素基因）可能指导合成有利于抗性进化的产物，如抗除草剂的杂草，需要担心，A错误； B、三倍体转基因鲤鱼不能产生可育配子，不能与正常鲤鱼杂交，所以不必担心自然种群被淘汰，B正确； C、目的基因（如杀虫基因）本身编码的产物可能会对人体产生毒性，需要担心，C错误； D、目的基因通过花粉的散布转移到其他植物体内，造成基因污染，从而可能打破生态平衡，需要担心，D错误。 故选B。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 2大高频考点 1. 基因工程的基本操作程序 2. 生物技术的安全与伦理问题 考点1 基因工程的基本操作程序 1．（25-26高三上·天津河西·期中）科研人员将四种酶的基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图），在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法正确的是（　　） A．导入的四种目的基因均在水稻叶绿体内进行转录和翻译 B．OsGLO1和EcCAT基因转录时以DNA不同的单链为模板 C．利用PCR技术检测EcGCL基因是否转录时，需要的酶是耐高温的DNA聚合酶 D．含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 2．（25-26高三上·天津益中学校·期中）某二倍体作物的叶姿势有直立叶和水平叶两类。直立叶能减少叶片间相互遮挡，更适合在高密度种植时提高群体光能利用率。为研究控制叶姿势的基因，研究者将科研基地里偶然发现的一株直立叶植株与纯合水平叶植株杂交，F1均为水平叶，F2中水平叶：直立叶=3∶1.假设控制该性状的基因为B/b．回答下列问题： （1）实验过程中研究者利用PCR技术来测定植株基因型，PCR的原理是______。 （2）研究人员设计了3种引物（P1~P3），在B基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到b基因，位置如图18I（→表示引物5’→3’方向）。取F2单株（甲、乙、丙）的DNA为模板，用不同引物进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图Ⅱ-①和Ⅱ-②所示，不考虑PCR结果异常）。 ①图Ⅱ-①中使用的引物是______；丙单株无扩增条带的原因是______。 ②结合图Ⅱ-②的扩增结果，在图Ⅱ-②中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑）______。 ③将F2样本中的水平叶植株随机交配获得F3，使用图Ⅱ-①中的引物组合扩增F3全部样本，有扩增条带水平叶个体数：无扩增条带水平叶个体数=______。 3．（25-26高三上·天津第七中学·期中）增加种植密度是提高玉米产量的关键策略。 （1）光是植物光合作用的________来源，密植导致植株的中下部冠层光合作用强度降低的原因 是________。 （2）品系甲的上中下部叶片角度较野生型有不同程度减小，根据图1实验结果，甲更适宜密植体现在________。经鉴定品系甲的Lac1基因发生突变，Lac1是激素BRs合成的关键酶。 （3）已知RAVL1是调控叶角度的关键因子，为检测其是否能结合Lac1基因的启动子序列，构建含有下列基因组件的重组质粒： 酵母菌E自身不能合成色氨酸和亮氨酸这两种必需氨基酸。将重组质粒c和d共同导入E作为实验组，以分别导入a和b，a和d、b和c的E作为对照组。在进行转化操作时，酵母菌应接种于__________的培养基中进行筛选与鉴定。  培养后，实验组和对照组的菌落颜色分别为__________。经过后续实验，最终证明RAVL1可结合Lac1启动子并激活基因转录。 （4）密植导致玉米植株叶片角度减小。当密植时红光和远红光比率（R/FR）降低，诱导R/FR感受器PhyA含量升高。实验发现PhyA可与RAVL1结合，为探究二者之间的调控关系，将等量标记的RAVL1蛋白与不同处理的植株叶片提取液混合，24分钟后检测标记的RAVL1蛋白含量，结果如图2。 请综合上述结果，完善玉米通过叶片角度动态响应植株密度变化的机制图_______（任选一个过程，以未选择的条件为对照，在方框中以文字和箭头的形式作答）。 4．（25-26高三上·天津第七中学·期中）微藻（如衣藻）可通过光合作用等代谢途径将CO2转化为多种有机物，可被用于处理工业废气、制备生物柴油，但高浓度CO2条件下微藻的细胞质酸化会抑制其增殖。研究人员从烟草中提取了一种能特异性转运的载体蛋白基因——PMA基因（4691bp）导入微藻细胞，以提高其对CO2的耐受度。图1展示了构建转基因微藻的部分过程，其中表示氨苄青霉素抗性基因，表示博来霉素抗性基因，氨苄青霉素对细菌有毒性，博来霉素对藻类、哺乳动物、植物有毒性。 （1）获取目的基因时，经常在引物末端引入限制酶识别序列，方便后续的DNA重组。图2所示的DNA分子经PCR扩增后应选用的限制酶为______。（编号选填） ①EcoRI5'-GAATTC-3' ②AftII5'-CTTAAG-3' ③XhoI5'-CTCGAG-3' ④BamHI5'-GGATCC-3' ⑤BglII5'-AGATCT-3' ⑥XbaI5'-TCTAGA-3' （2）图1中先将重组质粒导入大肠杆菌的目的是_________。 （3）图1中的培养基1和培养基2的成分分别为_________和_________。（编号选填） ①NH4Cl、博来霉素 ②NH4Cl、氨苄青霉素 ③牛肉膏、蛋白胨、博来霉素 ④牛肉膏、蛋白胨、氨苄青霉素 ⑤牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、博来霉素 ⑥牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、氨苄青霉素 （4）经筛选和基因鉴定后获得了a、b两个藻株，为了评估其对高浓度CO2的耐受度，科学家检测了实验开始2h时各藻株的胞内pH以及总光合速率等指标如下表。若选择藻株b作为后续工业应用的微藻，试阐明其优势与不足________。 项目 野生藻株 藻株a 藻株b 胞内pH 6.56 6.65 6.76 总光合速率/ 1.073 2.926 2.061 （5）研究人员尝试利用发酵罐培养转基因微藻来处理燃煤烟气，以评估转基因微藻工业应用的可行性。如果要设计实验所需的发酵罐，需要考虑的有_________。 A．在进气口处安装空气过滤除菌装置 B．罐体选择透光材质，并增加补光灯 C．添加搅拌器以满足转基因微藻对溶解氧的需求 D．添加温度、pH电极等以便对培养环境进行监测 （6）14天后，科研人员对罐中的微藻液进行取样，欲检测微藻的细胞数量，可采用的方法是______或______。此外，为评估微藻对燃煤烟气的转化能力，可用于检测的指标有______。（编号选填） ①O2的消耗速率 ②有机物积累速率 ③进入与排出气体中的CO2含量 5．（25-26高三上·天津河西·期中）科学家从富含甲苯的污水中筛选出能高效分解甲苯的菌株M，克隆其相关分解酶基因X，并将此基因导入有高盐需求的需纳弧菌，用于治理海洋污染。回答下列问题。 （1）获取目的基因X：由于基因X含部分未知序列，科学家利用已知同源序列设计引物，通过反向PCR扩增两侧未知序列，后续通过测序和进一步实验获取X基因全长序列。反向PCR过程如图甲，据此回答：过程③应选用的一对引物为_________；获得双链等长的目标产物至少需扩增________轮。    （2）构建重组质粒：载体质粒和由（1）获得的基因X部分信息如图乙，据此设计方案：先用EcoRV对基因X两端进行完全酶切；再用EcoRV和SpeI对载体质粒进行完全酶切，并用_________酶将质粒的黏性末端补平；最后将酶切后包含基因X的片段与酶切并补平的质粒进行连接，获得重组质粒。 （3）筛选含正向连接质粒的受体菌：为检测连接方向，将导入重组质粒的需纳弧菌接种到含有卡那霉素的固体培养基，一段时间后挑取单菌落扩大培养并分别提取质粒，再选用限制酶________和________对质粒进行完全酶切，取酶切产物进行电泳。由图乙电泳结果可知，_______号样品来自正向连接质粒。    （4）重组受体菌的效能验证：将等量的野生型需纳弧菌（对照组）和含正向连接质粒的重组需纳弧菌（实验组）接种到_________的液体培养基中，在相同条件下培养并定期检测相关指标。若实验组_________，则表明重组菌株能高效发挥作用。 6．（25-26高三上·天津第五十五中学·期中）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因 afp 整合到土壤农杆菌的 Ti 质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。所用农杆菌的 Ti 质粒的结构如图所示，其中 Vir 区的基因活化能促进 T-DNA 的加工和转移，回答下列问题: （1）利用 PCR 可以快速扩增抗冻蛋白基因 afp，PCR 反应需要提供 DNA 模板、引物、脱氧核苷酸和__________，需要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中 Mg²⁺的作用是________________。 （2）构建含有 afp 基因的 Ti 质粒需要限制酶和_______________酶。根据图中农杆菌的 Ti 质粒的结构，为提高农杆菌的转化效率，构建重组质粒应选择的限制酶是_______________。 （3）采用农杆菌转化法能将 afp 基因导入番茄细胞利用了农杆菌的特点是______________。 （4）为检测抗冻的番茄培育是否成功，首先进行分子水平的检测，所采用的生物技术有____________和__________。 7．（25-26高三上·天津南开·期中）自然界中某些细菌可通过代谢将原油转化为稳定无害的终产物，科学家为获得能有效修复原油污染土壤的工程菌展开相关研究。 （1）获得能降解原油的目标菌可从_____取样，样品经_____水稀释后涂布于以原油为唯一碳源的固体培养基上培养，分离纯化后获得目标菌A。 （2）假单胞菌遭受环境压力时，会分泌大量胞外复合物将自身包裹于其中形成细菌聚集膜样物（生物被膜）。目标菌A成膜性差，不能有效控制原油向深层土壤渗透。研究人员将假单胞菌的bdlA基因（约1300bp）导入目标菌A体内，尝试构建成膜性好的工程菌。 图1为bdlA基因与pX系列质粒连接构建的重组质粒模式图，为确认是否获得重组DNA分子，可选用限制酶_______对其切割，并对酶切产物及重组质粒进行凝胶电泳检测，结果如图2。据图可初步判断重组质粒构建成功，依据是______。 （3）上述方法获得的两种工程菌命名为KT2和KT5，在不同时间测定实验组中工程菌及对照组中______的生物被膜总量相对值，结果如图3所示。该结果表明________。 （4）若要将以上工程菌用于原油污染土壤的修复，举一例说明下一步还应进行哪些方面的研究______。 8．（25-26高三上·天津耀华中学·期中）白叶枯细菌可导致水稻籽粒重量降低、减产，研究水稻的抗白叶枯病基因及其机理具有重要意义。 （1）水稻A品系感病，B品系抗病，两者只有极少数基因存在差异，研究者将从A品种中获得的基因D连接到Ti质粒中，用_____法将D基因转入到B品系中。检测发现有30株转入成功的突变体，表型均为感病。将其中的4个突变株自交，向其子一代接种_____，检测感病情况并统计，结果如下表。 突变株1的子一代 突变株2的子一代 突变株3的子一代 突变株4的子一代 总数 14 19 40 15 感病株数 11 13 28 12 抗病株数 3 6 12 3 据表中结果可知，_____是显性性状，根据4个突变株的_____可以推测控制该性状的基因遵循基因的分离定律。 （2）为研究D/d基因与水稻抗病的关系，研究者通过序列对比，在B品系中发现了与D基因序列非常相似的基因d，两基因在编码区和非编码区均存在差异。 ①D基因编码区中一个碱基对的替换造成该基因编码的氨基酸由丙氨酸（密码子为GCU、GCC、GCA、GCG）变为苏氨酸（密码子为ACU、ACC、ACA、ACG）。据此可以推测B品系产生抗病性的原因可能是_____。 ②科研人员使用RNA干扰技术减少D、d基因的翻译。使用RNA干扰后，A品系植株表型由感病变为抗病，B品系植株抗病性进一步增强。由此可知，D/d基因与抗病性的关系为_____。 （3）为进一步确定白叶枯细菌和D/d基因表达调控的关系，科研人员对A、B两品系分别接种白叶枯细菌，然后提取它们的_____，经逆转录合成cDNA片段。以cDNA片段为模板，分别用D、d基因的特异性引物进行PCR，结果见下图所示。对照组除未接种病菌外其他处理与实验组相同。由图可知白叶枯细菌_____。 （4）综合上述研究结果，请你提出一种水稻白叶枯病的防治思路。_____ 9．（25-26高三上·天津一中·期中）科研人员新近发现一种更加精准有效的用于基因组编辑的工具——桥接RNA 。S基因能编码重组酶，但其发挥作用的过程中，需要一段特殊的RNA参与，这一段特殊的RNA由S 基因上游的非编码区转录而来。这段RNA发生折叠，在空间上形成三个茎环，其中第二、三茎环中间各自形成一个大的泡状结构，如图1，第二茎环与可插入目标片段的靶标序列结合，其中上半链和下半链分别有一部分与靶标序列的左侧和右侧序列结合。第三茎环与含有目标片段的供体序列结合，其中上半链和下半链分别有一部分与供体序列的左侧和右侧序列结合。第二、三茎环将靶标序列和供体 序列结合在一起，使其在空间上相互靠近，所以称其为桥接RNA，再与重组酶结合形成图2所示的复合物。重组酶可以识别并切割靶标序列和供体序列的特定部位，将供体序列中的目标片段插入到靶标序列中，形成基因重组片段，如图3。科研人员还可以对桥接RNA的第二、三茎环进行人工设计，用以结合和重组不同的DNA片段，突破了以往基因编辑中目标片段大小的限制，为基因组设计敞开新的大门。 （1）控制重组酶和桥接RNA 合成的DNA上有______结合位点，从而实现桥接RNA与重组酶的形成。该位点为______。 （2）结合题干信息，桥接RNA的主要功能为______。 （3）分析图1图2可知，重组酶可以对靶标序列和供体序列的特定部位进行______，以形成基因重组片段，依据该作用，重组酶还可以完成下图所示的______操作（填字母）。 （4）科研人员发现大肠杆菌中质粒B上的卡那霉素抗性基因不能表达，欲用文中的工具向质粒B中插入启动子，实验流程为：向大肠杆菌中转入一人为构建的质粒，其应包含______→将该质粒转入大肠杆菌→使用含有______的培养基筛选 → 获取基因编辑成功的菌株。 考点2 生物技术的安全与伦理问题 1．（25-26高三上·天津南开·期中）基因工程产物可能存在着一些安全性问题，但不必担心（    ） A．运载体的标记基因（如抗生素基因）可能指导合成有利于抗性进化的产物 B．三倍体转基因鲤鱼与正常鲤鱼的杂交后代生存能力极强，进而导致自然种群被淘汰 C．目的基因（如杀虫基因）本身编码的产物可能会对人体产生毒性 D．转基因生物体释放到环境中，可能会对生物多样性构成危害 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $