专题21 基因工程（期中真题汇编，江苏专用）高三生物上学期

**基本信息** 汇编江苏多地高三期中试题，聚焦基因工程工具与操作程序核心考点，整合DNA粗提取、PCR、载体构建等实验操作与抗菌肽基因导入、CRISPR-Cas9等前沿应用，凸显科学思维与探究能力考查。 **题型特征** |题型|题量/分值|知识覆盖|命题特色| |----|-----------|----------|----------| |选择题|5题|基因工程工具（限制酶、电泳）、实验操作（DNA鉴定、PCR）|结合江苏各地期中真题，基础与能力题结合，如考查DNA粗提取与电泳操作细节| |非选择题|10题|载体构建、转化筛选、基因治疗（AAV载体）、代谢工程（柚皮素合成）|以科研情境为载体，如抗菌肽基因导入柑橘抗黄龙病、CRISPR-Cas9敲除基因，突出科学探究与创新应用|

专题21 基因工程 考点1 基因工程的基本工具 1.【答案】D 2.【答案】A 考点2 基因工程的基本操作程序 1.【答案】ABD 2.【答案】D 3.【答案】C 4.【答案】C 5.【答案】D 6.【答案】（1）化学 黄龙病原菌产生抗药性 （2）附着在内质网的核糖体 细胞膜（细胞壁） （3）b 确保抗菌肽只在韧皮部表达而不影响其他组织 引物1和引物4 Xba I、Kpn I 能吸收周围环境中DNA分子 羧苄青霉素 卡那霉素 转基因的柑橘植株接种黄龙病菌，一段时间后观察其发病情况 7.【答案】（1）序列数据库 化学合成法 ②③一对、⑥⑦一对 （2）内毛细胞的特异性启动子 （3）维持培养液的pH 抗生素 分子大小、分子结构、带电性质的差异等 抗原-抗体杂交 （4）显微注射 （5）OTOF基因进入到内毛细胞后不会降解，并且在特异性启动子的帮助下能够高效表达 8.【答案】（1）RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录 ②④ （2）Agel和Xbal DNA连接酶 并非所有大肠杆菌都成功导入质粒，也可能发生自身环化或错误连接等 （3）四环素 使成功转化的大肠杆菌大量增殖 （4）不向肿瘤细胞导入重组质粒 C 将等量的正常细胞和肿瘤细胞分别导入相同剂量的重组质粒，同时设置未导入质粒的正常细胞和肿瘤细胞作为对照；培养相同时间后，检测并比较各组细胞的存活率 9.【答案】（1）终止子、复制原点 不能 由于基因的选择性表达，肝脏细胞不表达胰岛素基因 （2）限制酶识别序列（或限制酶序列）和目的基因部分（两端）序列 高温 dNTP （3）空间结构 E、N （4）肽键 大肠杆菌不含内质网、高尔基体，不能对胰岛素原进行加工 10.【答案】（1）杂交 （2）BamHⅠ和SalⅠ DNA连接 （3）大肠杆菌复制原点 （4）血清 （5）P6 P6代混合病毒中tsK株滴度最低，假病毒颗粒的比例最高，尽量减少tsK株可能造成的细胞毒性 （6）37 Xgal 假病毒能感染神经细胞，将外源基因Laz导入并表达 11.【答案】（1）总RNA（或RNA） 逆转录 （2）ACCT ATCG A BsaI酶单酶切操作简便，获得的黏性末端各不相同，避免目的片段的任意连接（或保证目的片段的正确连接） （3）4CL ③②①④ （4）提高 不平衡浓度 12.【答案】（1）DNA连接 琼脂糖凝胶电泳 2 （2）pUG6和酿酒酵母Y基因的上下游 1、2 3 同源染色体 （3）预变性 使子链充分延伸 降低引物与模板非特异性结合的概率 13.【答案】（1）Mg2+ 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 非模板链 GGATCCATGTTC （2）潮霉素 2 （3）能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少 （4）Y蛋白（通过与S基因启动子序列结合）促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性 14.【答案】（1）限制酶、DNA连接酶 2 ATC （2）强 CaCl2溶液 氨苄青霉素 扩增质粒 （琼脂糖凝胶）电泳 引物b、引物c 849（848） （3）pRS425-Cas9-2×Sap（CRISPR载体） 600 donor的存在显著提高了ADE2的敲除效率 15.【答案】（1）总（或m）RNA 反转录（或逆转录） 使目的基因与（线性化）载体（定向）连接 复性（或退火） （2）EcoRⅠ DNA连接酶 大小与预期相符 （3）质粒p-S（A）-His含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点；D位点上游含有EcoRⅠ酶切位点，下游含有XbaⅠ酶切位点（，双酶切确保方向正确）（或质粒p-S（A）-His和D位点都含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点） （4）2 （5）作为空白对照 2 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题21 基因工程 2大高频考点 1. 基因工程的基本工具 2. 基因工程的基本操作程序 考点1 基因工程的基本工具 1．（25-26高三上·江苏镇江·期中）下列关于DNA的实验叙述错误的是（　　） A．菜花、猪肝、酵母菌均可作为DNA粗提取的实验材料 B．粗提取的DNA需溶于2mol/L NaCl溶液后再加入二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳操作中，PCR扩增产物与含溴酚蓝的凝胶载样缓冲液混合后注入加样孔 D．待指示剂前沿迁移到凝胶边缘时停止电泳，将凝胶置于紫外灯下观察和照相 2．（25-26高三上·江苏宿迁中学·期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述正确的是（　　） A．取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精可析出DNA B．提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝 C．电泳过程中DNA分子越大，所带电荷数越多，迁移速率越快 D．在琼脂糖凝固前加入指示剂，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 考点2 基因工程的基本操作程序 1．（25-26高三上·江苏苏州·期中）（多选）关于“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述错误的有（　　） A．3个实验都需在无菌条件下进行 B．DNA粗提取中，常利用DNA在酒精中溶解度较大的特性来提取DNA C．PCR反应需在反应体系中添加一定量的无菌水，以补齐反应体系体积 D．琼脂糖融化后应立即加入核酸染料，以免凝胶凝固导致染料分布不均 2．（25-26高三上·江苏扬州·期中）下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。有关说法正确的是（　　） A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物 B．图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割 C．应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列 D．将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 3．（25-26高三上·江苏徐州·期中）如图表示基因工程化干细胞通过分泌外泌体（能产生调控基因表达的RNA）修复受损细胞的过程。下列相关叙述正确的是（    ） A．将目标基因导入干细胞前，仅需DNA连接酶构建含目标基因的表达载体 B．外泌体携带目标基因可直接整合到受损细胞的基因组中实现修复 C．相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险 D．若受损细胞是胰岛B细胞，该外泌体可直接产生胰岛素 4．（25-26高三上·江苏无锡·期中）增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在自然光下显示绿色。某实验室使用细菌质粒构建含eGFP基因的表达载体，然后将基因表达载体转入细菌，涂布平板后培养。下列叙述错误的是（　　） A．通过PCR方法获得eGFP目的片段需要先设计一对特异性引物 B．PCR延伸阶段设置72℃既能保证Taq酶高活性又能防止新合成的产物变性 C．质粒中含有多个不同的限制酶酶切位点不利于eGFP基因与质粒连接 D．若在平板上观察到多个绿色单菌落则说明eGFP基因表达载体构建成功 5．（25-26高三上·江苏无锡·期中）关于高中生物学中部分实验的操作，下列叙述正确的是（　　） A．“用高倍显微镜观察叶绿体”实验中，先用低倍镜观察叶绿体形态再换高倍镜观察其分布 B．“低温诱导植物细胞染色体数目变化”实验中，卡诺氏液处理的根尖用清水冲洗后再解离 C．“菊花的组织培养”实验中，配制的MS培养基先进行高压蒸汽灭菌然后再调节pH D．“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，将扩增产物与凝胶载样缓冲液混合后再注入加样孔 6．（25-26高三上·江苏镇江·期中）黄龙病是全球柑橘产业最具毁灭性的病害，其病原体为专性寄生在柑橘植株韧皮部的一种病菌。研究人员结合多种技术对柑橘黄龙病的防治展开研究。请回答下列问题： （1）通过对柑橘施用四环素等抗生素抑制黄龙病病菌的防治方法属于___________防治。研究发现，连续使用抗生素会使防治效果下降，分析其原因是___________。 （2）抗菌肽（AMP）是一种小分子活性肽，当黄龙病病菌侵染柑橘植株时，在柑橘细胞的___________（填细胞结构）完成抗菌肽的合成，经加工后发挥作用。研究发现，天蚕细胞中产生的抗菌肽尤其是抗菌肽B对黄龙病病菌表现出强烈的杀灭作用，其杀菌的核心机制是破坏细菌___________的完整性导致细胞内容物泄漏，从而杀死细菌。 （3）抗菌肽的抗菌活性高、抗菌速度快，但柑橘植株自身合成的抗菌肽作用有限，研究人员利用天蚕抗菌肽B基因，人工合成了抗菌肽基因SCB，下图1为SCB基因的片段，图2为pBIN质粒。 ①据图1分析，SCB基因转录的模板链是___________链，在SCB基因右侧添加韧皮部特异性启动子的目的为___________。利用PCR技术扩增基因SCB时，应选用的一对引物为___________，为确保基因SCB与pBIN质粒正确连接，需要在引物5'端添加限制酶___________的识别序列。 ②研究人员通过Ca2+处理使农杆菌成为___________的生理状态，以利于重组质粒导入农杆菌。据图2分析，转化后的农杆菌采用含___________的培养基进行筛选，转化成功的农杆菌侵染柑橘外植体，在含___________的培养基中筛选成功转入T-DNA的植物组织。 ③从个体生物学水平上，鉴定转基因植株是否具有抗黄龙病特性可采用的方法是___________。 7．（25-26高三上·江苏启东·期中）常染色体隐性遗传性耳聋9（DFNB9）的患者通常表现为重度或完全听力损失，其发病机制为OTOF基因突变导致耳畸蛋白缺陷，从而引起内毛细胞功能障碍，无法将声音刺激转变为电信号传给听觉神经通路，引起耳聋。近期中国科学家基于腺相关病毒（AAV）载体递送技术获取重组AAV（流程如图），通过局部给药的方式将人源OTOF基因靶向导入内耳，补偿内毛细胞缺失的耳畸蛋白，治疗疾病。 回答下列问题： （1）获取OTOF基因。可在________查询OTOF基因的编码序列，然后利用_______（方法）得到OTOF基因。因OTOF基因片段约6kb，超过单个AAV载体的包载能力（4.7kb），则利用PCR扩增OTOF基因两个片段，扩增时需要用到的引物有_______（填序号）。 （2）构建重组AAV表达载体。该重组载体除了有OTOF基因片段外，为了OTOF基因在内毛细胞特异性表达，还应有_______。 （3）在受体细胞中进行表达。将重组的AAV表达载体、衣壳质粒和辅助质粒共转染入人胚胎肾细胞，在人胚胎肾细胞的培养过程中，需提供5%的CO2来_______，添加_______抑制细菌的生长。培养一段时间后，可在上清液获得病毒克隆，同时需要裂解人胚胎肾细胞以提取总蛋白。利用电泳技术对总蛋白进行分离，总蛋白的迁移速度取决于_______（至少答两点）。电泳分离结束后，转移到特殊膜上，利用_______技术检测以验证转染后耳畸蛋白是否成功表达。 （4）导入内毛细胞。为了靶向治疗内毛细胞，科学家在麻醉小鼠后采用_______（填“肌肉注射”、“静脉注射”或“显微注射”的方式）给药，并观察小鼠的行为变化等指标。 （5）药效检测。临床试验结果表明，一次注射用药一般可以长期维持效果，幼儿完全恢复听力，请推测这种基因治疗方式长期维持效果的原因是______。 8．（25-26高三上·江苏南通通州·期中）白喉毒素A链（DTA）由白喉棒状杆菌的产毒菌株合成，毒性极强，能有效诱导细胞死亡。XRCC2启动子在正常细胞中表达水平很低，但在癌细胞中高表达。研究人员利用DTA基因和XRCC2启动子开展了相关研究，具体流程如下图。请回答下列问题。 （1）XRCC2启动子的功能是_______。启动子的编码链与所在基因的编码链为同一条链，已知启动子编码链序列5'-GAGCATTAAAACTGAA……GACTGGCCGTAGAGTCTGCGCAG-3'，则过程①构建的一对引物序列为______。 ①5'-GCATTAAAACTGAAGTGAAGTGA-3' ②5'-GCTAGCGAGCATTAAAACTGAAGT-3' ③5'-GGTACCCTGCGCAGACTCTACGGCC-3' ④5'-ACCGGTCTGCGCAGACTCTACGGCC-3' （2）过程③应选用限制酶______切割，获得DTA基因，随后用_______将两者进行连接。过程④之后，通常需要对重组质粒进行筛选，原因是_______。 （3）培养基I中应添加______，以筛选出成功导入质粒的大肠杆菌。从培养基I上挑取单菌落，经PCR验证为重组质粒后再转移至培养基Ⅱ中培养，培养的目的是______。 （4）研究人员提取大肠杆菌中的重组质粒，分别将0.05μg、0.1μg的重组质粒导入不同肿瘤细胞中，结果如图。 ①对照组的处理条件是______。结果表明，4种肿瘤细胞中，______（填字母）对XRCC2-DTA的表达产物最敏感。 ②为验证XRCC2-DTA的表达产物仅杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞，请简要描述实验设计思路：______。 9．（25-26高三上·江苏淮安·期中）工业上常将胰岛素原基因导入酵母菌，使其表达胰岛素原，经提取、加工后获得胰岛素。部分流程如图1所示，图中E、K、N、X为酶切位点，括号内数字表示其在质粒上的位置。据图回答问题： （1）除图中所示结构外，质粒P上还具有的元件有_________。________（选填“能”、“不能”）使用肝细胞替代图中胰岛B细胞，原因是____________。 （2）为扩增胰岛素原基因并连入载体，引物上应具有_________序列。PCR过程中，模板链解旋和子链延伸所需的能量分别来源于__________和________。 （3）某兴趣小组对构建成功的表达载体进行酶切电泳分析：第1组未加限制酶，第2-7组分别用不同限制酶组合切割。电泳结果如图2所示。第1组未酶切质粒的迁移速率大于等长的线性DNA，表明DNA的______是影响电泳迁移速率的因素之一。据图2推断，构建表达载体时选用的酶切位点是_______。 （4）在胰岛素原加工时需断裂__________获得胰岛素。科研人员曾尝试利用大肠杆菌表达胰岛素原，加工后所得胰岛素活性较低，从细胞结构角度分析原因是___________。 10．（25-26高三上·江苏南京师范大学附属中学·期中）HSV1是单纯疱疹病毒的一种类型，HSV1病毒颗粒的组装主要由包装信号序列（a′）介导。科研人员从HSV1基因组中分离出a′，利用基因工程技术构建了质粒pHSL并进行了相关实验（如图1），从而为某些神经系统疾病的基因治疗提供依据。请回答问题： （1）从HSV1中分离a′时，将人工合成的含特定序列的核酸探针与含有目的序列的酶解片段进行_____，根据阳性信号逐步筛选出尽可能短的a′所在片段。 （2）构建质粒pHSL时，过程②需要用限制酶_____处理质粒pHSV和质粒pSK，处理后的产物经鉴定、纯化后用_____酶连接。 （3）步骤③将质粒pHSL导入大肠杆菌是因为质粒pHSL中含有_____，能在大肠杆菌细胞内复制而获得大量拷贝。 （4）Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。进行Vero细胞培养时，通常采用添加了_____等天然成分的基本培养基提供营养。 （5）tsK株是具有感染性的HSV1温度敏感株。在tsK株的辅助下，pHSL能组装成不含完整病毒基因组的颗粒（假病毒），获得含假病毒和tsK株的混合毒株。图2是Vero细胞连续传代过程中，混合毒株的滴度变化曲线及每代中假病毒所占的比例（柱形图）。据图分析，应选用_____代混合毒株用于后续神经细胞的接种实验，理由是_____。 （6）为验证假病毒能否感染体外培养的神经细胞并表达Laz基因，科研人员将混合毒株与大鼠神经细胞按一定比例在_____℃下混合培养48 h，用含_____（填物质名称）的检测液原位检测β半乳糖苷酶的活性，结果发现大约20%的细胞变蓝，说明_____。 11．（25-26高三上·江苏苏州·期中）柚皮素在抗炎和抗肿瘤方面功效显著。植物体内柚皮素合成依赖一系列的酶促反应（图1）。通过向酵母细胞中导入外源功能基因，可实现柚皮素的批量生产。请回答下列问题。 （1）为构建生产柚皮素的酵母，首先需从能够合成柚皮素的植物细胞中获取______，通过______得到cDNA，进一步获得目的基因。 （2）为将CHS基因和CHI基因连接在同一载体上，构建具有双终止子、双BsaI酶切位点的Y22-T4质粒（图2）。限制酶BsaI在识别位点外侧若干个碱基处切割DNA（图3）。 ①BsaI对Y22-T4进行酶切后，Y22-T4上的两个黏性末端为5'-________-3'（靠近终止子1处）和5'-______-3'（靠近终止子2处）。 ②据图4重组质粒推测，CHI基因扩增时下游引物应选用______。 A．5'-CCCGGTCTCACGATTA……C-3' B．5'-CCCGAGACCAAGGTTA……C-3' C．5'-CCCGGTCTCAATCGTA……C-3' D．5'-CCCGGTCTCATTACTA……C-3' ③使用BsaI进行单酶切处理的优点有______。 （3）将图1五种酶的相关基因导入酵母后，发现柚皮素产量不高。代谢物检测发现，4-香豆酸含量正常，4-香豆酸-CoA显著偏低。可尝试将编码______（填酶名称）的基因，与酵母内源高表达强启动子连接，以增强酵母细胞合成能力。也可通过改造酶的结构来达到目的，以下为相关步骤，请正确排序：______（填序号）。 ①采用定点突变技术修改酶基因的脱氧核苷酸序列 ②推导出生物活性功能高的关键氨基酸替换位点 ③通过X射线衍射技术分析原始酶的空间结构 ④将改造后的酶基因导入受体细胞并检测活性 （4）酶分子改造还可通过易错PCR技术实现。在新DNA链合成过程中，非互补的碱基对会形成错配区，Mg2+可提高错配区的稳定性。与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当______（填“提高”或“降低”）Mg2+浓度，以保证反应正常进行；原料dNTP应为______（选填“1：1：1：1的平衡浓度”、“不平衡浓度”），以增加TaqDNA聚合酶“拿错”原料的概率。 12．（25-26高三上·江苏扬州·期中）酿酒酵母液泡膜上的钙离子通道Y蛋白是调控细胞内Ca2+浓度的重要途径之一，科学家用Cre/loxP系统和同源重组法构建Y基因缺失菌株，为后期钙通道功能研究奠定基础。 （1）Cre/loxP系统常用于基因的敲除，原理如图1所示。Cre酶能识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列并定点切断DNA双链，切口被_______酶重新连接后可得到图中1、2两个片段，用______鉴别和分离两者，保留其中的片段_____，可实现目标基因的敲除。 （2）图2为Cre/loxP重组酶系统敲除Y基因的原理和过程。 ①首先以质粒pUG6作为模板运用PCR技术，通过设计引物获得带有KanMX基因及其两 侧loxP序列的Y基因敲除组件，该过程所用引物YF2、YR2的设计依据主要有________的部分DNA序列，以保证获得目标片段，导入酿酒酵母细胞进行同源重组。KanMX基因可对图中细胞进行两次筛选，第一次用于筛选酿酒酵母细胞____（填数字），第二次用于筛选酿酒酵母细胞_______（填数字）。 ②已知选用的酿酒酵母菌株为二倍体，因此研究者获得细胞3后需用同样的方法敲除位于________上的另一个Y基因，最终需通过基因测序的方法检测和验证获得了Y基因双倍体缺失的目标菌株。 （3）图3表示上述实验中一次PCR的流程，其中步骤①的名称为____；步骤③中持续10分钟的操作目的是________；实验中复性温度较高（59℃），其目的是________。 、 13．（25-26高三上·江苏中华中学·期中）大豆转录调控因子 Y 蛋白可和某些基因的启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得 Y 基因并将其下游与终止密码子对应序列剔除，再与绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因，成功表达的 Y - GFP 融合蛋白可用于 Y 蛋白调控机理的研究。请回答： （1）研究中需对 Y 基因进行 PCR 扩增：缓冲液中需加入___________以激活耐高温的 DNA 聚合酶；复性的目的是___________。图 1 所示 Y 基因单链（部分）为转录的___________（填“模板链”或“非模板链”）。已知EcoRⅠ识别序列为 5’ - GAATTC - 3’，BamHⅠ识别序列为 5’ - GGATCC - 3’，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使 Y 基因正确接入载体并成功表达出 Y - GFP 融合蛋白，Y 基因下游扩增引物应为 5’ - ___________ - 3’（包括添加的限制酶识别序列，共写 12 个碱基）。 （2）将初步构建的 Y - GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经___________筛选后得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图 2 所示。其中细胞系___________能成功表达出 Y - GFP 融合蛋白。 （3）为探究 Y 蛋白能否与 S 基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用 S 基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图 3 所示。已知 Y 蛋白与 DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白___________（填“能”或“不能”）与 S 基因启动子序列结合，相比于 a 条带，b 条带放射性低的原因是___________。 （4）过表达 Y 基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y 蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是___________。 14．（25-26高三上·江苏连云港·期中）酿酒酵母中ADE2基因发生功能性突变时，会引起腺嘌呤合成缺陷，导致细胞在不含腺嘌呤的培养基中无法生长，中间产物的积累会使酵母细胞呈现红色。为探索ADE2基因与其他基因间相互作用，科研人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术在酿酒酵母中构建了相关基因的敲除突变体，过程如图1所示。请回答下列问题： （1）步骤①需要工具酶________，CRISPR载体中含有________个SapI识别序列（N为任意碱基），人工合成gRNA目标序列中其编码链5′端应添加5′-________-3′以匹配SapI酶切产生的黏性末端（转录方向为gRNA目标序列→gRNA骨架序列）。 （2）CRISPR-Cas9是一种高效的基因组编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白在单链向导RNA（gRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因。 ①应选择目标基因中特异性________（选填“强”“弱”）序列作为gRNA目标序列。 ②CRISPR重组质粒应转化至用________处理的大肠杆菌，转化后的大肠杆菌在添加________的培养基上培养，步骤②的目的是_________。 ③科研人员利用了PCR技术和________技术鉴定酿酒酵母ADE2基因是否被敲除，据图2分析，PCR过程中需要添加的引物为________，若PCR产物与预期大小________bp一致，则说明基因敲除成功。 （3）Cas9蛋白切割使DNA双链断裂后，生物体对DNA双链断裂的修复主要有两种机制：非同源末端连接和同源重组，同源重组需要在酿酒酵母中引入外源模板序列（donor）。图3、4分别为含donor转化组、不含donor转化组及空白转化组（WT）菌落PCR扩增检测结果，结合图2分析，空白对照组转化至酿酒酵母的是________，含donor组则需将CRISPR重组质粒及大小为________bp的模板序列转化至酿酒酵母，结果说明_________。 15．（25-26高三上·江苏徐州·期中）猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是引起仔猪严重腹泻的重要病原体，其S基因（编码含保守A、D抗原位点的纤突蛋白）是研发DNA疫苗的关键靶点。某团队以质粒p-S-His为基础，构建TGEV的DNA疫苗载体过程如图1．请回答下列问题： （1）科研人员从TGEV感染的细胞中提取_____，通过_____过程合成cDNA，再以cDNA为模板扩增S基因的A位点（513bp）、D位点（619bp），扩增时需在引物的5′端添加酶切位点，目的是_____，模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。 （2）据表1和表2分析，将A位点与p-S-His用BamHⅠ和_____双酶切后使用_____连接，产物利用PCR及电泳技术鉴定，选取_____的片段进行测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为p-S（A）-His，保存备用。 表1  S基因A位点、D位点扩增引物序列 引物 序列（5′—3′） P1 CGCGGATCCATGTTAGTTACCAAACAGCCGT P2 CCGGAATTCTATTGTCCAGAAAACGTCAC P3 CCGGAATTCAAGTTGAAAACACAGCTATT P4 TGCTCTAGAACTATTATCAGACGGTACACC 表2  限制酶及识别序列 限制酶 识别序列 BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′ EcoRⅠ 5′-G↓AATTC-3′ XbaⅠ 5′-T↓CTAGA-3′ （3）p-S（A-D）-His能实现A、D位点有序融合的原因是_____。 （4）对构建的p-S（A-D）-His进行完全酶切并电泳检测，结果如图2，其中泳道_____为双酶切的结果。 （5）依据构建p-S（A-D）-His的相同方法，构建出p-N-His重组质粒，利用不同疫苗载体单独或联合免疫小鼠后，血清中抗体（IgG）水平如表3．组别4的作用是_____；根据实验结果，选取疫苗载体投入使用时，最好选取组别_____中的疫苗载体。 表3  免疫小鼠抗TGEV血清IgG水平（OD450nm） 组别 疫苗载体种类 0天 14天 28天 42天 1 p-S（A-D）-His 0．133 0．218 0．243 0．401 2 p-N-His 0．138 0．244 0．344 0．504 3 p-S（A-D）-His+p-N-His 0．142 0．225 0．300 0．471 4 p-S-His 0．134 0．144 0．141 0．139 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题21 基因工程 2大高频考点 1. 基因工程的基本工具 2. 基因工程的基本操作程序 考点1 基因工程的基本工具 1．（25-26高三上·江苏镇江·期中）下列关于DNA的实验叙述错误的是（　　） A．菜花、猪肝、酵母菌均可作为DNA粗提取的实验材料 B．粗提取的DNA需溶于2mol/L NaCl溶液后再加入二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳操作中，PCR扩增产物与含溴酚蓝的凝胶载样缓冲液混合后注入加样孔 D．待指示剂前沿迁移到凝胶边缘时停止电泳，将凝胶置于紫外灯下观察和照相 【答案】D 【解析】A、菜花（植物细胞）、猪肝（动物细胞）、酵母菌（真菌细胞）均含有丰富的DNA，且细胞结构易于破碎，适合作为DNA粗提取的实验材料，A正确； B、在DNA鉴定实验中，粗提取的DNA需溶于2mol/L NaCl溶液以维持其溶解性，再加入二苯胺试剂并在沸水浴中加热，才能发生蓝色反应，该叙述符合二苯胺鉴定原理，B正确； C、凝胶电泳操作中，PCR扩增产物需与含溴酚蓝（指示染料）的凝胶载样缓冲液混合，溴酚蓝用于指示电泳迁移位置，混合后注入加样孔以进行电泳分离，C正确； D、电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，之后取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，D错误。 故选D。 2．（25-26高三上·江苏宿迁中学·期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述正确的是（　　） A．取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精可析出DNA B．提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝 C．电泳过程中DNA分子越大，所带电荷数越多，迁移速率越快 D．在琼脂糖凝固前加入指示剂，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】A 【解析】A、洋葱研磨液的上清液中含有溶解的DNA，加入等体积95%冷酒精可析出DNA，原因是①DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精，冷酒精能有效分离DNA与杂质；②低温（冷酒精）可降低DNA的溶解度，进一步促进DNA析出，形成白色丝状物，A正确； B、丝状物应先溶于2mol的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B错误； C、电泳中DNA迁移速率与分子大小成反比，大分子阻力大迁移慢，电荷数虽多但质量影响更大，C错误； D、指示剂（如溴酚蓝）应加入样品中，而非凝固前的凝胶中，否则无法指示电泳进程，D错误。 故选A。 考点2 基因工程的基本操作程序 1．（25-26高三上·江苏苏州·期中）（多选）关于“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述错误的有（　　） A．3个实验都需在无菌条件下进行 B．DNA粗提取中，常利用DNA在酒精中溶解度较大的特性来提取DNA C．PCR反应需在反应体系中添加一定量的无菌水，以补齐反应体系体积 D．琼脂糖融化后应立即加入核酸染料，以免凝胶凝固导致染料分布不均 【答案】ABD 【解析】A、3个实验都不需要严格的无菌环境。PCR扩增为避免外源DNA的污染，使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，A错误； B、DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步分离DNA与蛋白质，B错误； C、在PCR反应体系中，无菌水的主要作用是作为溶剂，帮助溶解其他反应成分，并确保反应体系的总体积达到预定的体积，C正确； D、琼脂糖融化后不应立即加入核酸染料，而应该在琼脂糖凝胶稍微冷却后再加入。因为温度过高会导致核酸染料分解，致使其失效，D错误。 故选ABD。 2．（25-26高三上·江苏扬州·期中）下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。有关说法正确的是（　　） A．农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物 B．图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割 C．应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列 D．将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置 【答案】D 【解析】A、农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，A错误； B、图中T-DNA两侧应该用相同限制酶切割，以便酶切后连接成环状，B错误； C、耐高温的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误； D、不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置，D正确。 故选D。 3．（25-26高三上·江苏徐州·期中）如图表示基因工程化干细胞通过分泌外泌体（能产生调控基因表达的RNA）修复受损细胞的过程。下列相关叙述正确的是（    ） A．将目标基因导入干细胞前，仅需DNA连接酶构建含目标基因的表达载体 B．外泌体携带目标基因可直接整合到受损细胞的基因组中实现修复 C．相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险 D．若受损细胞是胰岛B细胞，该外泌体可直接产生胰岛素 【答案】C 【解析】A、构建含目标基因的表达载体时，不仅需要DNA连接酶，还需要限制酶来切割运载体和获取目的基因，A错误； B、外泌体是分泌的能产生调控基因表达的RNA，并不是携带目标基因直接整合到受损细胞的基因组中，而是通过调控基因表达来实现修复，B错误； C、直接移植干细胞，干细胞作为外来细胞，容易引起免疫排斥反应，而外泌体是细胞分泌的物质，相较于直接移植干细胞，外泌体治疗可降低免疫排斥风险，C正确； D、外泌体是产生调控基因表达的RNA，不能直接产生胰岛素，胰岛素是由胰岛B细胞中的相关基因表达产生的，D错误。 故选C。 4．（25-26高三上·江苏无锡·期中）增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在自然光下显示绿色。某实验室使用细菌质粒构建含eGFP基因的表达载体，然后将基因表达载体转入细菌，涂布平板后培养。下列叙述错误的是（　　） A．通过PCR方法获得eGFP目的片段需要先设计一对特异性引物 B．PCR延伸阶段设置72℃既能保证Taq酶高活性又能防止新合成的产物变性 C．质粒中含有多个不同的限制酶酶切位点不利于eGFP基因与质粒连接 D．若在平板上观察到多个绿色单菌落则说明eGFP基因表达载体构建成功 【答案】C 【解析】A、PCR扩增目的基因需要根据目的基因两端的序列设计一对特异性引物，以引导Taq酶进行扩增，A正确； B、PCR延伸阶段的温度设置为72℃，这是Taq DNA聚合酶的最适活性温度，既能保证酶的高效催化，又不会使新合成的DNA链变性（DNA高温变性通常在90℃以上），B正确； C、质粒中含多个不同的限制酶切位点（多克隆位点）可提供多种酶切选择，便于目的基因与质粒的连接，C错误； D、若平板上出现绿色单菌落，说明eGFP基因在细菌中成功表达，表明表达载体构建成功（未成功构建的细菌无法表达eGFP，不会显绿色），D正确。 故选C。 5．（25-26高三上·江苏无锡·期中）关于高中生物学中部分实验的操作，下列叙述正确的是（　　） A．“用高倍显微镜观察叶绿体”实验中，先用低倍镜观察叶绿体形态再换高倍镜观察其分布 B．“低温诱导植物细胞染色体数目变化”实验中，卡诺氏液处理的根尖用清水冲洗后再解离 C．“菊花的组织培养”实验中，配制的MS培养基先进行高压蒸汽灭菌然后再调节pH D．“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，将扩增产物与凝胶载样缓冲液混合后再注入加样孔 【答案】D 【解析】A、“用高倍显微镜观察叶绿体”实验中，需先用低倍镜找到细胞，再换高倍镜观察叶绿体的形态和分布。A错误； B、用卡诺氏液处理后的洋葱根尖需要用体积分数95%酒精冲洗2次后才能进行解离操作，B错误； C、配制MS培养基时，应先调节pH再进行高压蒸汽灭菌，防止再调pH造成杂菌污染培养基，C错误； D、将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用移液枪将混合液缓缓注入加样孔，D正确。 故选D。 6．（25-26高三上·江苏镇江·期中）黄龙病是全球柑橘产业最具毁灭性的病害，其病原体为专性寄生在柑橘植株韧皮部的一种病菌。研究人员结合多种技术对柑橘黄龙病的防治展开研究。请回答下列问题： （1）通过对柑橘施用四环素等抗生素抑制黄龙病病菌的防治方法属于___________防治。研究发现，连续使用抗生素会使防治效果下降，分析其原因是___________。 （2）抗菌肽（AMP）是一种小分子活性肽，当黄龙病病菌侵染柑橘植株时，在柑橘细胞的___________（填细胞结构）完成抗菌肽的合成，经加工后发挥作用。研究发现，天蚕细胞中产生的抗菌肽尤其是抗菌肽B对黄龙病病菌表现出强烈的杀灭作用，其杀菌的核心机制是破坏细菌___________的完整性导致细胞内容物泄漏，从而杀死细菌。 （3）抗菌肽的抗菌活性高、抗菌速度快，但柑橘植株自身合成的抗菌肽作用有限，研究人员利用天蚕抗菌肽B基因，人工合成了抗菌肽基因SCB，下图1为SCB基因的片段，图2为pBIN质粒。 ①据图1分析，SCB基因转录的模板链是___________链，在SCB基因右侧添加韧皮部特异性启动子的目的为___________。利用PCR技术扩增基因SCB时，应选用的一对引物为___________，为确保基因SCB与pBIN质粒正确连接，需要在引物5'端添加限制酶___________的识别序列。 ②研究人员通过Ca2+处理使农杆菌成为___________的生理状态，以利于重组质粒导入农杆菌。据图2分析，转化后的农杆菌采用含___________的培养基进行筛选，转化成功的农杆菌侵染柑橘外植体，在含___________的培养基中筛选成功转入T-DNA的植物组织。 ③从个体生物学水平上，鉴定转基因植株是否具有抗黄龙病特性可采用的方法是___________。 【答案】（1）化学 黄龙病原菌产生抗药性 （2）附着在内质网的核糖体 细胞膜（细胞壁） （3）b 确保抗菌肽只在韧皮部表达而不影响其他组织 引物1和引物4 Xba I、Kpn I 能吸收周围环境中DNA分子 羧苄青霉素 卡那霉素 转基因的柑橘植株接种黄龙病菌，一段时间后观察其发病情况 【解析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）抗生素属于化学物质，所以对柑橘施用四环素等抗生素抑制黄龙病病菌的防治方法属于化学防治。而连续使用抗生素会使防治效果下降，其原因是由于抗生素对黄龙病病菌的抗药性变异进行了定向选择，进而导致黄龙病原菌产生抗药性， （2）抗菌肽（AMP）是一种小分子活性肽，分泌到细胞外起作用，当黄龙病病菌侵染柑橘植株时，在柑橘细胞的附着在内质网上的核糖体完成抗菌肽的合成，经加工后发挥作用。细菌的最外层是细胞壁，具有支持和保护的作用，细胞的边界是细胞膜，具有控制物质进出细胞的作用，所以天蚕细胞中产生的抗菌肽尤其是抗菌肽B之所以对黄龙病病菌表现出强烈的杀灭作用，其核心机制是破坏细菌的细胞壁或细胞膜的完整性导致细胞内容物泄漏，从而杀死细菌。 （3）①转录的方向是从子链的5'端到3'端，从基因的启动子开始，子链的5'端对应于模板链的3'羟基端，即SCB基因转录的模板链为b链，在SCB基因右侧添加韧皮部特异性启动子，其目的是确保抗菌肽只在特定细胞（韧皮部细胞）表达而不影响其他组织。PCR扩增时，引物与目的基因的3'端（-OH端）碱基互补配对，所以应选择的引物为引物1和引物4。 依据图2，且确保基因SCB与pBIN质粒正确连接，需要采用双酶切法，同时避免自身环化和反向连接，则需要在引物5'端添加限制酶，由于要对质粒和目的基因采用相同的酶进行切割，则在质粒的启动子和终止子之间符合该要求的限制酶只有Xba I、Kpn I，所以需要在引物5'端添加限制酶Xba I、Kpn I。 ②研究人员通过Ca2+处理使农杆菌成为能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以利于重组质粒导入农杆菌。依据图2可知，质粒上含有羧苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。所以转化后的农杆菌采用含羧苄青霉素的培养基进行筛选，转化成功的农杆菌侵染柑橘外植体，在含卡那霉素的培养基中筛选成功转入T-DNA的植物组织。 ③从个体生物学水平上，鉴定转基因植株是否具有抗黄龙病特性，可采用接种法，即将转基因的柑橘植株接种黄龙病菌，一段时间后观察其发病情况。 7．（25-26高三上·江苏启东·期中）常染色体隐性遗传性耳聋9（DFNB9）的患者通常表现为重度或完全听力损失，其发病机制为OTOF基因突变导致耳畸蛋白缺陷，从而引起内毛细胞功能障碍，无法将声音刺激转变为电信号传给听觉神经通路，引起耳聋。近期中国科学家基于腺相关病毒（AAV）载体递送技术获取重组AAV（流程如图），通过局部给药的方式将人源OTOF基因靶向导入内耳，补偿内毛细胞缺失的耳畸蛋白，治疗疾病。 回答下列问题： （1）获取OTOF基因。可在________查询OTOF基因的编码序列，然后利用_______（方法）得到OTOF基因。因OTOF基因片段约6kb，超过单个AAV载体的包载能力（4.7kb），则利用PCR扩增OTOF基因两个片段，扩增时需要用到的引物有_______（填序号）。 （2）构建重组AAV表达载体。该重组载体除了有OTOF基因片段外，为了OTOF基因在内毛细胞特异性表达，还应有_______。 （3）在受体细胞中进行表达。将重组的AAV表达载体、衣壳质粒和辅助质粒共转染入人胚胎肾细胞，在人胚胎肾细胞的培养过程中，需提供5%的CO2来_______，添加_______抑制细菌的生长。培养一段时间后，可在上清液获得病毒克隆，同时需要裂解人胚胎肾细胞以提取总蛋白。利用电泳技术对总蛋白进行分离，总蛋白的迁移速度取决于_______（至少答两点）。电泳分离结束后，转移到特殊膜上，利用_______技术检测以验证转染后耳畸蛋白是否成功表达。 （4）导入内毛细胞。为了靶向治疗内毛细胞，科学家在麻醉小鼠后采用_______（填“肌肉注射”、“静脉注射”或“显微注射”的方式）给药，并观察小鼠的行为变化等指标。 （5）药效检测。临床试验结果表明，一次注射用药一般可以长期维持效果，幼儿完全恢复听力，请推测这种基因治疗方式长期维持效果的原因是______。 【答案】（1）序列数据库 化学合成法 ②③一对、⑥⑦一对 （2）内毛细胞的特异性启动子 （3）维持培养液的pH 抗生素 分子大小、分子结构、带电性质的差异等 抗原-抗体杂交 （4）显微注射 （5）OTOF基因进入到内毛细胞后不会降解，并且在特异性启动子的帮助下能够高效表达 【解析】1、PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （1）查询OTOF基因的编码序列可在基因数据库中进行，这些数据库提供了基因的完整序列信息，从数据库获得序列信息后，可以使用化学合成法合成出OTOF基因。 由于OTOF基因全长约6kb，超过单个AAV载体的包载能力（4.7kb），需要将基因分为两个片段（1-2790bp和2791-5994bp）进行PCR扩增，扩增时需要用到两对引物，引物应该结合在模板链的3'端，从序列图中可以看出，应选择引物②③和⑥⑦。 （2）为了使OTOF基因在内毛细胞中特异性表达，重组载体除了包含OTOF基因片段外，还应包含内毛细胞特异性启动子，这种启动子可以确保基因只在目标细胞类型中表达，提高治疗的靶向性。 （3）在人胚胎肾细胞的培养过程中，需提供5%的CO2来维持培养液的pH，添加抗生素（如青霉素） 来抑制细菌的生长，确保细胞培养的无菌环境。利用电泳技术对总蛋白进行分离时，总蛋白的迁移速度主要取决于分子量大小、分子结构、带电性质的差异等。分子量越小、所带电荷越多，迁移速度越快。电泳分离后，蛋白质被转移到特殊膜（如硝酸纤维素膜）上，然后利用抗原-抗体杂交技术进行检测，该方法使用特异性抗体验证耳畸蛋白是否成功表达。 （4）为了靶向治疗内毛细胞，科学家在麻醉小鼠后采用显微注射的方式给药，这种方法允许精确地将重组AAV载体注入内耳局部，确保基因高效导入内毛细胞。 （5）这种基因治疗方式能够长期维持效果的原因是OTOF基因进入到内毛细胞后不会降解，并且在特异性启动子的帮助下能够高效表达，从而长期补偿耳畸蛋白的功能。 8．（25-26高三上·江苏南通通州·期中）白喉毒素A链（DTA）由白喉棒状杆菌的产毒菌株合成，毒性极强，能有效诱导细胞死亡。XRCC2启动子在正常细胞中表达水平很低，但在癌细胞中高表达。研究人员利用DTA基因和XRCC2启动子开展了相关研究，具体流程如下图。请回答下列问题。 （1）XRCC2启动子的功能是_______。启动子的编码链与所在基因的编码链为同一条链，已知启动子编码链序列5'-GAGCATTAAAACTGAA……GACTGGCCGTAGAGTCTGCGCAG-3'，则过程①构建的一对引物序列为______。 ①5'-GCATTAAAACTGAAGTGAAGTGA-3' ②5'-GCTAGCGAGCATTAAAACTGAAGT-3' ③5'-GGTACCCTGCGCAGACTCTACGGCC-3' ④5'-ACCGGTCTGCGCAGACTCTACGGCC-3' （2）过程③应选用限制酶______切割，获得DTA基因，随后用_______将两者进行连接。过程④之后，通常需要对重组质粒进行筛选，原因是_______。 （3）培养基I中应添加______，以筛选出成功导入质粒的大肠杆菌。从培养基I上挑取单菌落，经PCR验证为重组质粒后再转移至培养基Ⅱ中培养，培养的目的是______。 （4）研究人员提取大肠杆菌中的重组质粒，分别将0.05μg、0.1μg的重组质粒导入不同肿瘤细胞中，结果如图。 ①对照组的处理条件是______。结果表明，4种肿瘤细胞中，______（填字母）对XRCC2-DTA的表达产物最敏感。 ②为验证XRCC2-DTA的表达产物仅杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞，请简要描述实验设计思路：______。 【答案】（1）RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录 ②④ （2）Agel和Xbal DNA连接酶 并非所有大肠杆菌都成功导入质粒，也可能发生自身环化或错误连接等 （3）四环素 使成功转化的大肠杆菌大量增殖 （4）不向肿瘤细胞导入重组质粒 C 将等量的正常细胞和肿瘤细胞分别导入相同剂量的重组质粒，同时设置未导入质粒的正常细胞和肿瘤细胞作为对照；培养相同时间后，检测并比较各组细胞的存活率 【解析】基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括： 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 （1）启动子是位于基因上游的一段DNA序列，其核心功能是作为RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因的转录。过程①为从HCA2细胞中PCR获得启动子，而图中XRCC2启动子两端标有NheⅠ和AgeⅠ，说明引物设计需在两端引入相应酶切位点，因此，推测正向引物应含NheⅠ位点（5’-GCTAGC-3’），对应选项②，反向引物应含AgeⅠ位点（5’-ACCGGT-3’），对应选项④，故过程①构建的一对引物序列为②④。 （2）过程③是将DTA基因与XRCC2启动子连接，结合图中过程④插入质粒时，质粒酶切位点为NheⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ，若融合基因两端为NheⅠ和XbaⅠ，则可插入。  因此，启动子PCR产物含NheⅠ（5’端）和AgeⅠ（3’端），DTA基因用AgeⅠ和XbaⅠ切割，用DNA连接酶连接，得到NheⅠ-启动子-DTA-XbaⅠ 融合片段，再用NheⅠ和XbaⅠ切质粒，所以过程③应选用限制酶AgeⅠ和XbaⅠ，切割后用 DNA连接酶将两者连接。因为转化过程中，并非所有大肠杆菌都成功导入质粒，也可能发生自身环化或错误连接，因此需要筛选，以 确保获得的是含有目的基因（XRCC2-DTA）的重组质粒。 （3）pCMV质粒携带四环素抗性基因，所以培养基I中应添加四环素以筛选出成功导入质粒（含抗性基因）的大肠杆菌。从培养基I挑取单菌落，PCR验证为重组质粒后转移至培养基II的目的是使成功转化的大肠杆菌大量增殖，以获得足够量的重组质粒用于后续实验。 （4）①对照组应为不导入任何重组质粒，或导入空质粒（不含DTA基因）的肿瘤细胞，处理条件是导入空质粒（或不导入质粒）的肿瘤细胞， 细胞存活率越低，说明对XRCC2-DTA表达产物越敏感，由图可知，C组在0.05μg和0.1μg处理下存活率最低，因此，4种肿瘤细胞中，C组对XRCC2-DTA的表达产物最敏感。 ②若验证仅杀伤肿瘤细胞，不杀伤正常细胞，需设置对照实验组为导入重组质粒的正常细胞，对照组为导入重组质粒的肿瘤细胞，另设空白对照，未导入质粒的正常细胞和肿瘤细胞，实验设计思路为将等量的正常细胞和肿瘤细胞分别导入相同剂量（如0.1μg）的重组质粒，同时设置未导入质粒的正常细胞和肿瘤细胞作为对照；培养相同时间后，检测并比较各组细胞的存活率。若正常细胞存活率显著高于肿瘤细胞，且与未处理组无显著差异，即可验证XRCC2-DTA表达产物仅杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞。 9．（25-26高三上·江苏淮安·期中）工业上常将胰岛素原基因导入酵母菌，使其表达胰岛素原，经提取、加工后获得胰岛素。部分流程如图1所示，图中E、K、N、X为酶切位点，括号内数字表示其在质粒上的位置。据图回答问题： （1）除图中所示结构外，质粒P上还具有的元件有_________。________（选填“能”、“不能”）使用肝细胞替代图中胰岛B细胞，原因是____________。 （2）为扩增胰岛素原基因并连入载体，引物上应具有_________序列。PCR过程中，模板链解旋和子链延伸所需的能量分别来源于__________和________。 （3）某兴趣小组对构建成功的表达载体进行酶切电泳分析：第1组未加限制酶，第2-7组分别用不同限制酶组合切割。电泳结果如图2所示。第1组未酶切质粒的迁移速率大于等长的线性DNA，表明DNA的______是影响电泳迁移速率的因素之一。据图2推断，构建表达载体时选用的酶切位点是_______。 （4）在胰岛素原加工时需断裂__________获得胰岛素。科研人员曾尝试利用大肠杆菌表达胰岛素原，加工后所得胰岛素活性较低，从细胞结构角度分析原因是___________。 【答案】（1）终止子、复制原点 不能 由于基因的选择性表达，肝脏细胞不表达胰岛素基因 （2）限制酶识别序列（或限制酶序列）和目的基因部分（两端）序列 高温 dNTP （3）空间结构 E、N （4）肽键 大肠杆菌不含内质网、高尔基体，不能对胰岛素原进行加工 【解析】1.质粒的组成：启动子，终止子，复制原点，酶切位点，抗性基因。 2.PCR条件：引物（一小段能与母链3’配对的短单链核酸），模板，耐高温的DNA聚合酶，原料dNTP，含有Mg2+的缓冲液。 （1）图中质粒上包括启动子、限制酶切位点和抗性基因，因此质粒上还具有的元件有终止子和复制原点。不能使用肝细胞代替胰岛B细胞，原因是由于基因的选择性表达，肝细胞中没有胰岛素原的mRNA。 （2）引物上应具有限制酶切位点序列和目的基因互补序列。PCR过程中解旋的能量来源于高温，延伸的能量来源于dNTP。 （3）由题意可知，DNA的形状也影响了迁移速率。由图2可知E、N和E、X组合均切出了目的基因。若选择的是E、X，则构建好的质粒上不包含K、N酶切位点，因此选择K、N酶切时不能将构建好的质粒切开，与条带一位置相同。而图中选择K、N酶切位点能够将构建好的质粒切开，因此选择的酶切位点是E、N。 （4）如图可知，胰岛素原加工成胰岛素的过程需要断裂肽键。从细胞的结构分析原因，由于大肠杆菌是原核生物，不含生物膜系统无法对合成的胰岛素原进行加工。 10．（25-26高三上·江苏南京师范大学附属中学·期中）HSV1是单纯疱疹病毒的一种类型，HSV1病毒颗粒的组装主要由包装信号序列（a′）介导。科研人员从HSV1基因组中分离出a′，利用基因工程技术构建了质粒pHSL并进行了相关实验（如图1），从而为某些神经系统疾病的基因治疗提供依据。请回答问题： （1）从HSV1中分离a′时，将人工合成的含特定序列的核酸探针与含有目的序列的酶解片段进行_____，根据阳性信号逐步筛选出尽可能短的a′所在片段。 （2）构建质粒pHSL时，过程②需要用限制酶_____处理质粒pHSV和质粒pSK，处理后的产物经鉴定、纯化后用_____酶连接。 （3）步骤③将质粒pHSL导入大肠杆菌是因为质粒pHSL中含有_____，能在大肠杆菌细胞内复制而获得大量拷贝。 （4）Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。进行Vero细胞培养时，通常采用添加了_____等天然成分的基本培养基提供营养。 （5）tsK株是具有感染性的HSV1温度敏感株。在tsK株的辅助下，pHSL能组装成不含完整病毒基因组的颗粒（假病毒），获得含假病毒和tsK株的混合毒株。图2是Vero细胞连续传代过程中，混合毒株的滴度变化曲线及每代中假病毒所占的比例（柱形图）。据图分析，应选用_____代混合毒株用于后续神经细胞的接种实验，理由是_____。 （6）为验证假病毒能否感染体外培养的神经细胞并表达Laz基因，科研人员将混合毒株与大鼠神经细胞按一定比例在_____℃下混合培养48 h，用含_____（填物质名称）的检测液原位检测β半乳糖苷酶的活性，结果发现大约20%的细胞变蓝，说明_____。 【答案】（1）杂交 （2）BamHⅠ和SalⅠ DNA连接 （3）大肠杆菌复制原点 （4）血清 （5）P6 P6代混合病毒中tsK株滴度最低，假病毒颗粒的比例最高，尽量减少tsK株可能造成的细胞毒性 （6）37 Xgal 假病毒能感染神经细胞，将外源基因Laz导入并表达 【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存，②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入，③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）人工合成的含特定序列的核酸探针与含有目的序列的酶解片段能够碱基互补配对，进行杂交，根据阳性结果即可筛选出a所在片段。 （2）质粒pSK的a'片段两端有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶，且质粒pHSV的LaZ基因内部有EcoRⅠ，所以不能选EcoR限制酶，且Hind Ⅲ两端有目的基因和启动子等，也不能选。所以只能选择BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶。DNA连接酶可以连接两个DNA片段。 （3）能在大肠杆菌细胞内复制而获得大量拷贝，说明基因表达载体能够在受体细胞中稳定存在且复制，所以质粒pHSL中含有大肠杆菌复制原点。 （4）动物细胞培养所用的培养基的成分与体内细胞基本相同，如需要有葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清或血浆，还有适量的抗生素以保证无菌环境。 （5）P6代混合病毒中tsK株滴度最低，假病毒颗粒的比例最高，尽量减少tsK株可能造成的细胞毒性，所以选用P6代。 （6）动物细胞培养适宜温度在37℃。Xgal会被B半乳糖昔酶水解成蓝色物质，进而检测其活性。结果发现大约20%的细胞变蓝，说明假病毒能感染神经细胞，将外源基因Laz导入并表达。 11．（25-26高三上·江苏苏州·期中）柚皮素在抗炎和抗肿瘤方面功效显著。植物体内柚皮素合成依赖一系列的酶促反应（图1）。通过向酵母细胞中导入外源功能基因，可实现柚皮素的批量生产。请回答下列问题。 （1）为构建生产柚皮素的酵母，首先需从能够合成柚皮素的植物细胞中获取______，通过______得到cDNA，进一步获得目的基因。 （2）为将CHS基因和CHI基因连接在同一载体上，构建具有双终止子、双BsaI酶切位点的Y22-T4质粒（图2）。限制酶BsaI在识别位点外侧若干个碱基处切割DNA（图3）。 ①BsaI对Y22-T4进行酶切后，Y22-T4上的两个黏性末端为5'-________-3'（靠近终止子1处）和5'-______-3'（靠近终止子2处）。 ②据图4重组质粒推测，CHI基因扩增时下游引物应选用______。 A．5'-CCCGGTCTCACGATTA……C-3' B．5'-CCCGAGACCAAGGTTA……C-3' C．5'-CCCGGTCTCAATCGTA……C-3' D．5'-CCCGGTCTCATTACTA……C-3' ③使用BsaI进行单酶切处理的优点有______。 （3）将图1五种酶的相关基因导入酵母后，发现柚皮素产量不高。代谢物检测发现，4-香豆酸含量正常，4-香豆酸-CoA显著偏低。可尝试将编码______（填酶名称）的基因，与酵母内源高表达强启动子连接，以增强酵母细胞合成能力。也可通过改造酶的结构来达到目的，以下为相关步骤，请正确排序：______（填序号）。 ①采用定点突变技术修改酶基因的脱氧核苷酸序列 ②推导出生物活性功能高的关键氨基酸替换位点 ③通过X射线衍射技术分析原始酶的空间结构 ④将改造后的酶基因导入受体细胞并检测活性 （4）酶分子改造还可通过易错PCR技术实现。在新DNA链合成过程中，非互补的碱基对会形成错配区，Mg2+可提高错配区的稳定性。与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当______（填“提高”或“降低”）Mg2+浓度，以保证反应正常进行；原料dNTP应为______（选填“1：1：1：1的平衡浓度”、“不平衡浓度”），以增加TaqDNA聚合酶“拿错”原料的概率。 【答案】（1）总RNA（或RNA） 逆转录 （2）ACCT ATCG A BsaI酶单酶切操作简便，获得的黏性末端各不相同，避免目的片段的任意连接（或保证目的片段的正确连接） （3）4CL ③②①④ （4）提高 不平衡浓度 【解析】PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过人工合成的引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 （1）要获取合成柚皮素的相关基因，首先从能合成柚皮素的植物细胞中提取总RNA（因为基因的转录产物是 RNA），再通过反转录（逆转录） 过程，以 RNA 为模板合成 cDNA，进而获得目的基因。 （2）限制酶BsaI在识别位点外侧若干个碱基处切割DNA，在终止子和BsaI之间，所以靠近终止子1处是ACCT，靠近终止子2处ATCG；因扩增是从5'到3'延伸，根据碱基互补配对原则，CHI基因扩增时下游引物应选用5'-CCCGGTCTCACGATTA……C-3'；单酶切处理的优点有BsaI酶单酶切操作简便，获得的黏性末端各不相同，避免目的片段的任意连接（或保证目的片段的正确连接）。 （3）4 - 香豆酸 - CoA 含量偏低，说明催化 “4 - 香豆酸→4 - 香豆酸 - CoA” 的酶（4CL）活性不足，因此需将编码4CL的基因与高表达启动子连接，增强其合成能力；改造酶结构的步骤：先通过 X 射线衍射分析原酶空间结构（③），再推导出关键氨基酸替换位点（②），接着用定点突变技术修改酶基因序列（①），最后将改造后的基因导入受体细胞并检测活性（④）。故排序为 ③②①④。 （4）易错 PCR 中，可提高错配区稳定性，为了增加错配概率，应提高浓度； 原料 dNTP 采用不平衡浓度，可增加 Taq DNA 聚合酶 “错拿” 原料的概率，从而提高突变率。 12．（25-26高三上·江苏扬州·期中）酿酒酵母液泡膜上的钙离子通道Y蛋白是调控细胞内Ca2+浓度的重要途径之一，科学家用Cre/loxP系统和同源重组法构建Y基因缺失菌株，为后期钙通道功能研究奠定基础。 （1）Cre/loxP系统常用于基因的敲除，原理如图1所示。Cre酶能识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列并定点切断DNA双链，切口被_______酶重新连接后可得到图中1、2两个片段，用______鉴别和分离两者，保留其中的片段_____，可实现目标基因的敲除。 （2）图2为Cre/loxP重组酶系统敲除Y基因的原理和过程。 ①首先以质粒pUG6作为模板运用PCR技术，通过设计引物获得带有KanMX基因及其两 侧loxP序列的Y基因敲除组件，该过程所用引物YF2、YR2的设计依据主要有________的部分DNA序列，以保证获得目标片段，导入酿酒酵母细胞进行同源重组。KanMX基因可对图中细胞进行两次筛选，第一次用于筛选酿酒酵母细胞____（填数字），第二次用于筛选酿酒酵母细胞_______（填数字）。 ②已知选用的酿酒酵母菌株为二倍体，因此研究者获得细胞3后需用同样的方法敲除位于________上的另一个Y基因，最终需通过基因测序的方法检测和验证获得了Y基因双倍体缺失的目标菌株。 （3）图3表示上述实验中一次PCR的流程，其中步骤①的名称为____；步骤③中持续10分钟的操作目的是________；实验中复性温度较高（59℃），其目的是________。 、 【答案】（1）DNA连接 琼脂糖凝胶电泳 2 （2）pUG6和酿酒酵母Y基因的上下游 1、2 3 同源染色体 （3）预变性 使子链充分延伸 降低引物与模板非特异性结合的概率 【解析】基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR技术扩增目的基因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定（DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交）。 （1）Cre酶能识别DNA分子上同向排列的两个相同的loxP序列并定点切断DNA双链，得到两个DNA片段，切口被DNA连接酶重新连接后可得到图中1、2两个片段（其中1片段有目标基因，2片段无目标基因），将两个片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果片段大小即可鉴别和分离两者，保留其中的2片段，即可实现目标基因的敲除。 （2）①首先以质粒pUG6作为模板运用PCR技术，通过设计引物获得带有KanMX基因及其两侧loxP序列的Y基因敲除组件，故该过程设计的引物YF2、YR2，需要根据pUG6和酿酒酵母Y基因的上下游的部分序列进行设计，这样才能确保获扩增得到带有KanMX基因及其两侧loxP序列的Y基因敲除组件的序列，导入酿酒酵母细胞进行同源重组（将酵母细胞中的Y基因替换成KamMX基因）。使用KanMX基因可对图中细胞进行两次筛选，第一次筛选，使用卡那霉素进行筛选，只有成功导入含有KanMX基因及其两侧loxP序列的Y基因敲除组件的序列的酿酒酵母细胞才能生长，也就是可以筛选出酵母细胞1，以及完成同源重组的酵母细胞2。在第一次筛选出的酵母细胞的基础上，将pSH65质粒导入酵母细胞，利用表达出的Cre酶进行敲除KamMX基因，然后再次用卡那霉素进行筛选，在培养基上无法生长的则为酵母细胞3（成功将KamMX基因敲除，也就是敲除了Y基因的酵母细胞），即所需要的菌株。②已知选用的酿酒酵母菌株为二倍体，因此研究者获得细胞3后需用同样的方法敲除位于同源染色体上的另一个Y基因，最终需通过基因测序的方法检测和验证获得了Y基因双倍体缺失的目标菌株。 （3）PCR的步骤包括①预变性95℃下2-5min，使DNA模板完全变性；②变性94-96℃保持30s，将双链DNA加热至高温，使氢键断裂，形成单链DNA，为后续引物结合做准备；③退火45-65℃，降低温度，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；④延伸温度72℃，在DNA聚合酶的作用下，以引物作为起点，以dNTP为原料，按照碱基互补配对原则合成新链。故步骤①是预变性，步骤③中持续10分钟的操作目的是使子链充分延伸；实验中复性温度较高（59℃），其目的是确保引物与模板特异性结合，减少非特异性片段的产生，也就是降低引物与模板非特异性结合的概率。 13．（25-26高三上·江苏中华中学·期中）大豆转录调控因子 Y 蛋白可和某些基因的启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得 Y 基因并将其下游与终止密码子对应序列剔除，再与绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接获得融合基因，成功表达的 Y - GFP 融合蛋白可用于 Y 蛋白调控机理的研究。请回答： （1）研究中需对 Y 基因进行 PCR 扩增：缓冲液中需加入___________以激活耐高温的 DNA 聚合酶；复性的目的是___________。图 1 所示 Y 基因单链（部分）为转录的___________（填“模板链”或“非模板链”）。已知EcoRⅠ识别序列为 5’ - GAATTC - 3’，BamHⅠ识别序列为 5’ - GGATCC - 3’，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使 Y 基因正确接入载体并成功表达出 Y - GFP 融合蛋白，Y 基因下游扩增引物应为 5’ - ___________ - 3’（包括添加的限制酶识别序列，共写 12 个碱基）。 （2）将初步构建的 Y - GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经___________筛选后得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图 2 所示。其中细胞系___________能成功表达出 Y - GFP 融合蛋白。 （3）为探究 Y 蛋白能否与 S 基因（大豆类固醇化合物合成的关键基因）启动子序列结合，用 S 基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图 3 所示。已知 Y 蛋白与 DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白___________（填“能”或“不能”）与 S 基因启动子序列结合，相比于 a 条带，b 条带放射性低的原因是___________。 （4）过表达 Y 基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y 蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是___________。 【答案】（1）Mg2+ 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 非模板链 GGATCCATGTTC （2）潮霉素 2 （3）能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少 （4）Y蛋白（通过与S基因启动子序列结合）促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 （1）PCR反应中，耐高温的DNA聚合酶需要Mg2+作为激活剂才能发挥催化功能。Mg2+可与DNA聚合酶的活性中心结合，稳定酶的空间结构，同时促进引物与模板的结合，保障DNA链的延伸。在PCR扩增过程中，复性的目的是使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合，这是DNA聚合酶能够沿着模板链延伸合成新的DNA链的前提。转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟信使RNA的起始位置是相同的，故图1所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有那个EcoR I和BamH I的识别序列，所以要扩增Y基因的时，引物的5'端是要加上EcoR I和BamH I的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoR I的识别序列，Y基因的右端连接BamH I的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamH I的识别序列，再根据题干信息“在获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'-GGATCCATGTTC-3'。 （2）将初步构建的Y-GFP基因表达载体转入大豆细胞后，需要对经潮霉素筛选得到的细胞系进行抗体检测以确认是否成功表达出Y-GFP融合蛋白。根据图2的电泳结果可以看出，细胞系2在预期位置出现了明显的条带而细胞系1没有，因此可以判断细胞系2能成功表达出Y-GFP融合蛋白。 （3）根据图3的实验结果和已知信息，可以看出Y蛋白与DNA序列结合后，可以在凝胶电泳中产生阻滞条带。而实验组（加Y蛋白）的条带相对于对照组（未加Y蛋白）产生了阻滞，说明Y蛋白能与S基因启动子序列结合。相比于a条带（对照组），b条带（实验组）放射性低的原因是100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少。 （4）根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆固醇类化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。 14．（25-26高三上·江苏连云港·期中）酿酒酵母中ADE2基因发生功能性突变时，会引起腺嘌呤合成缺陷，导致细胞在不含腺嘌呤的培养基中无法生长，中间产物的积累会使酵母细胞呈现红色。为探索ADE2基因与其他基因间相互作用，科研人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术在酿酒酵母中构建了相关基因的敲除突变体，过程如图1所示。请回答下列问题： （1）步骤①需要工具酶________，CRISPR载体中含有________个SapI识别序列（N为任意碱基），人工合成gRNA目标序列中其编码链5′端应添加5′-________-3′以匹配SapI酶切产生的黏性末端（转录方向为gRNA目标序列→gRNA骨架序列）。 （2）CRISPR-Cas9是一种高效的基因组编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白在单链向导RNA（gRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因。 ①应选择目标基因中特异性________（选填“强”“弱”）序列作为gRNA目标序列。 ②CRISPR重组质粒应转化至用________处理的大肠杆菌，转化后的大肠杆菌在添加________的培养基上培养，步骤②的目的是_________。 ③科研人员利用了PCR技术和________技术鉴定酿酒酵母ADE2基因是否被敲除，据图2分析，PCR过程中需要添加的引物为________，若PCR产物与预期大小________bp一致，则说明基因敲除成功。 （3）Cas9蛋白切割使DNA双链断裂后，生物体对DNA双链断裂的修复主要有两种机制：非同源末端连接和同源重组，同源重组需要在酿酒酵母中引入外源模板序列（donor）。图3、4分别为含donor转化组、不含donor转化组及空白转化组（WT）菌落PCR扩增检测结果，结合图2分析，空白对照组转化至酿酒酵母的是________，含donor组则需将CRISPR重组质粒及大小为________bp的模板序列转化至酿酒酵母，结果说明_________。 【答案】（1）限制酶、DNA连接酶 2 ATC （2）强 CaCl2溶液 氨苄青霉素 扩增质粒 （琼脂糖凝胶）电泳 引物b、引物c 849（848） （3）pRS425-Cas9-2×Sap（CRISPR载体） 600 donor的存在显著提高了ADE2的敲除效率 【解析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 （1）步骤①为基因表达载体的构建，构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。据图可知CRISPR载体中含有2个SapI（图中横线画出来的部分）识别序列，CRISPR载体经SapI切割后产生的黏性末端为3'-TAG5'，根据碱基互补配对原则，故人工合成的gRNA目标序列中其编码链5′端应添加5'-ATC-3'以匹配SapI酶切产生的黏性末端。 （2）①Cas9基因表达的Cas9蛋白在单链向导RNA（gRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因，应选择目标基因中特异性较强的序列作为gDNA目标序列，确保定向敲除目的基因。 ②将重组表达载体导入大肠杆菌，应用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之处于感受态细胞的状态（更容易吸收周围DNA分子），转化后的大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，能生在的是含有重组表达的大肠杆菌。将转重组表达载体导入大肠杆菌体内的目的是扩增大量质粒，便于后续从大肠杆菌细胞内提取到大量质粒。 ③将转化成功后的大肠杆菌体内提取出的质粒，根据目的基因（ADE2）两侧的序列进行设计引物b和引物C后进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带大小，若ADE2基因敲除成功，则PCR扩增产物理论上的大小为566590-564026-1716=848bp（即去除了ADE2基因后引物b和c之间的片段大小）。 （3） 空白对照组转化至酿酒酵母即未构建成功 CRISPR重组质粒（即CRISPR载体转化进酿酒酵母细胞内）。同源重组需要在酿酒酵母中引入外源模板序列（donor），根据图2可知两端的模板序列共为600bp，故含donor组则需将CRISPR重组质粒及大小为 600pb的模板序列转化至酿酒酵母菌 。  对比图3和图4可知，图3含有donor组的 ADE2的敲除效率远大于不含donor组，即 donor的存在显著提高了ADE2的敲除效率。                  15．（25-26高三上·江苏徐州·期中）猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是引起仔猪严重腹泻的重要病原体，其S基因（编码含保守A、D抗原位点的纤突蛋白）是研发DNA疫苗的关键靶点。某团队以质粒p-S-His为基础，构建TGEV的DNA疫苗载体过程如图1．请回答下列问题： （1）科研人员从TGEV感染的细胞中提取_____，通过_____过程合成cDNA，再以cDNA为模板扩增S基因的A位点（513bp）、D位点（619bp），扩增时需在引物的5′端添加酶切位点，目的是_____，模板与引物在PCR反应的_____阶段开始结合。 （2）据表1和表2分析，将A位点与p-S-His用BamHⅠ和_____双酶切后使用_____连接，产物利用PCR及电泳技术鉴定，选取_____的片段进行测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为p-S（A）-His，保存备用。 表1  S基因A位点、D位点扩增引物序列 引物 序列（5′—3′） P1 CGCGGATCCATGTTAGTTACCAAACAGCCGT P2 CCGGAATTCTATTGTCCAGAAAACGTCAC P3 CCGGAATTCAAGTTGAAAACACAGCTATT P4 TGCTCTAGAACTATTATCAGACGGTACACC 表2  限制酶及识别序列 限制酶 识别序列 BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′ EcoRⅠ 5′-G↓AATTC-3′ XbaⅠ 5′-T↓CTAGA-3′ （3）p-S（A-D）-His能实现A、D位点有序融合的原因是_____。 （4）对构建的p-S（A-D）-His进行完全酶切并电泳检测，结果如图2，其中泳道_____为双酶切的结果。 （5）依据构建p-S（A-D）-His的相同方法，构建出p-N-His重组质粒，利用不同疫苗载体单独或联合免疫小鼠后，血清中抗体（IgG）水平如表3．组别4的作用是_____；根据实验结果，选取疫苗载体投入使用时，最好选取组别_____中的疫苗载体。 表3  免疫小鼠抗TGEV血清IgG水平（OD450nm） 组别 疫苗载体种类 0天 14天 28天 42天 1 p-S（A-D）-His 0．133 0．218 0．243 0．401 2 p-N-His 0．138 0．244 0．344 0．504 3 p-S（A-D）-His+p-N-His 0．142 0．225 0．300 0．471 4 p-S-His 0．134 0．144 0．141 0．139 【答案】（1）总（或m）RNA 反转录（或逆转录） 使目的基因与（线性化）载体（定向）连接 复性（或退火） （2）EcoRⅠ DNA连接酶 大小与预期相符 （3）质粒p-S（A）-His含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点；D位点上游含有EcoRⅠ酶切位点，下游含有XbaⅠ酶切位点（，双酶切确保方向正确）（或质粒p-S（A）-His和D位点都含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点） （4）2 （5）作为空白对照 2 【解析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 （1）目的基因S基因位于病毒RNA上，需先提取感染细胞中的总RNA（或mRNA）作为模板。 以RNA为模板合成cDNA的过程是反转录（逆转录），需逆转录酶催化。引物5′端添加酶切位点，可使扩增的目的基因两端产生特定黏性末端，便于与同样酶切的载体定向连接。PCR反应中，复性（退火）阶段温度下降，引物与模板互补序列结合。 （2）A位点扩增引物P1含BamHⅠ酶切位点（序列中CGCGGATCC），P2含EcoRⅠ酶切位点（CCGGAATTC），故需用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切。 酶切后的目的基因与载体片段，需通过DNA连接酶连接形成重组质粒。 PCR及电泳鉴定时，只有片段大小与预期（载体长度+A位点513bp）一致，才可能是正确的重组质粒，需选取此类片段测序。 （3）质粒p-S（A）-His经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后，会产生特定末端。D位点扩增引物P3含EcoRⅠ酶切位点、P4含XbaⅠ酶切位点，双酶切后产生的末端可与质粒对应末端互补，且避免反向连接，实现有序融合。 （4）双酶切会将重组质粒p-S（A-D）-His切成载体片段和A-D融合片段（513bp+619bp≈1132bp）。电泳图中，泳道2出现两个条带，符合双酶切的片段分离结果，而其他泳道可能为单酶切（1个条带）或未酶切（1个大分子条带）。 （5）组别4使用的p-S-His未插入A、D位点，可排除载体本身对免疫反应的影响，作为对照验证目的基因的免疫效果。表3中，组别2（p-N-His）在14天、28天、42天的IgG水平均最高，说明其诱导产生抗体的能力最强，最适合投入使用。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $