内容正文:
第2章 细胞工程
2.1 植物细胞工程
2.2 动物细胞工程
2.3 胚胎工程
细胞工程
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法,通过细胞器、细胞或组织水平上的操作,有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
原理和方法
操作水平
目的
分类
细胞生物学、分子生物学和发育生物学
细胞器、细胞或组织
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
动物细胞工程和植物细胞工程
第2章 细胞工程
第1节 植物细胞工程
科技探索之路
1902年,哈伯兰特(G.Haberlandt,1854一1945)提出了细胞全能性的理论,但相关的实验尝试没有成功。
1958年,斯图尔德(EC.Steward,1904一1993)等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚,为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年,科金(E.C.Cocking,1931一)用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁,成功获得了原生质体。
1964年,古哈(S.Guha,1938-2007)等在培养毛曼陀罗的花药时,首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1971年,卡尔森(PS.Carlson,1944一2017)诱导烟草种间原生质体融合,获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1974年,土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后,该质粒应用于植物分子生物学领域,促进了植物细胞工程与分子生物学技术紧密结合。
植物细胞工程的发展历程
第2章 细胞工程
第1节 植物细胞工程
情境导入
鬼兰(幽灵兰)
兰花种子通常发育不全,在自然条件下萌发率极低;传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题,如果靠自然繁殖,兰花的价格可想而知了。
1.如何让它大量、快速地繁殖呢?
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。
2.为什么植物组织或细胞能培养成完整植物体?
细胞的全能性
1 概念:细胞经分裂和分化后,仍具有产生完整生物体或分化成
其他各种细胞的潜能。
探究一.细胞的全能性
2.体现全能性的标志:
种子发育成植株,体现了植物种子的全能性。( )
胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株。( )
受精卵发育成个体。( )
胚胎干细胞分化成其他种类的细胞。( )
×
√
√
√
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
3.植物细胞具有全能性的原因:
一般来说,生物体的每一个细胞都含有控制该生物发育为完整个体所需的全套遗传信息。
一、植物细胞的全能性
1、细胞全能性的概念:
细胞经过分裂和分化后,仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞(该有机体所有类型的细胞)的潜能。
2、体现全能性的标志:
细胞→完整个体或其他各种细胞
3、体现全能性的实例:
①胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
②受精卵发育成个体(动植物)
③用一片叶子、一粒花粉繁殖出新的植株
④蜜蜂卵细胞发育成雄峰
一、植物细胞的全能性
4、细胞具有全能性的根本原因:
每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。
5、生物体生长发育过程中,并不是所有细胞都表现出全能性
a. 不体现全能性的实例:
芽/叶原基只能发育为芽/叶
b. 不体现全能性的原因:
基因在特定时间、空间
条件下选择性表达
①受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞
>体细胞;
②植物细胞>动物细胞。
细胞分化程度越高,细胞分裂能力越弱;细胞全能性越低。
一、植物细胞的全能性
6、细胞全能性大小比较:
体现全能性的标志:
种子发育成植株,体现了植物种子的全能性。( )
胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株。( )
受精卵发育成个体。( )
胚胎干细胞分化成其他种类的细胞。( )
×
√
√
√
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
芽原基只能发育为芽,叶原基只能发育为叶。( )
×
一、植物细胞的全能性
思考:
没有,植物种子种的胚已完成了早期发育,相当于新植物体的幼体,没有体现出细胞具有发育成完整植株的潜能。
11
一、植物细胞的全能性
思考:
是不是所有的活细胞都具有全能性?
不是,例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞无细胞核,无遗传物质。
②细胞具有的全能性一定能表现出来吗?
不一定,例如动物的体细胞
7.表现出全能性的条件:
1958年Steward利用胡萝卜韧皮部诱导分化产生了胚状体,这是人类第一次获得了人工胚状体,并获得个体植株。
①
离体
②
一定的营养物质、植物激素
③
适宜的温度、pH等外界条件
④
无菌环境
——植物组织培养技术
为什么一定要离体才能表现出全能性?
若细胞不离体,细胞中的基因会选择性地表达,从而形成生物体的不同组织和器官,不能表现出全能性。
一、植物细胞的全能性
二、植物细胞的全能性
①选取多肉上健康、饱满的叶片。
②用剪刀切下整片叶片,切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。
③平躺放在沙床上,叶片间隔相聚2~3厘米。
④叶片切口不要有碰脏,摆放通风处2~3天,晾干。
⑤待叶片晾干后移至半阴处养护。
⑥约2~3周后生根,或从叶基处长出不定芽。
⑦叶插成功
多肉进行叶插繁殖
二、植物组织培养技术的过程
植物通常是通过播种或扦插实现繁殖的。
玉米种子萌发
黄豆种子发芽
落地生根
二、植物组织培养技术的过程
1.概念:指将离体的植物器官、组织或细胞等,培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱导其形成完整植株的技术。
外植体
外植体:在植物组织培养过程中,从植物体上被分离下来的,接种在培养基上供培养用的原生质体、细胞、组织、器官等。
有丝分裂
无性生殖
植物细胞的全能性
2.生殖方式:
3.分裂方式:
4.原理:
二、植物组织培养技术的过程
5.过程:
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
芽、根
试管苗
移栽
完整植株
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化
再分化
再分化
培养条件:
①离体、无菌
②一定的营养、植物激素
③适宜环境条件(温度、PH、光照等)
根、芽
植物体
脱分化
再分化
如:菊花幼嫩的茎段、胡萝卜的形成层、月季的花药…
遮光
一定的光照
芽发育成叶,叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
排列不规则,高度液泡化,
无叶绿体,不定形的薄壁细胞
愈伤组织
离体的植物器官、组织或细胞(外植体)
已分化的细胞失去特有结构和功能,转变成未分化的细胞
植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。生长素和细胞分裂素的比例和浓度都会影响植物细胞的发育方向。
愈伤组织
愈伤组织重新分化为芽、根等器官
探究·实践 菊花的组织培养
1.原理
生长素/细胞分裂素 结果
比值高(>1)
比值低(<1)
比值适中(=1)
有利于根的分化,抑制芽的形成
有利于芽的分化,抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
简记为:“高”根,“低”芽,“中”愈伤
脱分化与再分化的比较
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
脱分化
再分化
脱分化 再分化
过程
分裂、分化
结果
需要条件
有分裂,无分化
有分裂,有分化
形成愈伤组织
形成根、芽
a.离体、适宜的营养
c.生长素与细胞分裂素的比例适中
d.一般不需光(有光易形成维管组织,不易形成愈伤组织)
a.离体、适宜的营养
c.生长素与细胞分裂素的比例高生根或低生芽
d.光照(诱导叶绿素的合成,使试管苗能够进行光合作用)
外植体→愈伤组织
愈伤组织→幼苗
拓展:植物组织培养的两种途径
器官发生途径
胚状体途径
胚状体:离体培养条件下,没有经过受精过程,但经过胚胎发育过程形成的胚状类似物,因而统称为体细胞胚或胚状体。
(移栽到大田)
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
生芽生根
或胚状体
生长发育
试管苗
幼嫩的菊花茎段、体积分数70%的酒精,质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液和无菌水,50mL锥形瓶(或植物组织培养瓶)。植物组织培养常用的培养基:MS培养基 ( P116)。
分裂旺盛,更容易诱导形成愈伤组织。
二、植物组织培养技术的过程
2.材料用具:
1)培养基名称: ;
2)物理性质: ;
3)碳源: 。
MS培养基
固体培养基
有机碳源(蔗糖)
提供能量,调节渗透压
灭菌方法:
湿热灭菌法
①双手和超净工作台台面:
用酒精擦拭
②外植体:
流水冲洗→酒精消毒30s→立即用无菌水清洗2~3次→次氯酸钠溶液处理30min→立即用无菌水清洗2~3次。
将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中→用无菌滤纸吸去表面的水分→用解剖刀将外植体切成0.5~1cm长的小段。
3.方法步骤
①外植体消毒
②外植体切段
防止杂菌生长。①杂菌与培养物竞争营养;②产生有害物质危害培养物。
二、植物组织培养技术的过程
在酒精灯火焰旁,将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口,并在培养瓶上作好标记。
注意:接种时注意外植体的方向,不要倒插!
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。在培养过程中,定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
注意:该过程一般不需要光照,有光易形成维管组织,不易形成愈伤组织。
③接种外植体
④诱导愈伤组织(脱分化)
愈伤组织
培养瓶用专用封口膜封口的目的是防止杂菌污染
培养15~20d后,将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上→长出芽后→将其转接到诱导生根的培养基上,进一步诱导形成试管苗。
注意:注意顺序,先诱导生芽,再诱导生根;该过程每日需要给予适当时间和强度的光照!
⑤诱导芽和根(再分化)
⑥移栽
叶绿素的生成需要光
移栽前先打开封口膜或瓶盖,让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后,将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况,适时浇水、施肥,直至开花。
组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石比较松软,持水性也较好,有利于幼苗的生根和叶片的生长
固体基质型,含水量高、
蓄水性强、透性好,适合栽培
珍珠岩,是一种火山喷发的酸性熔岩,经急剧冷却而成的玻璃质岩石,有弧形或圆形裂隙,如珍珠的结构,所以被命名为珍珠岩。
蛭石,是一种天然、无毒的矿物质,在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物,属于硅酸盐。
二、植物组织培养技术的过程
注意事项:
①实验中使用的培养基和所有器械都要灭菌,接种操作必须在酒精灯火焰旁进行,并且每次使用后的器械都要灭菌。
②对外植体进行表面消毒时,既要考虑药剂的消毒效果,又要兼顾植物材料对药剂的耐受性。
③接种时注意外植体的方向(形态学上下端),不要倒插。
④诱导愈伤组织期间一般不需要光照,在后续的培养过程中,每日需要给予适当时间和强度的光照。
脱分化避光,再分化需光。
1.接种3-4d后,检查外植体的生长情况,统计有多少外植体被污染,试分析它们被污染的可能原因。
2.你培养出愈伤组织了吗?从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天?愈伤组织进一步分化出芽和根了吗?
3.培育的试管苗能直接移栽到露地吗?应如何操作?
外植体消毒不彻底;培养基、接种工具灭菌不彻底;
操作过程不符合无菌操作要求等。
2周左右
试管苗移栽的关键:既要充分清洗根系表面的培养基,又不能伤及根系。一般使用无土栽培方法。培养基质要提前消毒,可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾,并用塑料薄膜覆盖12h,掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天,待其长壮后再移植到大田或盆中。
结果分析与评价
13
三、植物组织培养技术的过程
离体的植物器官、组织或细胞(外植体)
如:胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…
脱分化
愈伤组织
失去特有结构和功能转变成未分化的细胞
排列不规则,高度液泡化,呈不定型状态的薄壁细胞
根、芽
植物体
再分化
培养条件:①无菌②营养物质③适宜条件(温度、PH、光等)
④植物激素:
遮光
光照
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键。生长素和细胞分裂素的比例和浓度会影响植物细胞的发育方向。
芽发育成叶,叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
愈伤组织重新分化为芽、根等器官
二、植物组织培养技术的过程
继续探究:
若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响,则应如何设计对照实验?
① 空白对照:不加任何激素;
② 实验组1:生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1;
③ 实验组2:生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1;
④ 实验组3:生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
生长素用量与细胞分裂素用量的比值 结果
比值高 有利于根的分化,抑制芽的形成
比值低 有利于芽的分化,抑制根的形成
比值适中 促进愈伤组织的形成
离体
无菌
一定的营养、激素
适宜的外界条件(温度、pH、光照等)
外植体
愈伤组织
根、芽或胚状体
试管苗
脱分化
再分化
黑暗
光照
水
琼脂
有机物
无机物
植物激素
蔗糖:提供能量、调节渗透压。
植物激素:主要是生长素和细胞分裂素。
课堂小结
1.下列关于细胞全能性的叙述,正确的是( )
A.乳腺癌细胞易于进行离体培养,说明其全能性比较高
B.细胞具有全能性是因为细胞内含有发育所需的全套遗传物质
C.只要是植物体的活细胞,任何条件下都能表达出全能性
D.植物体只有分生区细胞具有全能性,其他部位细胞没有全能性
小试牛刀
B
2.如图为烟草植物组织培养过程的示意图。下列有关叙述正确的是( )
A.对过程①获取的根组织块应做较彻底的灭菌处理
B.过程②应使用适宜的培养基,在有光环境中进行
C.过程③发生脱分化,其实质是基因的选择性表达
D.从根组织块到幼苗形成的过程说明植物根细胞具有全能性
D
1.A、B过程分别为 。C是 。
A过程细胞分裂方式是 ,
B过程细胞分裂方式是 ,同时也进行 。
A过程一般 光照;B过程需要光照,因为 。
2.影响A、B过程的关键因素是 ,主要是 和 ,二者添加的 会影响脱分化和再分化过程。
3.植物组织培养是一个 过程。(填“无性繁殖”、“有性繁殖”)
植物体
根、芽或胚状体
外植体
脱分化
再分化
有丝分裂
细胞分化
植物激素
细胞分裂素
生长素
无性繁殖
A B
有丝分裂
浓度及比例
【练习】下列是植物组织培养流程图,请回答:
C
脱分化、再分化
愈伤组织
不需要
叶绿素的合成需要光照
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思考: 欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么好妙招?
1.通过有性杂交能实现吗?为什么?
不能,不同种物种间存在生殖隔离。
植物体细胞杂交技术。
2.有没有方法可以打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,获得“番茄-马铃薯杂种植株”呢?
设想
三、植物体细胞杂交技术
1.植物体细胞杂交的概念:
植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞,在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
2.原理:
细胞膜具有一定的流动性(原生质体融合)
植物细胞的全能性(杂种细胞培养成杂种植株)
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
去壁
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
诱融
物理法:
化学法:
电融合法、离心法等
聚乙二醇(PEG)融合法等
脱分化
再分化
移栽
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
去壁
原生质体融合成功的标志
植物体细胞杂交完成的标志
3. 过程:
关键环节
酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇,目的是 .
维持渗透压,防止原生质体吸水过多而涨破
植物体细胞杂交
植物组织培养
植物细胞融合
(植物细胞的全能性)
(细胞膜的流动性)
原生质体制备:
用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁,得到原生质体。
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
原生质体:
指的是脱去细胞壁的细胞。
动物细胞也可看做是原生质体。
原生质层:
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质。
原生质层不包含细胞液和细胞核
三、植物体细胞杂交技术
原生质体间的融合
获得的所有细胞一定是需要的杂交细胞吗?
未融合的细胞:A、B
两两融合的细胞:AA、BB、AB
多细胞融合体
需要进一步筛选AB
A
B
根据植株性状对杂种植株进行筛选
三、植物体细胞杂交技术
【典例】(2023·广东,12)人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是( )
A.细胞融合前应去除细胞壁
B.高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合
C.融合的细胞即为杂交细胞
D.杂交细胞可能具有生长快速的优势
C
融合的细胞中有人参根-人参根细胞、人参根-胡萝卜根细胞、胡萝卜根-胡萝卜根细胞,只有人参根-胡萝卜根细胞才是杂交细胞
三、植物体细胞杂交技术
打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种。
5. 意义:
4.两个标志:
(1)植物细胞融合完成的标志:
再生出新的细胞壁
(2)植物体细胞杂交完成的标志:
培育成新植物体
三、植物体细胞杂交技术
A为2a=20
B为2b=30
生殖类型
变异类型
染色体数
染色体组数
基因组成
无性繁殖,育种过程中不遵循孟德尔定律
染色体数目变异
两亲本染色体数之和。2a+2b
两亲本染色体组数之和。2+2
两亲本基因型之和。AaBbCcDd
6. 植物体细胞杂交技术的实例
①培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种植株。
②在木本植物的体细胞杂交方面,培育出了多种柑橘属不同种间的杂种植株。
仍有许多理论与技术问题没有解决,还不能让杂种植株表现出人们所需要的所有性状。
若亲本植株可育,则杂种植株可育。杂种植株是不同于亲本的新物种。
体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞。
不管染色体、基因组成还是染色体组都是两亲本之和。
思考:为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样,地上长番茄、地下结马铃薯?
生物体内基因的表达不是孤立的,它们之间是相互调控、相互影响的。
杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质,但是这些遗传物质的表达相互干扰,它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达。
2.若植株A和植株B细胞结构如图所思,A有X条染色体,B有Y条染色体,通过植物细胞融合技术获得杂种细胞AB,则:
①杂种细胞的染色体数为______
②杂种细胞的基因型为__________
③杂种细胞中染色体组数为________
④得到的杂种植株为____倍体
⑤理论上该植株可育吗?___________________________
X+Y
DdYyRr
4
四
可育,有同源染色体,同源染色体能联会,
可形成配子
*异源四倍体
3.如图为A、B两种二倍体植物体细胞杂交过程示意图,请据图回答下列问题:
(1)步骤①采用的方法是________。步骤②常用的化学试剂是__________,之后________(填“需要”或“不需要”)筛选杂种细胞。
(2)在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中,运用的技术手段是________,其中步骤④是__________________。植物体细胞杂交的目的是获得新的杂种植株,与A、B两种植物相比,该杂种植株是新物种的原因是_____________________________________________________。
(3)培育该杂种植株的过程中,遗传物质的传递是否遵循孟德尔遗传规律?为什么?________________________________________。
酶解法
聚乙二醇(PEG)
需要
植物组织培养技术
脱分化
该杂种植株与A、B两种植物间均存在生殖隔离
不遵循,该过程不属于有性生殖
植物组织培养 植物体细胞杂交技术
所属范畴
原理
步骤
意义
联系
无性繁殖
植物细胞的全能性
①脱分化
②再分化
保持优良性状,
繁殖速度快
植物体细胞杂交技术应用了植物组织培养技术
克服不同种生物远缘杂交的障碍
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③组织培养
细胞膜的流动性、植物细胞全能性
染色体变异、基因重组
植物组织培养 vs 植物体细胞杂交
网络构建
植物体细胞的杂交技术
植物细胞工程的基本技术
去除细胞壁
再生细胞壁
纤维素酶果胶酶
植物细A、B
原生质体A、B
融合的原生质体
杂种细胞
原理:植物细胞的全能性
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
(根、芽)
完整植株
物理法:
化学法:
电融合法、离心法等
聚乙二醇(PEG)融合法等
菊花的组织培养技术
愈伤组织
脱分化
杂种植株
再分化
植物组织培养技术
流程
课后训练
1)植物体的任何细胞都具有全能性,也都能表现出全能性( )
2)在植物组织培养时,对外植体要进行灭菌处理( )
3)若用菊花茎切段作为外植体,应将其形态学上端插入诱导愈伤组织的培养基中( )
4)诱导生芽的培养基和诱导生根的培养基完全一样( )
5)植物体细胞杂交技术的目的是获得杂种细胞( )
6)植物体细胞杂交利用了植物组织培养技术( )
7)利用物理法或化学法可以直接诱导两个植物细胞融合( )
8)获得原生质体时,应在低渗溶液中进行( )
×
×
×
×
×
不一定表现
消毒
不能倒插
不完全一样
获得杂种植株
√
×
先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
×
应在等渗或高渗溶液进行,防止细胞吸水涨破
练习应用
一、概念检测
1.下图是利用甲、乙两种植物的各自优势,通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐环境中
A
四
2. 科学家在制备原生质体时,有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析,蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分?
二、拓展应用
“番茄-马铃薯”杂种植株没有如科学家所想象的那样,地上结番茄,地下长马铃薯,这是为什么?
纤维素酶和果胶酶
"番茄—马铃薯"没有像人们预想的那样地上结番茄、地下长马铃薯,主要原因是∶生物体内基因的表达不是孤立的,它们之间是相互调控、相互影响的,所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质,但这些遗传物质的表达相互干扰,它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达,杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
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