模块综合检测04 生物技术与工程（上海专用）2027年高考生物一轮复习讲练测

### 基本信息 以生物技术工程全流程为核心，整合基因工程、细胞工程、发酵工程等模块，通过科研情境串联工具酶选择、载体构建、表达调控等关键技术，突出科学思维与探究实践的综合应用。 ### 综合设计 |模块|题量/典例|题型特征|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |基因工程|5题（如1、2、4、5、9）|结合限制酶切割、载体构建、CRISPRi等技术，考查图表分析与逻辑推理|从工具酶作用原理到基因表达调控网络，构建“目的基因获取-载体构建-转化筛选-功能验证”完整链条| |细胞工程|2题（如7、9）|聚焦CAR-T细胞培养、单克隆抗体制备，涉及细胞培养条件与免疫排斥问题|以细胞操作技术为基础，关联细胞代谢与免疫调节的生命观念| |发酵工程|3题（如2、5、8）|围绕工程菌构建、培养基优化、发酵条件控制，强调产量提升的调控策略|遵循“菌种改造-培养条件优化-产物检测”工业流程，体现物质与能量观|

综合训练 生物技术与工程 答案 1．【答案】(1)bd (2) Ca2+（或氯化钙） 氨苄青霉素 (3) 将SLA-2基因和嘌呤霉素抗性基因（Puro）连接在同一载体上，以便转染猪肾上皮细胞后利用嘌呤霉素筛选稳定高表达细胞株 964 (4)无菌无毒的环境、95%空气和5%CO2的气体环境（或定期更换培养液、控制气体环境） 2．【答案】(1) 持续的2'-FL合成影响了菌体正常生长 pfkA基因高表达，futC基因低表达 (2) 37℃时荧光强度高于30℃ 持续表达型 37℃时荧光强度低于30℃ (3) futC基因 pfkA 3．【答案】(1)Bt毒蛋白与肠上皮细胞的受体蛋白结合，导致细胞膜穿孔，破坏了细胞膜的完整性，细胞结构受损并死亡。 (2) 下降 GATAe基因表达下降，导致ABCC2受体减少，Bt毒蛋白与靶细胞结合减少，膜穿孔减少，因此棉铃虫死亡率下降。 (3) 引物F2-F（质粒） 保证目的基因和线性化质粒的正向连接 (4)GATAd与GATAe对ABCC2基因启动子的调控存在竞争关系，且GATAd抑制GATAe对ABCC2基因表达的促进作用。 (5)抑制GATAd基因的表达（敲除GATAd基因，降低GATAd的表达水平）；过表达GATAe基因；过表达ABCC2基因。 4．【答案】(1) ② ① ④ (2)D (3)A (4)D (5) 1和3 1178 (6)ABD (7) ② ① (8) 不足：目的基因位于质粒上，质粒容易丢失，导致工程菌丢失目的基因，CP43K表达能力下降，性状不稳定；工程菌可能逃逸到自 然环境中，目的基因可能通过水平转移扩散到其他微生物，引发生态安全风险 优化建议：将CP43K基因整合到工程菌的拟核（基因组）DNA中，避免质粒丢失，提升稳定性；在工程菌中引I入条件致死“自杀开 关”，使工程菌离开肠道特定环境后会启动凋亡，避免工程菌扩散；或改造工程菌为营养缺陷型，使其只能在肠道特定条件下存活， 防止逃逸 5．【答案】(1) 2 288 (2)A (3)AC (4)D (5) ②③ ①③ (6)①③ (7)据表可知，从高丝氨酸和菌体密度相对值看，发酵罐内单个菌的发酵能力更强。原因，可能发酵罐内置搅拌器，有利于培养基与菌体充分接触，微生物生存条件；也可能发酵罐可以及时控制微生物代谢废物，不会影响微生物代谢。 6．【答案】(1)①②④ (2)BC (3)B (4)①②④ (5)AscI (6)ABD (7) ① ④ 7．【答案】(1)D (2)B (3) (4)ABD (5)A (6)AB (7)D (8)ABC (9)合理，理由是改造糖基转移酶活性可减少 “糖盾⁺”，降低 CAR-T 细胞的免疫原性，减轻免疫排斥。 8．【答案】(1)B (2)①④⑤ (3)D (4)①③ (5)i  在大肠杆菌增殖时，该基因的表达可促进三羧酸循环，为DNA复制、细胞分裂等生命活动供应更多能量 ii  在大肠杆菌增殖减缓时关闭该基因，将更多PEP导向与PHE合成有关的反应，有利于PHE产量增加 (6)②③④ (7)→①→④→⑥→③→②→            →⑤→/→①→⑥→③→②→④→            →⑤→ 9．【答案】(1)B (2)③→①→②→⑤ (3)BC (4) 聚合 乙 (5) ②③ ② (6) 显微注射法 红色 (7)ABD (8)①④ (9)①山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠乳腺细胞中作用效果不理想，抗体表达量低；②融合基因表达正常，但小鼠乳腺细胞无高效的针对其运输及分泌机制：③融合基因被某些化学基团修饰，阻碍转录的发生；④融合基因正常转录，但融合基因 mRNA 因 RNA 干扰而被切割 10.【答案】（1） 琼脂 稀释涂布法 （2）AD （3）腐烂的柑橘 （4）优点：桔梅奇酵母菌悬液不会使病原菌产生抗性，且易降解，同时对人体和环境不会造成危害缺点：成本高，生产工艺复杂，生物制剂保质期短，效果稳定性不高 （5）+++ -- （6）⑥=⑦<⑧ （7）原油污染土壤 （8）B （9）Csp45I和XbaI （10）两个重组质粒酶切后分别产生5144bp、1254bp和4768bp、1254bp，说明两个重组质粒中都有长度约为1300bp的bdlA基因 （11）目标菌A （12）36hKT2和KT5的生物被膜总量显著高于原目标菌A，且KT5总量高于KT2，12h和24h三者的生物被膜总量没有显著差异 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 综合训练 生物技术与工程 姓名：___________班级：___________考号：___________ 1．白细胞表面抗原2（SLA-2）在抗原呈递、器官移植以及免疫应答方面有着重要作用。为进一步研究SLA-2的结构与功能，科研人员以能稳定传代的猪肾上皮细胞为材料，构建了稳定高表达SLA-2基因的细胞株，过程如图。其中，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Puror为嘌呤霉素抗性基因，BclⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶酶切位点，括号内数值表示距复制原点的长度。请回答下列问题。 限制酶 BclⅠ NotⅠ XbaⅠ Sau3AⅠ 识别序列及切割位点 T↓GATCA GC↓GGCCGC T↓CTAGA ↓GATC (1)为使获得的SLA-2基因与质粒1定向连接构建基因表达载体，扩增SLA-2基因时应选用的引物为______。 a．5′-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC-3′ b．5′-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC-3′ c．5′-GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC-3′ d．5′-GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC-3′ (2)过程②的大肠杆菌常用__________处理，使其易吸收重组后的质粒1，然后采用含__________的平板筛选。 (3)构建重组质粒3的目的是__________。为鉴定与验证重组质粒3，研究人员用NotⅠ和Sau3AⅠ完全酶切质粒2和重组质粒3后电泳并比较。结果如图，推测图中电泳条带X的长度为__________bp。 (4)培养的稳定高表达SLA-2基因的猪肾上皮细胞株需满足的条件有适宜的营养、温度、pH和渗透压和__________（答出2点即可）。 【答案】(1)bd (2) Ca2+（或氯化钙） 氨苄青霉素 (3) 将SLA-2基因和嘌呤霉素抗性基因（Puro）连接在同一载体上，以便转染猪肾上皮细胞后利用嘌呤霉素筛选稳定高表达细胞株 964 (4)无菌无毒的环境、95%空气和5%CO2的气体环境（或定期更换培养液、控制气体环境） 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、动物细胞培养技术 【详解】（1）引物之间不能进行配对，引物需与经内切酶剪切过的黏性末端互补配对，为防止基因发生自身环化和反向链接，需要双限制酶切，经分析表格中相关内切酶的切割位点和引物序列，氨苄青霉素抗性基因可被BclⅠ识别，应在剩下的3种酶中选择，依据选项所给序列结合3种限制酶的识别序列可知，BclⅠ酶能识别切割的序列Sau3AⅠ均能识别且切割，故应选择XbaⅠ和NotI两种限制酶，为使SLA-2基因与质粒1定向连接，应在引物5'端分别引入XbaⅠ和NotⅠ切位点（质粒1上对应酶切位点）。引物b含XbaI位点，引物d含NotI识别序列（GCGGCCGC），可保证基因定向插入。引物a含Sau3AⅠ识别序列（GATC），c含BclI和Sau3AⅠ序列。 （2） 重组质粒转化处于感受态的大肠杆菌，常用Ca2+（或氯化钙）处理大肠杆菌，其易吸收重组后的质粒。质粒含有氨苄青霉素抗性基因，则转化后采用含氨苄青霉素的平板筛选。 （3）构建重组质粒3的目的是将SLA-2基因和嘌呤霉素抗性基因（Puro）连接在同一载体上，以便转染猪肾上皮细胞后利用嘌呤霉素筛选稳定高表达细胞株。基因位于启动子与终止子之间才能正常表达，所以过程⑤需将SLA-2基因插入启动子与终止子之间。根据酶的识别序列可知，Sau3AⅠ也能切割BclⅠ所识别的序列，则用NotⅠ和Sau3AⅠ完全酶切质粒2后获得的序列为964（2273-1310+1=964bp）、178(2450-2273+1=178bp)、3303(4445-964-178=3303bp)，根据电泳图谱可知，分子量越大的片段，迁移速率越慢，跑得越近，故电泳条带X的长度为964bp。 （4）动物细胞培养需满足无菌无毒、适宜温度pH渗透压、95%空气和5%CO2的气体环境（或定期更换培养液、控制气体环境） 2．生物制造是推动我国高质量发展的重要新质生产力。2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）是一种具有改善肠道健康等功能的婴儿配方食品成分。我国科学家通过基因工程技术动态调节枯草芽孢杆菌的代谢过程，提高2'-FL的产量。回答下列问题： (1)已知futC和pfkA分别是2'-FL合成和菌体生长的关键基因（图）。研究人员构建了持续高表达futC基因的枯草芽孢杆菌并进行发酵实验，结果显示2'-FL产量较低，推测原因很可能是________________。因此，理想的合成过程为：前期两种基因的表达状态是________，待菌体数量达到一定值后两种基因的表达正好相反，从而实现2'-FL的高产。 注：枯草芽孢杆菌本身不含futC基因，需外源导入。 (2)为了实现2'-FL的高产，研究人员利用温度作为“开关”来动态调控相关代谢基因的表达，并由此构建了质粒1和质粒2（图），利用荧光蛋白基因进行功能测试。 ①构建质粒1的目的是实现基因的温控激活。在30℃时，C蛋白结合至温度诱导型启动子，使RNA聚合酶无法结合到该区域；37℃时，C蛋白失活下游基因启动表达。若在测试过程中观察到_______________，说明质粒1构建成功。 ②质粒2的CRISPRi系统中，人工设计的crRNA（一种RNA分子）可通过碱基互补配对识别靶基因，crRNA能够与红色荧光蛋白基因碱基互补配对，引导dCpfl蛋白结合并抑制靶基因转录。利用由启动子P2驱动的红色荧光蛋白基因测试质粒2的功能。图1中P1为温度诱导型启动子、P2应为_____________型启动子（温度诱导/持续表达）。若在测试过程中观察到___________，说明质粒2构建成功。 (3)在实际生产中如果想要实现高温下2'-FL的高产，需要将测试完成的质粒1和质粒2中的基因进行替换，质粒1中将绿色荧光蛋白基因替换为_____________，质粒2中将靶向红色荧光蛋白基因的crRNA基因替换成靶向_____________基因的crRNA基因。 【答案】(1) 持续的2'-FL合成影响了菌体正常生长 pfkA基因高表达，futC基因低表达 (2) 37℃时荧光强度高于30℃ 持续表达型 37℃时荧光强度低于30℃ (3) futC基因 pfkA 【知识点】遗传信息的转录、基因表达载体的构建 【详解】（1）从代谢路径图可以看到，持续高表达futC基因，会与pfkA基因竞争中间体，导致菌体生长所需的中间体不足，菌体生长受抑制，菌体数量不足，最终2'-FL总产量较低。要实现高产，需要分两个阶段，前期：需要让菌体快速生长、积累足够的生物量，因此需要pfkA基因高表达，futC基因低表达，让中间体优先用于菌体生长，保证菌体数量达到一定水平。后期：菌体数量足够后，需要让中间体优先用于2'-FL合成，因此futC基因高表达，pfkA基因低表达，实现2'-FL的高产。 （2）①质粒1中，C基因由持续表达型启动子驱动，持续合成C蛋白；绿色荧光蛋白基因由温度诱导型启动子驱动。30℃时，C蛋白结合至温度诱导型启动子，会空间竞争性结合，使RNA聚合酶无法结合到该启动子区域，绿色荧光蛋白基因不表达；37℃时，C蛋白失活，下游温度诱导型启动子激活，RNA聚合酶结合启动子，启动绿色荧光蛋白基因表达。因此，若测试成功，会观察到：37℃时荧光强度高于30℃。 ②CRISPRi系统的功能是抑制靶基因转录，需要可调控的启动子来控制该系统的表达，从而实现对靶基因的动态抑制。质粒1用了温度诱导型启动子实现温控，因此质粒2中，CRISPRi系统的启动子P1，应与质粒1的绿色荧光蛋白基因启动子类型一致，为温度诱导型；红色荧光蛋白基因由启动子P2驱动，用于测试质粒2功能，P2应为持续表达型。30℃时，CRISPRi系统不表达，红色荧光正常发光；37℃时，CRISPRi系统表达，抑制红色荧光蛋白基因的转录，红色荧光消失/减弱。因此，若构建成功会观察到：37℃时荧光强度低于30℃。 （3）前期需要pfkA高表达、futC低表达，后期需要futC高表达、pfkA低表达。质粒1的功能是温控激活基因表达，因此将绿色荧光蛋白基因替换为futC基因；质粒2的CRISPRi系统功能是温控抑制基因表达，因此需要将crRNA基因的靶基因改为pfkA基因，即靶向红色荧光蛋白基因的crRNA基因替换成靶向pfkA基因的crRNA基因。 3．Bt毒蛋白与棉铃虫肠上皮细胞的受体蛋白ABCC2结合可导致细胞膜穿孔，造成棉铃虫死亡。研究发现蛋白GATAd和蛋白GATAe调控肠上皮细胞ABCC2基因的表达。回答下列问题： (1)Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于细胞坏死，其原因是___________________________。 (2)科研人员向棉铃虫幼虫注射dsGATAe以抑制GATAe基因的表达。注射dsGATAe后，再饲喂Bt毒蛋白，棉铃虫死亡率_________（填“上升”或“下降”），请结合图1从“基因表达—受体数量—Bt作用效果”三个层次分析其原因：____________________________________。 (3)科研人员利用同源重组构建含相关基因的重组质粒（如图2）。图2中PCR1的引物F1-F序列应含有目的基因和_________的部分序列，其目的是___________________________。 (4)为探究蛋白GATAe和蛋白GATAd对ABCC2基因表达调控的关系，科研人员将一定量的GATAe蛋白与不同浓度GATAd蛋白混合，再加入ABCC2基因启动子核心序列探针，反应后进行电泳，结果如图3. 根据图3推测GATAd与GATAe对ABCC2基因启动子的调控关系是__________________。 (5)请根据上述材料，从基因表达调控角度提出一种提高Bt毒蛋白杀虫效果的思路_______________________________________________________________________________。 【答案】(1)Bt毒蛋白与肠上皮细胞的受体蛋白结合，导致细胞膜穿孔，破坏了细胞膜的完整性，细胞结构受损并死亡。 (2) 下降 GATAe基因表达下降，导致ABCC2受体减少，Bt毒蛋白与靶细胞结合减少，膜穿孔减少，因此棉铃虫死亡率下降。 (3) 引物F2-F（质粒） 保证目的基因和线性化质粒的正向连接 (4)GATAd与GATAe对ABCC2基因启动子的调控存在竞争关系，且GATAd抑制GATAe对ABCC2基因表达的促进作用。 (5)抑制GATAd基因的表达（敲除GATAd基因，降低GATAd的表达水平）；过表达GATAe基因；过表达ABCC2基因。 【知识点】基因表达的调控过程、基因表达载体的构建、验证性实验与探究性实验、细胞坏死 【详解】（1）细胞坏死是外界不利因素直接破坏细胞结构引发的被动死亡，区别于基因调控的细胞凋亡。Bt 毒蛋白结合细胞膜上ABCC2受体后，会在膜上形成孔洞，细胞膜选择透过性、完整结构被破坏，细胞渗透压失衡、内容物外泄，细胞直接受损死亡，属于典型外界损伤导致的细胞坏死。 （2）基因表达层面：dsGATAe 抑制GATAe基因转录 / 翻译，GATAe基因表达量下降； 受体数量层面：GATAe促进ABCC2基因表达，该基因表达减少，肠细胞膜上ABCC2受体蛋白合成减少； Bt 毒蛋白作用层面：Bt毒蛋白需要结合ABCC2才能穿孔杀伤细胞，受体变少，毒蛋白结合量大幅降低，细胞膜穿孔损伤减弱，Bt毒蛋白杀虫能力下降，棉铃虫死亡率下降。 （3）同源重组依靠两段DNA相同同源序列实现拼接；PCR1扩增目的基因两端添加质粒同源序列（引物F1-F含质粒F2-F同源片段）；PCR2扩增质粒，两端带上目的基因同源序列；线性化质粒与目的基因两端拥有互补同源序列，重组时只能定向配对，避免目的基因反向插入、质粒自连，实现正向连接。 （4）分析电泳结果：①只加入GATAe时，会出现大量GATAe+探针复合物，说明GATAe可结合ABCC2启动子，促进基因表达；②只加入GATAd时，会出现GATAd+探针复合物，GATAd也能结合同一段启动子探针；③GATAe+梯度GATAd：随GATAd浓度升高，GATAe-探针条带逐渐变浅，GATAd-探针条带加深；说明二者竞争结合ABCC2启动子，GATAd抢占结合位点，阻碍 GATAe结合启动子，抑制GATAe的激活作用。 （5）答题思路（任选一条即可）。①抑制GATAd基因的表达（敲除 / RNA干扰GATAd）：减少 GATAd蛋白，解除其对GATAe的竞争抑制，GATAe更多结合ABCC2启动子，受体ABCC2合成增多；②过表达GATAe基因：提升GATAe蛋白含量，增强ABCC2基因转录，细胞膜受体数量上升；③直接过表达ABCC2基因：直接增加棉铃虫肠道Bt受体，提升Bt毒蛋白结合效率，增强杀虫效果。 4．科研人员对肠道益生菌进行改造，构建了血红素（指示出血信号）诱导的基因回路，成功开发了对肠道出血灵敏响应的工程菌。原理如图1所示，其中→表示促进或转化，⊣表示抑制。 (1)从下列Ⅰ～Ⅳ中选择合适的编号填入图2，以表示工程菌响应肠道出血的机制①_____；②_____；③_____（编号选填）。 ①血红素跨膜进入细胞内 ②P1启动ChuA基因表达 ③血红素与HrtR蛋白结合，关闭转录放大器 ④血红素与HrtR蛋白结合，开启转录放大器 (2)为提升工程菌响应出血信号的灵敏度，科研人员用4种启动HrtR基因表达能力有差异的启动子替换P2，用3种与HrtR蛋白亲和性不同的启动子替换P3，任意组合并整合到工程菌中，筛选性能更优的组合。理论上需研究的组合共有_____（单选）。 A．7种 B．9种 C．12种 D．20种 (3)据以上信息推测，性能最优的工程菌应具备的特征是_____（单选）（注：•多少代表绿色荧光蛋白浓度，折线箭头粗细表示基因表达效率高低）。 A． B． C． D． 藤壶黏附蛋白CP43K具有很强的黏附性能。科研人员构建了血液诱导型工程菌H，智能化表达CP43K以制备生物活体胶水，用于响应肠道出血并治疗溃疡性结肠炎。 (4)根据研究目标，在构建工程菌H时，最佳方案是用藤壶黏附蛋白基因CP43K替换图1中的_____（单选）。 A．ChuA B．HrtR C．Ecf11 D．GFP (5)为确定基因CP43K已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图3中的一对引物_____对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为_____bp。 (6)科研人员将小鼠活性肠组织块放置于含有工程菌H的培养基中，孵育2天后，检测活体胶水的性能。下列相关说法，正确的是_____（多选）。 A．肠组织块需无菌处理 B．培养基中需含大量氮源 C．培养基中需添加琼脂 D．培养基中需添加血红素 已知质粒丢失会导致工程菌的性能不稳定。将工程菌H植入溃疡性结肠炎模型鼠肠道后，采集粪便样品，分别接种到含卡那霉素的培养基A、含卡那霉素和氯霉素的培养基B中，统计菌落数（CFU）。CFU(A)表示培养基A中的菌落数，不考虑其他微生物。 (7)实验中所采用的接种方法是_____（①平板划线法/②稀释平板涂布法）。若CFU（A）/CFU（B）比值越低，说明工程菌H的性能稳定性_____（①越高/②越低/③无法确定）（编号选填）。 (8)结合题意和已学知识，评价工程菌H在性能稳定性和生态安全性方面的不足，并提出进一步优化的建议_____。 【答案】(1) ② ① ④ (2)D (3)A (4)D (5) 1和3 1178 (6)ABD (7) ② ① (8) 不足：目的基因位于质粒上，质粒容易丢失，导致工程菌丢失目的基因，CP43K表达能力下降，性状不稳定；工程菌可能逃逸到自 然环境中，目的基因可能通过水平转移扩散到其他微生物，引发生态安全风险 优化建议：将CP43K基因整合到工程菌的拟核（基因组）DNA中，避免质粒丢失，提升稳定性；在工程菌中引I入条件致死“自杀开 关”，使工程菌离开肠道特定环境后会启动凋亡，避免工程菌扩散；或改造工程菌为营养缺陷型，使其只能在肠道特定条件下存活， 防止逃逸 【知识点】微生物的接种方法、PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、转基因生物安全性 【详解】（1）根据题图原理，P1启动ChuA基因表达，ChuA（血红素转运蛋白）转移到细胞膜上，协助血红素进入工程菌，肠道出血后，进入细胞的血红素与HrtR蛋白结合，解除HrtR对转录放大器的抑制，开启转录放大器；转录放大器开启后，形成正反馈放大信号，最终激活GFP表达。 （2）根据乘法原理，4种启动HrtR基因表达能力有差异的启动子+P2启动子=5种，3种与HrtR蛋白亲和性不同的启动子+P3启动子=4种，总组合数是5×4=20种。 （3）转录放大器应在血红素的作用下，合成的HrtR蛋白应较少，减少对转录放大器的抑制，进而使GFP大量表达，故选A。 （4）原基因回路中，出血信号诱导激活后，GFP（报告基因）表达；现在需要出血信号诱导激活后表达藤壶黏附蛋白CP43K，因此替换GFP基因即可。 （5）PCR扩增需要两个引物延伸方向相向，才能扩增出目的片段；若CP43K插入方向正确，引物1和2（下游，结合下链，向右延伸）分别和引物3（上游，结合上链，向左延伸）可以扩增出目的片段，扩增产物长度分别是CP43K本身的长度978bp+200bp=1178bp（引物1和引物3组合），978bp（引物2和引物3组合）；插入方向错误时引物1和引物3无法扩增出产物，但引物2和引物3仍然可以扩增出片段978bp，因此可以选择引物1和引物3验证插入方向和连接是否成功。 （6）A、孵育实验需要避免杂菌污染，因此肠组织块需要无菌处理，A正确； B、工程菌生长、CP43K（蛋白质）合成都需要大量氮源，培养基需要充足氮源，B正确； C、本实验是液体孵育，不需要添加琼脂（琼脂用于固体培养基），C错误； D、CP43K由血红素诱导表达，因此需要添加血红素诱导，才能检测胶水性能，D正确。 （7）统计菌落数需要使用稀释平板涂布法（平板划线法不能用于计数）；卡那霉素抗性基因KanR在拟核DNA，氯霉素抗性基因CmR在质粒，因此所有工程菌都能在培养基A（卡那霉素）生长，只有质粒未丢失的工程菌能在培养基B（卡那+氯霉素）生长。CFUA/CFUB比值越低，说明质粒丢失的个体越少，因此工程菌H的性能稳定性越高。 （8）不足： ① 性能稳定性：目的基因位于质粒上，质粒容易丢失，导致工程菌丢失目的基因，CP43K表达能力下降，性状不稳定。 ② 生态安全性：工程菌可能逃逸到自然环境中，目的基因可能通过水平转移扩散到其他微生物，引发生态安全风险。 优化建议： ① 稳定性优化：将CP43K基因整合到工程菌的拟核（基因组）DNA中，避免质粒丢失，提升稳定性。 ② 安全性优化：在工程菌中引入条件致死“自杀开关”，使工程菌离开肠道特定环境后会启动凋亡，避免工程菌扩散；或改造工程菌为营养缺陷型，使其只能在肠道特定条件下存活，防止逃逸。 5．改造大肠杆菌 高丝氨酸具有广泛的工业用途。科研人员通过如下路径（Ⅰ和Ⅱ）构建了高产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌： Ⅰ：前期研究表明，大肠杆菌thrB基因编码的高丝氨酸激酶（ThrB）会催化高丝氨酸的进一步代谢，不利于其积累。据此，科研人员对thrB基因进行定点突变（图1）。 (1)基于技术考虑，研究人员首先将thrB基因编码链上第865位的胞嘧啶C转换为U。据所学知识分析，欲获得稳定遗传的突变DNA，至少需经历的复制轮数为________；此时突变株表达的ThrB的氨基酸数目为________个。 (2)为检测大肠杆菌突变株的菌群数量，下列操作正确的是________。（单选） A．稀释涂布平板进行活细胞计数 B．平板划线法分离大肠杆菌单菌落 C．分光光度计直接测定大肠杆菌数目 D．逐个计数来测定大肠杆菌细胞数目 Ⅱ：前期研究发现，高丝氨酸会抑制ThrA酶的活性，且还能经转运蛋白（RhtB）转运至胞外（如图2所示）。据此，科研人员将thrA*和RhtB联合导入大肠杆菌。 (3)据图2分析，若想进一步提高大肠杆菌高丝氨酸产量，可采取的策略包括_______。（多选） A．适当降低培养液的pH B．增强ThrA对高丝氨酸的亲和力 C．采用蛋白质工程技术改造thrA基因 D．敲除thrA基因以解除产物的反馈抑制 (4)图3中的thrA*为thrA的突变基因，根据题意判断，该突变基因表达的酶，最可能的性能是________。（单选）（　　） A．耐受温度提升 B．单分子酶活提高 C．酶分泌量增多 D．与高丝氨酸的亲和力降低 (5)研究人员还通过在大肠杆菌中高效表达RhtB增加高丝氨酸的产量。为了将目的基因正确插入载体（图3），切割PCR产物选用的限制酶是________（编号选填）；切割载体时应选用的限制酶是________。（编号选填） (6)基因工程菌构建后，需要用M9通用培养基摇瓶培养（即放在锥形瓶中震荡培养），以评估菌株的基本合成能力；然后再采用TY培养基大规模发酵生产目标产物。下列说法合理的是________。（编号选填） M9通用培养基（/L）：Na2HPO4 13.6g、KH2PO4 6g、NaCl 1g、NH4Cl 2g、葡萄糖4g、CaCl2 0.01g、MgSO4 0.24g。 TY培养基（/L）：甘油 15g、（NH4）2SO4 17g、酵母提取物 8g、胰蛋白胨 16g、KH2PO4 1g、MgSO4 1g、甜菜碱 2g、微量元素溶液1 mL。 ①碳源差异需要考虑发酵工程的成本 ②M9是固体培养基，TY为液体培养基 ③M9是合成培养基，TY为天然培养基 ④TY培养基的唯一氮源是（NH4）2SO4 (7)研究人员将同一菌株分别在摇瓶和发酵罐内培养相同时间后，测菌体密度相对值和高丝氨酸产量，结果如下表所示。结合下表信息，说出工程化发酵条件下，菌株产能提高的依据并分析其原因________。 培养方式 菌体密度相对值 高丝氨酸产量 250mL摇瓶培养 17.0 6.1（g/L） 5L发酵罐培养 26.7 90.2（g/L） 【答案】(1) 2 288 (2)A (3)AC (4)D (5) ②③ ①③ (6)①③ (7)据表可知，从高丝氨酸和菌体密度相对值看，发酵罐内单个菌的发酵能力更强。原因，可能发酵罐内置搅拌器，有利于培养基与菌体充分接触，微生物生存条件；也可能发酵罐可以及时控制微生物代谢废物，不会影响微生物代谢。 【知识点】基因突变、培养基的类型及其应用、其他微生物的分离与计数、基因表达载体的构建 【详解】（1）初始仅一条编码链的C突变为U，另一条链仍是原G，第一次复制得到一个含U-A的杂合DNA、一个原野生型DNA；第二次复制时，U-A复制可得到双链均为突变序列（A-T）的稳定突变DNA，因此至少需要2轮复制。第865位碱基是突变后终止密码子的第一个碱基，前864个碱基共编码864÷3=288个氨基酸，终止密码子不编码氨基酸，因此突变后ThrB的氨基酸数目为288。 （2）A、稀释涂布平板法可以对活细胞进行计数，A正确； B、平板划线法只能分离单菌落，不能用于计数，B错误； C、分光光度计只能通过浑浊度估算细胞数，不能直接测定细胞数目，C错误； D、大肠杆菌个体微小，无法逐个计数，D错误。 （3）A、降低培养液pH，胞外H+浓度升高，H+顺浓度梯度的势能可驱动RhtB转运更多高丝氨酸出胞，减少胞内高丝氨酸积累，解除对ThrA的抑制，提高产量，A正确； B、增强ThrA对高丝氨酸的亲和力，会让高丝氨酸更易抑制ThrA，降低产量，B错误； C、通过蛋白质工程改造thrA基因，可以获得不被高丝氨酸抑制的ThrA变体，提高产量，C正确； D、ThrA是高丝氨酸合成必需的酶，敲除thrA无法合成高丝氨酸，D错误。 （4）原高丝氨酸会结合抑制ThrA的活性，因此突变后的thrA*表达的酶最可能是降低了与高丝氨酸的亲和力，不易被高丝氨酸抑制，保证高丝氨酸持续合成。ABC不符合题意，D符合题意。 （5）目的基因thrA*和RhtB位于PCR产物的BglⅡ（②）和EcoRⅠ（③）之间，因此用这两种酶切割PCR产物；BglⅡ和BamHⅠ切割后产生相同的黏性末端，载体上BamHⅠ靠近启动子、BglⅡ靠近终止子，用BamHⅠ（①）和EcoRⅠ（③）切割载体后，可与目的基因两端互补，实现定向插入。 （6）大规模发酵生产需要控制成本，不同碳源的成本不同，①正确；摇瓶培养和大规模发酵都用液体培养基，②错误；M9培养基成分均为明确的化学物质，属于合成培养基，TY含有酵母提取物、胰蛋白胨等天然成分，属于天然培养基，③正确；TY中酵母提取物、胰蛋白胨都含有氮，硫酸铵不是唯一氮源，④错误。 （7）据表可知，从高丝氨酸和菌体密度相对值看，发酵罐内单个菌的发酵能力更强。原因，可能发酵罐内置搅拌器，有利于培养基与菌体充分接触，改善微生物生存条件；也可能发酵罐可以及时控制微生物代谢废物，不会影响微生物代谢。因此菌体密度更高，高丝氨酸总产量显著提升。 6．研究发现，天然人胰岛素容易形成多分子聚合物，导致降糖速度受限，科研人员通过生物工程手段获得了可快速降糖的门冬胰岛素。天然人胰岛素和门冬胰岛素的结构示意图分别如图1和图2所示，单字母表示特定氨基酸。 注：部分密码子：脯氨酸（P）：5´-CCC -3´，天冬氨酸（D）：5´- GAU-3´，赖氨酸（K）：5´-AAG -3´，苏氨酸（T）： 5´- ACA-3´ (1)据图文信息和已学知识分析，两种胰岛素在结构上存在的差异有____________。（编号选填） ①氨基酸的组成②氨基酸的排列顺序③肽键的数目④蛋白质的空间结构 (2)据已学知识分析，下列过程中与门冬胰岛素能快速降糖有关的是_。 A．促进葡萄糖随尿液排出体外 B．加快与靶细胞表面的受体结合 C．增加靶细胞膜上葡萄糖转运蛋白的数量 D．促进所有细胞摄取葡萄糖并将其转变为糖原储存 (3)为实现天然人胰岛素基因的定点突变，突变引物的碱基序列应设计为_。 A． B． C． D． 科研人员构建了慢病毒表达载体，并将其转染至人脐带间充质干细胞中，使其能持续、稳定地生产并分泌门冬胰岛素，具体过程如图3所示。 注：基因为绿色荧光蛋白基因；和为不同的酶切位点；重组慢病毒是逆转录病毒 (4)据图3和题干信息分析，获得门冬胰岛素的过程中涉及的生物工程有____________。（编号选填） ①基因工程②蛋白质工程③发酵工程④细胞工程 (5)据图3分析，重组质粒P中的门冬胰岛素基因模板链的5’端包含了____________（BamI/AscI）酶的识别序列。 (6)据图3分析，下列描述正确的是_ A．过程Ⅱ需要无菌操作 B．TX细胞用于生产重组慢病毒 C．包膜蛋白质粒是重组慢病毒的部分遗传物质 D．过程I需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 为验证人脐带间充质干细胞在转染后能持续、稳定地生产并分泌胰岛素，科研人员进行了相关实验，过程如图4所示，实验结果如图5所示。 注：Mr为蛋白质的相对分子质量；人脐带间充质干细胞的胞内参照蛋白的Mr为，门冬胰岛素的Mr为 (7)据图文信息和已学知识分析，若选择图4中的____________，得到图5中的结果____________，则表示本实验成功。（编号选填） ①方法一②方法二③1  ④2  ⑤3  ⑥4 【答案】(1)①②④ (2)BC (3)B (4)①②④ (5)AscI (6)ABD (7) ① ④ 【知识点】蛋白质的结构及多样性、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、蛋白质工程原理及操作流程 【详解】（1）由图可知，天然胰岛素B链第28位的脯氨酸被替换为天冬氨酸，因此氨基酸组成、氨基酸排列顺序均发生改变；氨基酸总数和肽链数不变，因此肽键数目不变；氨基酸序列改变，且两种胰岛素聚集特性不同，说明蛋白质空间结构发生改变，因此选①②④。 （2）A、胰岛素的功能是降低血糖，不会促进葡萄糖随尿液排出，A错误； B、天然胰岛素易聚合，生物活性低，门冬胰岛素不易聚合，可更快与靶细胞表面受体结合，因此起效快，B正确； C、胰岛素发挥降糖作用的机制是增加靶细胞膜葡萄糖转运蛋白数量，促进靶细胞摄取葡萄糖，C正确； D、并非所有细胞都能将葡萄糖转变为糖原储存（如成熟红细胞不能合成糖原），“所有细胞”表述错误，D错误。 （3）该突变仅1个氨基酸改变（脯氨酸→天冬氨酸），对应DNA上1个密码子（3个碱基）改变；脯氨酸密码子前两位为CC，天冬氨酸密码子前两位为GA，对应模板链对应位置由GG变为CT，突变后引物5'→3'对应位点为TAT（对应天冬氨酸密码子GAT），因此引物序列为选项B。 （4）该过程对天然人胰岛素基因进行定点改造，获得功能改进的门冬胰岛素，属于蛋白质工程；构建重组表达载体、导入目的基因属于基因工程；培养TX包装细胞、人脐带间充质干细胞属于细胞工程；该过程没有利用微生物发酵生产产物，不涉及发酵工程，因此选①②④。 （5）由图3可知，目的基因（门冬胰岛素基因）插入在原质粒的BamI和AscI之间，门冬胰岛素基因模板链的5’端应靠近终止子，转录从启动子开始，先转录目的基因的3'端，因此门冬胰岛素基因模板链的5'端包含AscI的识别序列。 （6）A、过程Ⅱ是动物细胞培养/转染过程，必须保证无菌操作，A正确； B、TX细胞是包装细胞，导入质粒后可组装生产重组慢病毒，B正确； C、包膜蛋白质粒仅编码包膜结构蛋白，重组慢病毒的遗传物质是含目的基因的RNA，包膜蛋白质粒不是重组慢病毒的遗传物质，C错误； D、过程I是构建重组质粒，需要限制性内切核酸酶切割载体和目的基因，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，D正确。 （7）实验目的是验证干细胞能分泌胰岛素，方法一不裂解细胞，离心后上清为细胞培养液；若实验成功，干细胞将胰岛素分泌到培养液中，上清液仅存在胰岛素（相对分子质量8×103），不存在胞内参照蛋白（相对分子质量36×103），对应图5的2号泳道，因此选①（方法一）、④（结果2号泳道）。 7．常规的CAR-T细胞疗法是通过给患者自身T细胞装上嵌合抗原受体（CAR），使其能精准识别并杀死肿瘤细胞。但患者往往自身T细胞数量较少，因此自体CAR-T细胞生产周期较长且成本高昂。为解决该问题，某科研团队研发了通用型CAR-T细胞疗法，原理如图1所示，图中A-F表示相应过程。 (1)图1CAR-T细胞制作时，需利用病毒载体递送外源基因。外源基因在该病毒载体中的存在形式是______。 A．一段双链DNA片段 B．一段双链 RNA 片段 C．一段单链DNA片段 D．一段单链RNA 片段 (2)图1的病毒载体中，可能含有______。 ①衣壳蛋白基因 ②CAR 基因 ③RNA 聚合酶 ④逆转录酶 A．①②③ B．①②④ C．①③④ D．②③④ (3)过程B 获取的自体CAR-T细胞需在体外培养增殖。把该过程中的培养条件/成分与其主要功能用直线连接______。 培养条件/成分 主要功能 葡萄糖 ·· 避免细菌等微生物污染 适宜的CO2浓度 ·· 提供细胞呼吸的主要的能源物质 抗生素 ·· 促进细胞分裂 生长因子 ·· 促进细胞分化 无机盐 ·· 维持培养基pH值稳定 · 维持培养基渗透压稳定 (4)据图1及所学知识分析，过程D 获取的异体CAR-T细胞注射入肿瘤患者体内，可能出现的现象是______。 A．识别裂解患者的肿瘤细胞 B．被患者NK细胞识别裂解 C．被患者 B淋巴细胞识别裂解 D．被患者T淋巴细胞识别裂解 (5)过程E改造的通用型CAR-T细胞表面存在糖盾（致密糖基化修饰层），使其在患者体内安全发挥功能，原因可能是______。 A．通用型CAR-T细胞的关键表面抗原被掩盖 B．通用型 CAR-T细胞的嵌合抗原受体被掩盖 C．肿瘤细胞的关键表面抗原被掩盖 D．肿瘤细胞的嵌合抗原受体被掩盖 通用型CAR-T细胞“糖盾”的形成需敲除异体CAR-T细胞的S基因，S基因的作用机理（过程Ⅰ-Ⅳ）及敲除过程（过程V-Ⅶ）如图2所示。 注：sgRNA 是一种可折叠形成特定茎环结构的单链RNA，Cas9核酸酶会与sgRNA的茎环结构通过空间适配结合。 (6)S 基因的敲除过程需 Cas9 核酸酶，它需在 sgRNA 引导下发挥功能，Cas9核酸酶可以______。 A．间接识别特定 DNA 序列 B．打开磷酸二酯键 C．直接识别特定sgRNA 序列 D．打开肽键 (7)S基因被敲除后，通用型CAR-T细胞中可能增强的过程是______。 A．Ⅰ、Ⅲ B．Ⅰ、Ⅳ C．Ⅱ、Ⅲ D．Ⅲ、Ⅳ (8)据题干信息和图1、2分析，检测S基因是否被成功敲除，可检测细胞是否______。 A．存在正常S基因 B．存在正常S蛋白 C．出现“糖盾” D．出现嵌合抗原受体 (9)研究发现，通用型CAR-T细胞在一定程度上仍会引起免疫排斥。为进一步提升研究人员提出可通过蛋白质工程定向改造提升通用型CAR-T细胞内的糖基转移酶活性。据学知识分析，这种思路是否合理?为什么?_______。 【答案】(1)D (2)B (3) (4)ABD (5)A (6)AB (7)D (8)ABC (9)合理，理由是改造糖基转移酶活性可减少 “糖盾⁺”，降低 CAR-T 细胞的免疫原性，减轻免疫排斥。 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、蛋白质工程的应用及实例分析、动物细胞培养技术 【分析】基因工程的步骤：获取目的基因、构建基因表达载体、导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）由图可知，病毒载体中含有RNA，所以该病毒为RNA病毒。对于RNA病毒，其遗传物质是RNA，外源基因要通过该病毒载体递送，在病毒载体中的存在形式为一段单链RNA片段。D正确，ABC错误。 故选D。 （2）病毒载体需包含：①衣壳蛋白基因（编码病毒衣壳，保证载体结构完整）；②CAR 基因（外源目的基因，需导入细胞）；④逆转录酶（逆转录病毒的酶，用于将 RNA 逆转录为 DNA）。RNA 聚合酶（③）并非病毒载体必需成分。B正确，ACD错误。 故选B。 （3）过程B 获取的自体CAR-T细胞需在体外培养增殖，该过程需要葡萄糖提供细胞呼吸的主要能源物质，适宜的CO2浓度能维持pH值稳定，抗生素能避免细菌等微生物污染，生长因子能促进细胞分裂，无机盐能维持培养基渗透压稳定，因此连线为：。 （4）A、CAR-T细胞能识别肿瘤细胞表面的特定抗原，从而识别裂解患者的肿瘤细胞，A正确； B、异体CAR-T细胞对于肿瘤患者来说属于外来异物，患者体内的NK细胞可以识别并裂解外来异物，所以异体CAR-T细胞可能被患者NK细胞识别裂解，B正确； C、B淋巴细胞主要参与体液免疫，不具有识别裂解异体CAR-T细胞的功能，C错误； D、T淋巴细胞主要参与细胞免疫，这种经过改造的异体CAR-T细胞也能够被T淋巴细胞识别裂解，D正确。 故选ABD。 （5）免疫细胞识别外来细胞的关键是识别细胞表面的 “关键表面抗原”，糖鞘覆盖在通用型CAR-T 细胞表面，会掩盖其自身的关键表面抗原，使患者免疫系统无法识别该细胞为 “外来物”，从而让其安全发挥功能。A正确，BCD错误。 故选A。 （6）A、由题意可知，“sgRNA是一种可折叠形成特定茎环结构的单链RNA，Cas9核酸酶会与sgRNA的茎环结构通过空间适配结合”可知，Cas9核酸酶间接识别特定DNA序列，A正确； B、Cas9核酸酶的作用是打开磷酸二酯键，从而实现对DNA的切割，B正确； C、Cas9核酸酶是间接通过sgRNA识别特定DNA序列，并非直接识别特定sgRNA序列，C错误； D、Cas9核酸酶打开的是磷酸二酯键，不是肽键，D错误。 故选AB。 （7）S基因表达出的S蛋白对过程Ⅱ（糖基转移酶合成）有抑制作用，糖基转移酶对过程Ⅲ（嵌合抗原受体合成）有抑制作用。当S基因被敲除后，S蛋白不存在，那么对过程Ⅱ的抑制作用解除，会合成糖基转移酶；糖基转移酶会促进过程Ⅲ的发生，过程Ⅲ会增强，进而促进过程Ⅳ。所以S基因被敲除后，通用型CAR - T细胞中可能增强的过程是Ⅲ、Ⅳ，D正确，ABC错误。 故选D。 （8）A、检测细胞是否存在正常S基因可以判断S基因是否被成功敲除，A正确； B、S基因控制S蛋白的合成，所以检测细胞是否存在S蛋白可以判断S基因是否被成功敲除，B正确； C 、由题意可知，S基因的作用是促进 “糖盾⁺” 形成，若S基因被敲除→S蛋白减少→糖基转移酶减少→“糖盾⁺” 减少 / 消失。因此检测 “是否出现糖盾⁺” 可判断S基因是否被敲除（若未敲除，会有糖盾⁺；若敲除，糖盾⁺减少/消失），C正确； D、嵌合抗原受体的形成与 S 基因无关，不能判断判断S基因是否被成功敲除，D错误。 故选ABC。 （9）新增小题免疫排斥的原因是 “糖盾⁺”（通用型 CAR-T 的糖链）被宿主免疫系统识别；若通过蛋白质工程降低糖基转移酶活性，可减少 “糖盾⁺” 的形成，使 CAR-T 细胞的表面抗原更接近宿主细胞，从而减轻免疫排斥。因此思路合理，理由：改造糖基转移酶活性可减少 “糖盾⁺”，降低 CAR-T 细胞的免疫原性，减轻免疫排斥。 8．高产苯丙氨酸 苯丙氨酸（PHE）在工业和食品生产等领域具有多种应用价值。大肠杆菌合成PHE的相关过程及催化反应过程的关键酶如图所示，研究人员期望通过对大肠杆菌的改造获得高产菌株。 (1)在大肠杆菌细胞内，进行三羧酸循环的场所是_____。（单选） A．拟核 B．细胞质基质 C．线粒体 D．细胞质基质和线粒体 (2)为缓解大肠杆菌的负反馈调控机制对PHE产量的影响，可将编码下列酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体：_____。（编号选填） ①aroF    ②aroD    ③aroE    ④pheA    ⑤tyrA (3)为进一步提升产率，研究人员将三种调控基因表达效率不同的启动子-高、-中等、-低）分别与编码图中酶的基因（aroF、aroD、aroE、pheA）任意组合，并整合到大肠杆菌中，筛选出PHE产量更高的组合。理论上需研究的组合共有_____。（单选） A．4种 B．6种 C．12种 D．种 (4)为方便检测大肠杆菌的PHE产量，研究人员设计并在大肠杆菌中导入了“PHE传感器”，使PHE产量与传感器发出的红色荧光呈正相关。能反映上述功能的传感器示意图为_____。 （编号选填）（注：“●”多少代表PHE浓度，启动子Pmtr受PHE的调控，箭头粗、细分别表示基因表达效率高、低，代表红色荧光基因） ①      ②   ③      ④   (5)科研团队还赋予了图中编码pykF酶的基因特殊的启动子，使该基因在培养液中大肠杆菌数量快速增加时激活表达，而当大肠杆菌数量趋于稳定时则关闭，该做法的目的是_____。 (6)R基因编码的蛋白质能够调控大肠杆菌多个基因的转录，科研人员在DNA水平上对蛋白中的氨基酸进行随机诱变，经过三轮循环的诱变、筛选和检测，获得了PHE产量最高的菌株，该过程涉及的工程或技术包括_____。（编号选填） ①细胞工程    ②蛋白质工程    ③定向进化    ④循环突变 (7)综合信息，用编号与箭头将“大肠杆菌菌株制备与PHE高效生产”流程图填写完整。（编号排序） ①遗传改造    ②筛选高产菌株    ③PHE产量检测 ④基因测序验证    ⑤发酵罐发酵培养    ⑥实验室发酵培养    【答案】(1)B (2)①④⑤ (3)D (4)①③ (5)i  在大肠杆菌增殖时，该基因的表达可促进三羧酸循环，为DNA复制、细胞分裂等生命活动供应更多能量 ii  在大肠杆菌增殖减缓时关闭该基因，将更多PEP导向与PHE合成有关的反应，有利于PHE产量增加 (6)②③④ (7)→①→④→⑥→③→②→            →⑤→/→①→⑥→③→②→④→            →⑤→ 【知识点】有氧呼吸过程、基因突变、蛋白质工程原理及操作流程、蛋白质工程的应用及实例分析 【分析】原核生物中三羧酸循环发生的场所是细胞质，真核生物则是线粒体基质。在这个过程中，柠檬酸经过一系列酶促的氧化脱氢和脱羧反应生成草酰乙酸，而草酰乙酸又可与另1分子的乙酰辅酶A（乙酰-CoA）结合，生成柠檬酸，从而产生循环。整个过程总共消耗了3分子H2O，生成1分子GTP（可转换为1分子的ATP）、4对H和2分子CO2，其中H可通过后续反应产生ATP，为细胞供能。 【详解】（1）A、拟核区是控制代谢的中心，不进行三羧酸循环，A错误； B、细胞质基质是三羧酸循环的场所，B正确； CD、大肠杆菌是原核生物，无线粒体，CD错误。 故选B。 （2）结合图示可知，PHE通过抑制pheA进行负反馈调节，因此可将编码pheA酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体，这样PHE无法发挥反馈调节作用。作为PHE的前体物质PPA，含量升高时会通过TYR反馈抑制aroF 和tyrA，使得PPA含量减少，进一步使得PHE含量减少，因此可将编码aroF 和tyrA酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体。故①④⑤正确。 故选①④⑤。 （3）每种基因可以与3种不同的启动子组合，一共有四种基因，因此组合方式为3×3×3×3=34种。 故选D。 （4）“●”多少代表PHE浓度，PHE产量与传感器发出的红色荧光呈正相关，箭头粗、细分别表示基因表达效率高、低，因此“●”越多，箭头越粗，红色荧光蛋白越多，与图中①符合。“●”越少，箭头越细，红色荧光蛋白越少，与图中③符合。 故选①③。 （5）在大肠杆菌增殖时，该基因的表达可促进三羧酸循环，为DNA复制、细胞分裂等生命活动供应更多能量，因此编码pykF酶的基因特殊的启动子，使该基因在培养液中大肠杆菌数量快速增加时激活表达，而当大肠杆菌数量趋于稳定时则关闭，这样有助于维持大肠杆菌数量的稳定。或者在大肠杆菌增殖减缓时关闭该基因，将更多PEP导向与PHE合成有关的反应，有利于PHE产量增加。 （6）①该工程在基因层面上进行改造，属于基因工程的延伸，不属于细胞工程，①错误； ②在DNA水平上对R蛋白中的氨基酸进行随机诱变，生产出更好的蛋白质，因此属于蛋白质工程，②正确； ③在DNA水平上对R蛋白中的氨基酸进行随机诱变，获得了PHE产量最高的菌株，因此属于定向进化，③正确； ④经过三轮循环的诱变、筛选和检测，属于循环突变，④正确。 故选②③④。 （7）将“大肠杆菌菌株制备与PHE高效生产”需先在实验室中对大肠杆菌进行改造，然后进行测序，与原基因进行比对看是否改造成功，接下来在实验室进行发酵培养，培养后进行PHE产量检测，以筛选筛选高产菌株。优质、高产的菌株是发酵工程的前提，因此最后再进行发酵罐发酵培养。完整流程图为→①→④→⑥→③→②→ →⑤→。 测序也可以在实验室发酵培养、PHE产量检测、筛选高产菌株后进行，即→①→⑥→③→②→④→ →⑤→。 9．人原癌基因erbB2编码的p185蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，该过程中人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。科研人员利用动物细胞融合技术获得相应的鼠源单克隆抗体（如图1），以期治疗肿瘤。 (1)为获得高度均一的抗体，需要先向小鼠体内注射______。 A．erbB2基因 B．p185蛋白 C．人肿瘤细胞 D．鼠骨髓瘤细胞 (2)为获得鼠源单克隆抗体，请选择正确的操作并排序______。 ①促融②筛选③分离脾脏细胞④细胞核移植⑤克隆培养 鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员研制人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如图2。图2中引物已按照退火时与模板链结合位置画出，折线部分表示不与融合基因序列互补配对；转录时a链为编码链。     (3)根据以上信息和图1推测融合基因应包含______。 A．人抗体可变区基因 B．鼠抗体可变区基因 C．人抗体恒定区基因 D．鼠抗体恒定区基因 (4)图3为PCR扩增融合基因时的参数设定。步骤丁称为______；步骤戊应设定跳转到步骤______。 (5)为使融合基因正确连接到pBCⅠ载体，图2步骤①应选用的限制酶为______；引物I折线部分为______的识别序列。（编号选填） ①MboⅠ     ②XbaⅠ      ③ScaⅠ (6)图2步骤②常用的物理转化方法为______。加入四环素后选用发______荧光的受精卵用于后续操作。 (7)关于图2步骤③的相关叙述错误的有______。 A．步骤③含体外受精、胚胎移植等操作 B．代孕母鼠需注射激素使之超数排卵 C．代孕母鼠子宫内早期胚胎1为桑葚胚 D．对早期胚胎2进行胚胎分割，可提高转基因小鼠数量 (8)人鼠嵌合抗体的设计属于______。（编号选填） ①第二代基因工程    ②定点突变蛋白质    ③定向进化蛋白质    ④设计制造全新蛋白 (9)检测小鼠乳汁中的人鼠嵌合抗体水平，发现其含量较低，结合图2和所学知识推测可能原因______。（至少两点） 【答案】(1)B (2)③→①→②→⑤ (3)BC (4) 聚合 乙 (5) ②③ ② (6) 显微注射法 红色 (7)ABD (8)①④ (9)①山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠乳腺细胞中作用效果不理想，抗体表达量低；②融合基因表达正常，但小鼠乳腺细胞无高效的针对其运输及分泌机制：③融合基因被某些化学基团修饰，阻碍转录的发生；④融合基因正常转录，但融合基因 mRNA 因 RNA 干扰而被切割 【知识点】PCR扩增的原理与过程、蛋白质工程原理及操作流程、胚胎分割技术、基因工程的操作程序综合 【分析】PCR过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）由题干可知，人原癌基因erbB2编码的p185蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，且erbB2的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，该过程中人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体，所以可将p185蛋白注入小鼠体内，经杂交瘤技术获得相应的鼠源单克隆抗体， 以期治疗肿瘤，B正确，ACD错误。 故选B。 （2）为获得鼠源单克隆抗体，需要从鼠的脾脏中获取B淋巴细胞，而脾脏是B淋巴细胞的重要来源，所以第一步是分离脾脏细胞；接着是促融，分离出的脾脏细胞（B淋巴细胞）需要与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；然后是筛选，在细胞融合后，会得到多种细胞类型，包括未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞和融合成功的杂交瘤细胞等，筛选的目的是选择出杂交瘤细胞；再是克隆培养，筛选出的杂交瘤细胞需要进行克隆培养，以获得单克隆的杂交瘤细胞。故正确的操作顺序为③→①→②→⑤。 （3）与抗原结合的位点位于抗体可变区，且鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，因此研制人鼠嵌合抗体可将图1中的鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区组合，则融合基因应包含鼠抗体可变区基因和人抗体恒定区基因，即BC正确，AD错误。 故选BC。 （4）步骤丁的温度为72℃，是延伸过程，称为聚合。步骤乙是变性过程，是在高温条件下使DNA分子解旋的过程，故步骤戊应设定跳转到步骤乙。 （5）目的基因和运载体必须用同种限制酶进行切割，且目的基因只能用限制酶ScaⅠ和XbaⅠ进行切割（限制酶MboⅠ会破坏目的基因），所以图2步骤①应选用的限制酶为②③。因为转录时a链为编码链，且图中箭头方向为转录方向，因此引物I折线部分为XbaⅠ的识别序列，即选②。 （6）因为小鼠受精卵细胞是动物细胞，因此图2步骤②常用的物理转化方法为显微注射法。根据题意，P2为四环素诱导启动子且必须在四环素存在时才能起作用，所以需在培养液中加入四环素；重组DNA分子导入成功的细胞中含有红色荧光蛋白基因，表达后细胞会发出红色荧光，所以发出红色荧光的即为目标细胞，即加入四环素后选用发红色荧光的受精卵用于后续操作。 （7）A、步骤③是受精卵发育成早期胚胎，不含体外受精、胚胎移植等操作，A错误； B、供体需注射激素使之超数排卵，而代孕母鼠不需要，B错误； C、胚胎发育过程为受精卵→卵裂期→桑葚胚→囊胚→原肠胚，且桑葚胚为32个细胞左右的胚胎，因此代孕母鼠子宫内早期胚胎1为桑葚胚，C正确； D、胚胎分割时，一般采用发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，而早期胚胎2是原肠胚，D错误。 故选ABD。 （8）蛋白质工程（即第二代基因工程）是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。由题意可知，鼠源单克隆抗体是一种新的蛋白质，因此人鼠嵌合抗体的设计属于①④。 （9）检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法为抗原-抗体杂交技术，若检测小鼠乳汁中的人鼠嵌合抗体水平，发现其含量较低，原因可能有山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠乳腺细胞中作用效果不理想，抗体表达量低；融合基因表达正常，但小鼠乳腺细胞无高效的针对其运输及分泌机制：融合基因被某些化学基团修饰，阻碍转录的发生；融合基因正常转录，但融合基因mRNA因RNA干扰而被切割等。 10.横沙岛是上海的柑橘生产基地，柑橘果实采后贮藏期间极易受病原菌侵染而腐烂，造成重大经济损失，目前主要通过使用化学杀菌剂来控制采后病害。桔梅奇酵母是分离自柑橘果园叶片的新种酵母，可有效控制柑橘果实的腐烂，研究人员按照下图所示流程从柑橘叶片上分离得到一定浓度的桔梅奇酵母菌液，用于实验研究。 （1）图1中乙培养基比甲培养基多一种成分是________，④所使用的接种方________。 （2）实验过程中需要用高压灭菌法进行灭菌的是（　　）（多选） A．培养基 B．柑橘叶片 C．接种环 D．培养皿 研究人员以桔梅奇酵母为研究对象，制备以桔梅奇酵母为主要活性成分的液体制剂即桔梅奇酵母菌悬液，并探究其对柑橘果实采后主要病害的控制效果。 （3）从简单易操作的角度看，实验中所需病原菌如何获取？ （4）与化学杀菌剂相比，将桔梅奇酵母菌悬液应用于柑橘防腐保鲜有哪些优缺点？ 为了验证桔梅奇酵母菌悬液和活体桔梅奇酵母菌有一样的抑制柑橘果实腐烂的效果，科研人员在若干个柑橘果实中部等距离刺三个相同大小和深度的孔，并在孔内进行实验，实验过程如下表。 不同处理或测定 孔A 孔B 孔C 活病原菌 ① ② ③ 桔梅奇酵母悬液 + - ⑤ 活桔梅奇酵母菌 - + ④ 一段时间后测定 测定柑橘果实发病率 ⑥ ⑦ ⑧ （5）表中①②③分别表示________（用“+”或“-”表示），④和⑤分别表示________，（用“+”或“-”表示）。 （6）如果实验成功，则⑥⑦⑧大小比较关系是________（用编号和“=”或“>”或“<”表示）。 自然界中某些细菌可通过代谢将原油转化为稳定无害的终产物，科学家为获得能有效修复原油污染土壤的工程菌展开相关研究。 （7）获得能降解原油的目标菌可从________中取样，样品经无菌水稀释后涂布于以原油为唯一碳源的固体培养基上培养，分离纯化后获得目标菌A． 假单胞菌遭受环境压力时，会分泌大量胞外复合物将自身包裹于其中形成细菌聚集模样物（生物被膜）。目标菌A成膜性差，不能有效控制原油向深层土壤渗透。研究人员将假单胞菌的bdlA基因（约1300bp）导入目标菌A体内，尝试构建成膜性好的工程菌。 （8）假单胞菌在遭受环境压力时形成的休眠体叫做________。 A．孢子 B．芽孢 C．荚膜 D．囊泡 （9）图1为pX系列质粒构建的重组质粒模式图，为确认是否获得重组DNA分子，可选用限制酶________对重组质粒切割，并对酶切产物及重组质粒进行凝胶电泳检测，结果如图2. （10）据图2可初步判断重组质粒构建成功，依据是________。 （11）上述方法获得的两种工程菌命名为KT2和KT5，在不同时间测定实验组及对照组________的生物被膜总量相对值，结果如图3所示。 （12）请描述实验图3结果________。 【答案】（1） 琼脂 稀释涂布法 （2）AD （3）腐烂的柑橘 （4）优点：桔梅奇酵母菌悬液不会使病原菌产生抗性，且易降解，同时对人体和环境不会造成危害缺点：成本高，生产工艺复杂，生物制剂保质期短，效果稳定性不高 （5）+++ -- （6）⑥=⑦<⑧ （7）原油污染土壤 （8）B （9）Csp45I和XbaI （10）两个重组质粒酶切后分别产生5144bp、1254bp和4768bp、1254bp，说明两个重组质粒中都有长度约为1300bp的bdlA基因 （11）目标菌A （12）36hKT2和KT5的生物被膜总量显著高于原目标菌A，且KT5总量高于KT2，12h和24h三者的生物被膜总量没有显著差异 【知识点】微生物的接种方法、其他微生物的分离与计数、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）乙培养基上形成了菌落，为固体培养基，甲培养基是用来扩大培养的，因此为液体培养基，固体培养基比液体培养基中多加了琼脂。乙培养基上形成的菌落分布均匀，因此④所使用的接种方法是稀释涂布法。 （2）培养基和培养皿可采用高压灭菌法进行灭菌，而接种环采用灼烧灭菌，柑橘叶片采用消毒的方法，故AD正确。 （3）柑橘果实采后贮藏期间极易受病原菌侵染而腐烂，因此可从腐烂的柑橘中获取病原体。 （4）与化学杀菌剂相比，将桔梅奇酵母菌悬液应用于柑橘防腐保鲜的优点有：桔梅奇酵母菌悬液不会使病原菌产生抗性，且易降解，同时对人体和环境不会造成危害；缺点：成本高，生产工艺复杂，生物制剂保质期短，效果稳定性不高。 （5）本实验是为了验证桔梅奇酵母菌悬液和活体桔梅奇酵母菌有一样的抑制柑橘果实腐烂的效果，因此自变量为酵母菌悬液的种类，因变量为柑橘果实发病率，其它无关变量各组应相同且适宜，且实验中应遵循单一变量原则，故各组都应该加入活病原菌，因此①②③分别表示+++，④和⑤分别表示--。 （6）若实验成功，即桔梅奇酵母菌悬液和活体桔梅奇酵母菌有一样的抑制柑橘果实腐烂的效果，则⑥⑦组的柑橘果实发病率相同，且发病率小于对照组，即小于⑧。 （7）能降解原油的目标菌存在于原油污染土壤，因此应从原油污染土壤中获取降解原油的目标菌。 （8）假单胞菌在遭受环境压力时形成的休眠体叫做芽孢。芽孢是微生物的一种休眠结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，所以，芽孢可以帮助微生物度过恶劣的环境，B正确，ACD错误。 （9）根据目的基因（bdlA基因）插入的位置可知，用Csp45I、XbaI对重组质粒切割，可获得重组质粒中插入的目的基因，若检测结果中含有目的基因，则说明重组质粒构建成功。 （10）根据图2可知，1、2号泳道是两个质粒全长；两个重组质粒酶切后分别产生5144bp、1254bp和4768bp、1254bp，说明两个重组质粒中都有长度约为1300bp的bdlA基因，因此可初步判断重组质粒构建成功。 （11）本实验的对照组应该是导入普通质粒的目标菌A，因此将上述方法获得的两种工程菌命名为KT2和KT5，在不同时间测定实验组中工程菌及对照组中导入普通质粒的目标菌A的生物被膜总量相对值。 （12）由图3可知，实验结果表明36hKT2和KT5的生物被膜总量显著高于原目标菌 A，且KT5总量高于KT2， 12h和24h三者的生物被膜总量没有显著差异。 2 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 综合训练 生物技术与工程 姓名：___________班级：___________考号：___________ 1．白细胞表面抗原2（SLA-2）在抗原呈递、器官移植以及免疫应答方面有着重要作用。为进一步研究SLA-2的结构与功能，科研人员以能稳定传代的猪肾上皮细胞为材料，构建了稳定高表达SLA-2基因的细胞株，过程如图。其中，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Puror为嘌呤霉素抗性基因，BclⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶酶切位点，括号内数值表示距复制原点的长度。请回答下列问题。 限制酶 BclⅠ NotⅠ XbaⅠ Sau3AⅠ 识别序列及切割位点 T↓GATCA GC↓GGCCGC T↓CTAGA ↓GATC (1)为使获得的SLA-2基因与质粒1定向连接构建基因表达载体，扩增SLA-2基因时应选用的引物为______。 a．5′-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC-3′ b．5′-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC-3′ c．5′-GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC-3′ d．5′-GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC-3′ (2)过程②的大肠杆菌常用__________处理，使其易吸收重组后的质粒1，然后采用含__________的平板筛选。 (3)构建重组质粒3的目的是__________。为鉴定与验证重组质粒3，研究人员用NotⅠ和Sau3AⅠ完全酶切质粒2和重组质粒3后电泳并比较。结果如图，推测图中电泳条带X的长度为__________bp。 (4)培养的稳定高表达SLA-2基因的猪肾上皮细胞株需满足的条件有适宜的营养、温度、pH和渗透压和__________（答出2点即可）。 2．生物制造是推动我国高质量发展的重要新质生产力。2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）是一种具有改善肠道健康等功能的婴儿配方食品成分。我国科学家通过基因工程技术动态调节枯草芽孢杆菌的代谢过程，提高2'-FL的产量。回答下列问题： (1)已知futC和pfkA分别是2'-FL合成和菌体生长的关键基因（图）。研究人员构建了持续高表达futC基因的枯草芽孢杆菌并进行发酵实验，结果显示2'-FL产量较低，推测原因很可能是________________。因此，理想的合成过程为：前期两种基因的表达状态是________，待菌体数量达到一定值后两种基因的表达正好相反，从而实现2'-FL的高产。 注：枯草芽孢杆菌本身不含futC基因，需外源导入。 (2)为了实现2'-FL的高产，研究人员利用温度作为“开关”来动态调控相关代谢基因的表达，并由此构建了质粒1和质粒2（图），利用荧光蛋白基因进行功能测试。 ①构建质粒1的目的是实现基因的温控激活。在30℃时，C蛋白结合至温度诱导型启动子，使RNA聚合酶无法结合到该区域；37℃时，C蛋白失活下游基因启动表达。若在测试过程中观察到_______________，说明质粒1构建成功。 ②质粒2的CRISPRi系统中，人工设计的crRNA（一种RNA分子）可通过碱基互补配对识别靶基因，crRNA能够与红色荧光蛋白基因碱基互补配对，引导dCpfl蛋白结合并抑制靶基因转录。利用由启动子P2驱动的红色荧光蛋白基因测试质粒2的功能。图1中P1为温度诱导型启动子、P2应为_____________型启动子（温度诱导/持续表达）。若在测试过程中观察到___________，说明质粒2构建成功。 (3)在实际生产中如果想要实现高温下2'-FL的高产，需要将测试完成的质粒1和质粒2中的基因进行替换，质粒1中将绿色荧光蛋白基因替换为_____________，质粒2中将靶向红色荧光蛋白基因的crRNA基因替换成靶向_____________基因的crRNA基因。 3．Bt毒蛋白与棉铃虫肠上皮细胞的受体蛋白ABCC2结合可导致细胞膜穿孔，造成棉铃虫死亡。研究发现蛋白GATAd和蛋白GATAe调控肠上皮细胞ABCC2基因的表达。回答下列问题： (1)Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于细胞坏死，其原因是___________________________。 (2)科研人员向棉铃虫幼虫注射dsGATAe以抑制GATAe基因的表达。注射dsGATAe后，再饲喂Bt毒蛋白，棉铃虫死亡率_________（填“上升”或“下降”），请结合图1从“基因表达—受体数量—Bt作用效果”三个层次分析其原因：____________________________________。 (3)科研人员利用同源重组构建含相关基因的重组质粒（如图2）。图2中PCR1的引物F1-F序列应含有目的基因和_________的部分序列，其目的是___________________________。 (4)为探究蛋白GATAe和蛋白GATAd对ABCC2基因表达调控的关系，科研人员将一定量的GATAe蛋白与不同浓度GATAd蛋白混合，再加入ABCC2基因启动子核心序列探针，反应后进行电泳，结果如图3. 根据图3推测GATAd与GATAe对ABCC2基因启动子的调控关系是__________________。 (5)请根据上述材料，从基因表达调控角度提出一种提高Bt毒蛋白杀虫效果的思路_______________________________________________________________________________。 4．科研人员对肠道益生菌进行改造，构建了血红素（指示出血信号）诱导的基因回路，成功开发了对肠道出血灵敏响应的工程菌。原理如图1所示，其中→表示促进或转化，⊣表示抑制。 (1)从下列Ⅰ～Ⅳ中选择合适的编号填入图2，以表示工程菌响应肠道出血的机制①_____；②_____；③_____（编号选填）。 ①血红素跨膜进入细胞内 ②P1启动ChuA基因表达 ③血红素与HrtR蛋白结合，关闭转录放大器 ④血红素与HrtR蛋白结合，开启转录放大器 (2)为提升工程菌响应出血信号的灵敏度，科研人员用4种启动HrtR基因表达能力有差异的启动子替换P2，用3种与HrtR蛋白亲和性不同的启动子替换P3，任意组合并整合到工程菌中，筛选性能更优的组合。理论上需研究的组合共有_____（单选）。 A．7种 B．9种 C．12种 D．20种 (3)据以上信息推测，性能最优的工程菌应具备的特征是_____（单选）（注：•多少代表绿色荧光蛋白浓度，折线箭头粗细表示基因表达效率高低）。 A． B． C． D． 藤壶黏附蛋白CP43K具有很强的黏附性能。科研人员构建了血液诱导型工程菌H，智能化表达CP43K以制备生物活体胶水，用于响应肠道出血并治疗溃疡性结肠炎。 (4)根据研究目标，在构建工程菌H时，最佳方案是用藤壶黏附蛋白基因CP43K替换图1中的_____（单选）。 A．ChuA B．HrtR C．Ecf11 D．GFP (5)为确定基因CP43K已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图3中的一对引物_____对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为_____bp。 (6)科研人员将小鼠活性肠组织块放置于含有工程菌H的培养基中，孵育2天后，检测活体胶水的性能。下列相关说法，正确的是_____（多选）。 A．肠组织块需无菌处理 B．培养基中需含大量氮源 C．培养基中需添加琼脂 D．培养基中需添加血红素 已知质粒丢失会导致工程菌的性能不稳定。将工程菌H植入溃疡性结肠炎模型鼠肠道后，采集粪便样品，分别接种到含卡那霉素的培养基A、含卡那霉素和氯霉素的培养基B中，统计菌落数（CFU）。CFU(A)表示培养基A中的菌落数，不考虑其他微生物。 (7)实验中所采用的接种方法是_____（①平板划线法/②稀释平板涂布法）。若CFU（A）/CFU（B）比值越低，说明工程菌H的性能稳定性_____（①越高/②越低/③无法确定）（编号选填）。 (8)结合题意和已学知识，评价工程菌H在性能稳定性和生态安全性方面的不足，并提出进一步优化的建议_____。 5．改造大肠杆菌 高丝氨酸具有广泛的工业用途。科研人员通过如下路径（Ⅰ和Ⅱ）构建了高产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌： Ⅰ：前期研究表明，大肠杆菌thrB基因编码的高丝氨酸激酶（ThrB）会催化高丝氨酸的进一步代谢，不利于其积累。据此，科研人员对thrB基因进行定点突变（图1）。 (1)基于技术考虑，研究人员首先将thrB基因编码链上第865位的胞嘧啶C转换为U。据所学知识分析，欲获得稳定遗传的突变DNA，至少需经历的复制轮数为________；此时突变株表达的ThrB的氨基酸数目为________个。 (2)为检测大肠杆菌突变株的菌群数量，下列操作正确的是________。（单选） A．稀释涂布平板进行活细胞计数 B．平板划线法分离大肠杆菌单菌落 C．分光光度计直接测定大肠杆菌数目 D．逐个计数来测定大肠杆菌细胞数目 Ⅱ：前期研究发现，高丝氨酸会抑制ThrA酶的活性，且还能经转运蛋白（RhtB）转运至胞外（如图2所示）。据此，科研人员将thrA*和RhtB联合导入大肠杆菌。 (3)据图2分析，若想进一步提高大肠杆菌高丝氨酸产量，可采取的策略包括_______。（多选） A．适当降低培养液的pH B．增强ThrA对高丝氨酸的亲和力 C．采用蛋白质工程技术改造thrA基因 D．敲除thrA基因以解除产物的反馈抑制 (4)图3中的thrA*为thrA的突变基因，根据题意判断，该突变基因表达的酶，最可能的性能是________。（单选）（　　） A．耐受温度提升 B．单分子酶活提高 C．酶分泌量增多 D．与高丝氨酸的亲和力降低 (5)研究人员还通过在大肠杆菌中高效表达RhtB增加高丝氨酸的产量。为了将目的基因正确插入载体（图3），切割PCR产物选用的限制酶是________（编号选填）；切割载体时应选用的限制酶是________。（编号选填） (6)基因工程菌构建后，需要用M9通用培养基摇瓶培养（即放在锥形瓶中震荡培养），以评估菌株的基本合成能力；然后再采用TY培养基大规模发酵生产目标产物。下列说法合理的是________。（编号选填） M9通用培养基（/L）：Na2HPO4 13.6g、KH2PO4 6g、NaCl 1g、NH4Cl 2g、葡萄糖4g、CaCl2 0.01g、MgSO4 0.24g。 TY培养基（/L）：甘油 15g、（NH4）2SO4 17g、酵母提取物 8g、胰蛋白胨 16g、KH2PO4 1g、MgSO4 1g、甜菜碱 2g、微量元素溶液1 mL。 ①碳源差异需要考虑发酵工程的成本 ②M9是固体培养基，TY为液体培养基 ③M9是合成培养基，TY为天然培养基 ④TY培养基的唯一氮源是（NH4）2SO4 (7)研究人员将同一菌株分别在摇瓶和发酵罐内培养相同时间后，测菌体密度相对值和高丝氨酸产量，结果如下表所示。结合下表信息，说出工程化发酵条件下，菌株产能提高的依据并分析其原因________。 培养方式 菌体密度相对值 高丝氨酸产量 250mL摇瓶培养 17.0 6.1（g/L） 5L发酵罐培养 26.7 90.2（g/L） 6．研究发现，天然人胰岛素容易形成多分子聚合物，导致降糖速度受限，科研人员通过生物工程手段获得了可快速降糖的门冬胰岛素。天然人胰岛素和门冬胰岛素的结构示意图分别如图1和图2所示，单字母表示特定氨基酸。 注：部分密码子：脯氨酸（P）：5´-CCC -3´，天冬氨酸（D）：5´- GAU-3´，赖氨酸（K）：5´-AAG -3´，苏氨酸（T）： 5´- ACA-3´ (1)据图文信息和已学知识分析，两种胰岛素在结构上存在的差异有____________。（编号选填） ①氨基酸的组成②氨基酸的排列顺序③肽键的数目④蛋白质的空间结构 (2)据已学知识分析，下列过程中与门冬胰岛素能快速降糖有关的是_。 A．促进葡萄糖随尿液排出体外 B．加快与靶细胞表面的受体结合 C．增加靶细胞膜上葡萄糖转运蛋白的数量 D．促进所有细胞摄取葡萄糖并将其转变为糖原储存 (3)为实现天然人胰岛素基因的定点突变，突变引物的碱基序列应设计为_。 A． B． C． D． 科研人员构建了慢病毒表达载体，并将其转染至人脐带间充质干细胞中，使其能持续、稳定地生产并分泌门冬胰岛素，具体过程如图3所示。 注：基因为绿色荧光蛋白基因；和为不同的酶切位点；重组慢病毒是逆转录病毒 (4)据图3和题干信息分析，获得门冬胰岛素的过程中涉及的生物工程有____________。（编号选填） ①基因工程②蛋白质工程③发酵工程④细胞工程 (5)据图3分析，重组质粒P中的门冬胰岛素基因模板链的5’端包含了____________（BamI/AscI）酶的识别序列。 (6)据图3分析，下列描述正确的是_ A．过程Ⅱ需要无菌操作 B．TX细胞用于生产重组慢病毒 C．包膜蛋白质粒是重组慢病毒的部分遗传物质 D．过程I需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 为验证人脐带间充质干细胞在转染后能持续、稳定地生产并分泌胰岛素，科研人员进行了相关实验，过程如图4所示，实验结果如图5所示。 注：Mr为蛋白质的相对分子质量；人脐带间充质干细胞的胞内参照蛋白的Mr为，门冬胰岛素的Mr为 (7)据图文信息和已学知识分析，若选择图4中的____________，得到图5中的结果____________，则表示本实验成功。（编号选填） ①方法一②方法二③1  ④2  ⑤3  ⑥4 7．常规的CAR-T细胞疗法是通过给患者自身T细胞装上嵌合抗原受体（CAR），使其能精准识别并杀死肿瘤细胞。但患者往往自身T细胞数量较少，因此自体CAR-T细胞生产周期较长且成本高昂。为解决该问题，某科研团队研发了通用型CAR-T细胞疗法，原理如图1所示，图中A-F表示相应过程。 (1)图1CAR-T细胞制作时，需利用病毒载体递送外源基因。外源基因在该病毒载体中的存在形式是______。 A．一段双链DNA片段 B．一段双链 RNA 片段 C．一段单链DNA片段 D．一段单链RNA 片段 (2)图1的病毒载体中，可能含有______。 ①衣壳蛋白基因 ②CAR 基因 ③RNA 聚合酶 ④逆转录酶 A．①②③ B．①②④ C．①③④ D．②③④ (3)过程B 获取的自体CAR-T细胞需在体外培养增殖。把该过程中的培养条件/成分与其主要功能用直线连接______。 培养条件/成分 主要功能 葡萄糖 ·· 避免细菌等微生物污染 适宜的CO2浓度 ·· 提供细胞呼吸的主要的能源物质 抗生素 ·· 促进细胞分裂 生长因子 ·· 促进细胞分化 无机盐 ·· 维持培养基pH值稳定 · 维持培养基渗透压稳定 (4)据图1及所学知识分析，过程D 获取的异体CAR-T细胞注射入肿瘤患者体内，可能出现的现象是______。 A．识别裂解患者的肿瘤细胞 B．被患者NK细胞识别裂解 C．被患者 B淋巴细胞识别裂解 D．被患者T淋巴细胞识别裂解 (5)过程E改造的通用型CAR-T细胞表面存在糖盾（致密糖基化修饰层），使其在患者体内安全发挥功能，原因可能是______。 A．通用型CAR-T细胞的关键表面抗原被掩盖 B．通用型 CAR-T细胞的嵌合抗原受体被掩盖 C．肿瘤细胞的关键表面抗原被掩盖 D．肿瘤细胞的嵌合抗原受体被掩盖 通用型CAR-T细胞“糖盾”的形成需敲除异体CAR-T细胞的S基因，S基因的作用机理（过程Ⅰ-Ⅳ）及敲除过程（过程V-Ⅶ）如图2所示。 注：sgRNA 是一种可折叠形成特定茎环结构的单链RNA，Cas9核酸酶会与sgRNA的茎环结构通过空间适配结合。 (6)S 基因的敲除过程需 Cas9 核酸酶，它需在 sgRNA 引导下发挥功能，Cas9核酸酶可以______。 A．间接识别特定 DNA 序列 B．打开磷酸二酯键 C．直接识别特定sgRNA 序列 D．打开肽键 (7)S基因被敲除后，通用型CAR-T细胞中可能增强的过程是______。 A．Ⅰ、Ⅲ B．Ⅰ、Ⅳ C．Ⅱ、Ⅲ D．Ⅲ、Ⅳ (8)据题干信息和图1、2分析，检测S基因是否被成功敲除，可检测细胞是否______。 A．存在正常S基因 B．存在正常S蛋白 C．出现“糖盾” D．出现嵌合抗原受体 (9)研究发现，通用型CAR-T细胞在一定程度上仍会引起免疫排斥。为进一步提升研究人员提出可通过蛋白质工程定向改造提升通用型CAR-T细胞内的糖基转移酶活性。据学知识分析，这种思路是否合理?为什么?_______。 8．高产苯丙氨酸 苯丙氨酸（PHE）在工业和食品生产等领域具有多种应用价值。大肠杆菌合成PHE的相关过程及催化反应过程的关键酶如图所示，研究人员期望通过对大肠杆菌的改造获得高产菌株。 (1)在大肠杆菌细胞内，进行三羧酸循环的场所是_____。（单选） A．拟核 B．细胞质基质 C．线粒体 D．细胞质基质和线粒体 (2)为缓解大肠杆菌的负反馈调控机制对PHE产量的影响，可将编码下列酶的基因替换为有“反馈抗性”的变异体：_____。（编号选填） ①aroF    ②aroD    ③aroE    ④pheA    ⑤tyrA (3)为进一步提升产率，研究人员将三种调控基因表达效率不同的启动子-高、-中等、-低）分别与编码图中酶的基因（aroF、aroD、aroE、pheA）任意组合，并整合到大肠杆菌中，筛选出PHE产量更高的组合。理论上需研究的组合共有_____。（单选） A．4种 B．6种 C．12种 D．种 (4)为方便检测大肠杆菌的PHE产量，研究人员设计并在大肠杆菌中导入了“PHE传感器”，使PHE产量与传感器发出的红色荧光呈正相关。能反映上述功能的传感器示意图为_____。 （编号选填）（注：“●”多少代表PHE浓度，启动子Pmtr受PHE的调控，箭头粗、细分别表示基因表达效率高、低，代表红色荧光基因） ①      ②   ③      ④   (5)科研团队还赋予了图中编码pykF酶的基因特殊的启动子，使该基因在培养液中大肠杆菌数量快速增加时激活表达，而当大肠杆菌数量趋于稳定时则关闭，该做法的目的是_____。 (6)R基因编码的蛋白质能够调控大肠杆菌多个基因的转录，科研人员在DNA水平上对蛋白中的氨基酸进行随机诱变，经过三轮循环的诱变、筛选和检测，获得了PHE产量最高的菌株，该过程涉及的工程或技术包括_____。（编号选填） ①细胞工程    ②蛋白质工程    ③定向进化    ④循环突变 (7)综合信息，用编号与箭头将“大肠杆菌菌株制备与PHE高效生产”流程图填写完整。（编号排序） ①遗传改造    ②筛选高产菌株    ③PHE产量检测 ④基因测序验证    ⑤发酵罐发酵培养    ⑥实验室发酵培养          9．人原癌基因erbB2编码的p185蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，该过程中人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。科研人员利用动物细胞融合技术获得相应的鼠源单克隆抗体（如图1），以期治疗肿瘤。 (1)为获得高度均一的抗体，需要先向小鼠体内注射______。 A．erbB2基因 B．p185蛋白 C．人肿瘤细胞 D．鼠骨髓瘤细胞 (2)为获得鼠源单克隆抗体，请选择正确的操作并排序______。 ①促融②筛选③分离脾脏细胞④细胞核移植⑤克隆培养 鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员研制人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如图2。图2中引物已按照退火时与模板链结合位置画出，折线部分表示不与融合基因序列互补配对；转录时a链为编码链。     (3)根据以上信息和图1推测融合基因应包含______。 A．人抗体可变区基因 B．鼠抗体可变区基因 C．人抗体恒定区基因 D．鼠抗体恒定区基因 (4)图3为PCR扩增融合基因时的参数设定。步骤丁称为______；步骤戊应设定跳转到步骤______。 (5)为使融合基因正确连接到pBCⅠ载体，图2步骤①应选用的限制酶为______；引物I折线部分为______的识别序列。（编号选填） ①MboⅠ     ②XbaⅠ      ③ScaⅠ (6)图2步骤②常用的物理转化方法为______。加入四环素后选用发______荧光的受精卵用于后续操作。 (7)关于图2步骤③的相关叙述错误的有______。 A．步骤③含体外受精、胚胎移植等操作 B．代孕母鼠需注射激素使之超数排卵 C．代孕母鼠子宫内早期胚胎1为桑葚胚 D．对早期胚胎2进行胚胎分割，可提高转基因小鼠数量 (8)人鼠嵌合抗体的设计属于______。（编号选填） ①第二代基因工程    ②定点突变蛋白质    ③定向进化蛋白质    ④设计制造全新蛋白 (9)检测小鼠乳汁中的人鼠嵌合抗体水平，发现其含量较低，结合图2和所学知识推测可能原因______。（至少两点） 10.横沙岛是上海的柑橘生产基地，柑橘果实采后贮藏期间极易受病原菌侵染而腐烂，造成重大经济损失，目前主要通过使用化学杀菌剂来控制采后病害。桔梅奇酵母是分离自柑橘果园叶片的新种酵母，可有效控制柑橘果实的腐烂，研究人员按照下图所示流程从柑橘叶片上分离得到一定浓度的桔梅奇酵母菌液，用于实验研究。 （1）图1中乙培养基比甲培养基多一种成分是________，④所使用的接种方________。 （2）实验过程中需要用高压灭菌法进行灭菌的是（　　）（多选） A．培养基 B．柑橘叶片 C．接种环 D．培养皿 研究人员以桔梅奇酵母为研究对象，制备以桔梅奇酵母为主要活性成分的液体制剂即桔梅奇酵母菌悬液，并探究其对柑橘果实采后主要病害的控制效果。 （3）从简单易操作的角度看，实验中所需病原菌如何获取？ （4）与化学杀菌剂相比，将桔梅奇酵母菌悬液应用于柑橘防腐保鲜有哪些优缺点？ 为了验证桔梅奇酵母菌悬液和活体桔梅奇酵母菌有一样的抑制柑橘果实腐烂的效果，科研人员在若干个柑橘果实中部等距离刺三个相同大小和深度的孔，并在孔内进行实验，实验过程如下表。 不同处理或测定 孔A 孔B 孔C 活病原菌 ① ② ③ 桔梅奇酵母悬液 + - ⑤ 活桔梅奇酵母菌 - + ④ 一段时间后测定 测定柑橘果实发病率 ⑥ ⑦ ⑧ （5）表中①②③分别表示________（用“+”或“-”表示），④和⑤分别表示________，（用“+”或“-”表示）。 （6）如果实验成功，则⑥⑦⑧大小比较关系是________（用编号和“=”或“>”或“<”表示）。 自然界中某些细菌可通过代谢将原油转化为稳定无害的终产物，科学家为获得能有效修复原油污染土壤的工程菌展开相关研究。 （7）获得能降解原油的目标菌可从________中取样，样品经无菌水稀释后涂布于以原油为唯一碳源的固体培养基上培养，分离纯化后获得目标菌A． 假单胞菌遭受环境压力时，会分泌大量胞外复合物将自身包裹于其中形成细菌聚集模样物（生物被膜）。目标菌A成膜性差，不能有效控制原油向深层土壤渗透。研究人员将假单胞菌的bdlA基因（约1300bp）导入目标菌A体内，尝试构建成膜性好的工程菌。 （8）假单胞菌在遭受环境压力时形成的休眠体叫做________。 A．孢子 B．芽孢 C．荚膜 D．囊泡 （9）图1为pX系列质粒构建的重组质粒模式图，为确认是否获得重组DNA分子，可选用限制酶________对重组质粒切割，并对酶切产物及重组质粒进行凝胶电泳检测，结果如图2. （10）据图2可初步判断重组质粒构建成功，依据是________。 （11）上述方法获得的两种工程菌命名为KT2和KT5，在不同时间测定实验组及对照组________的生物被膜总量相对值，结果如图3所示。 （12）请描述实验图3结果________。 2 / 学科网（北京）股份有限公司 $